KR101762687B1 - 아르스로박터 아길리스 유래 저온활성 α-아밀라아제 및 그 제조방법 - Google Patents

아르스로박터 아길리스 유래 저온활성 α-아밀라아제 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) 유래 저온활성 α-아밀라아제 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 확보한 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 저온활성 α-아밀라아제(amylase)는 고온의 전처리 과정과 고온 반응으로 인해 야기되는 부반응 문제를 해결함으로써, 식품산업, 약학 및 생물 산업 등에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

아르스로박터 아길리스 유래 저온활성 α-아밀라아제 및 그 제조방법{Cold-adaptive α-amylase from Arthrobacter agilis and preparation method thereof}
본 발명은 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) 유래 저온활성 α-아밀라아제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
α-아밀라아제(α-amylase)는 전분 등 탄수화물의 α-1,4 글루코시딕 결합(glucosidic bond)을 무작위로 가수분해(hydrolysis)하여 말토트리오스(maltotriose), 말토오스(maltose)와 포도당(glucose)을 만들어 내는 역할을 한다.
α-아밀라아제는 산업용 효소 중 약 25%를 차지할 정도로 중요한 효소로 제빵, 제지, 세제 및 섬유 등 전분 산업에서 뿐만 아니라, 식품, 약학 및 생물학적 환경 정화 등의 생명과학 분야에서 활용되고 있다. 일반적인 α-아밀라아제는 고온에서 바람직하지 않은 부반응이 많이 일어나는데, 저온에서 활성을 나타내는 α-아밀라아제는 열의 부수적인 공급이 필요치 않아 에너지 절약이 가능하고, 상온에서 전분을 액화할 수 있으며, 또한 낮은 온도에서 얼룩을 효과적으로 제거할 수 있어 주목 받고 있는 효소이다.
근래 들어 수도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 할로바실러스(Halobacillus) sp. 및 노카르디옵시스(Nocardiopsis) sp. 등으로부터 유래한 저온 활성 α-아밀라아제가 보고되었다. 그러나 최근 분리된 저온 활성 균주 수도알테로모나스 아크티카(Pseudoalteromonas arctica) GS230를 포함하여 상기 균주들의 경우, 저온 활성 α-아밀라아제의 생산 수율이 극히 낮은 단점을 가지고 있다.
따라서, 상기와 같은 경제성 문제를 해결하기 위해 원핵생물 등을 이용하여 고수율로 저온 활성 α-아밀라아제를 생산할 수 있는 방법의 필요성이 절실한 상황이다.
Bradford M, Anal Biochem, 72, 248-254, 1976. Bernfeld, Meth. Enzymology, 1, 149-158,1955.
상기와 같은 문제의 해결을 위하여 본 발명에서는 저온 활성 균주인 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis)로부터 전체 게놈 서열을 이용하여 저온 활성을 갖는 유용한 효소를 찾고, 이 유전자를 분리하여 형질전환을 통한 발현을 통해 저온에서의 효소 활성을 확인하고자 하였다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제(amylase)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 α-아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기핵산 분자를 포함하는 α-아밀라아제 유전자가 삽입된 도 6의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pET-28a(+):PAMC27388_amyl에 관한 것이다.
본 발명을 통해 확보한 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 저온활성 α-아밀라아제는 고온의 전처리 과정과 고온 반응으로 인해 야기되는 부반응 문제를 해결함으로써, 식품산업, 약학 및 생물 산업 등에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388과 10개의 균주들의 아밀라아제 단백질 서열을 클러스터링(clustering)하여 계통수(phylogenic tree)를 나타낸 것이다.
도 2는 저온활성 균주 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제(amylase)의 활성에 관한 것으로, 가용성 전분과 I2/KI 용액으로 측정한 결과이다.
도 3은 SDS-PAGE를 이용하여 정제된 α-아밀라아제(amylase) 밴드의 위치를 표시한 것으로, (1) 1 mM IPTG 첨가 전, (2) 1 mM IPTG 첨가 후, (3) 컬럼에 결합되지 않은 물질, (4) 5 mM 이미다졸을 이용한 세척 1, (5) 5 mM을 이미다졸을 이용한 세척 2, (6) 20 mM 이미다졸을 이용한 세척, 및 (7) 정제된 단백질을 로딩한 결과이다.
도 4는 α-아밀라아제(amylase)의 온도 및 pH에 대한 활성(A, B) 및 효과(C, D)를 측정한 결과이다.
도 5는 α-아밀라아제(amylase) 반응 산물을 박층 크로마토그래피를 통해 나타낸 결과로 1 부터 3까지 전분, 말토테트라오스, 말토트리오스의 순으로 분석되었으며, M의 경우 G1부터 G5까지 각각 포도당, 엿당, 말토트리오스, 말토테트라오스, 전분을 나타낸다.
도 6은 α-아밀라아제 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pET-28a(+):PAMC27388_amyl의 개열지도이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제(amylase)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 α-아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명에서 상기 핵산 분자는 제한되지는 않으나 서열번호 2의 염기 서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 형질전환체는 제한되지는 않으나 박테리아, 시아노박테리아 또는 미세조류일 수 있으며, 바람직하게 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli), 상기 시아노박테리아는 스피루리나 프라텐시스(Spirulina platensis), 상기 미세조류는 크라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii), 해마토코쿠스 프루비알리스(Haematococcus pluvialis) 또는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)일 수 있다.
또한 본 발명은 상기핵산 분자를 포함하는 α-아밀라아제 유전자가 삽입된 도 6의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pET-28a(+):PAMC27388_amyl에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제(PAMC 27388_amyl)의 분리
1) α-아밀라아제 유전자의 분리
아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 균주는 사우스셰틀랜드 제도 (South Shetland Islands)의 킹조지 섬(King George Island, 62°13.18' S, 58°47.20' W) 근해로부터 분리되었다.
상기 균주의 배양을 위해 Marine broth(Becton, Dickinso and Company, New Jersey, USA)를 이용하여 50 mL 배지에 마린 아가 플레이트에 형성된 단일 콜로니를 접종하고, 20 ℃에서 3일간 배양하였다. 이를 통해 분리된 균주로부터 게노믹 DNA 미니 키트(genomic DNA mini kit; Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 게놈 DNA의 분석을 통해 720 개의 아미노산으로 구성되고, 예측 분자량이 79,606 Da인 단백질을 암호화하는 2163 bp 길이의 유전자를 발견하였다.
2) α-아밀라아제 유전자 클로닝
상기 게놈 DNA로부터 α-아밀라아제를 클로닝하고 발현하기 위하여, 정방향 프라이머로서 [5′-AAA CAT ATG GTG ACC ACC ACT ACG-3′] 와 역방향 프라이머로 [5′-AAA AAG CTT TCA CCG GAG CCG TC-3′]를 합성하여 사용하였다. 상기 정방향 프라이머에서 'CAT ATG'는 NdeI 제한효소(NEB, Ipswitch, MA, USA)가 인식하는 절단 부위이며, 역방향 프라이머에서 'AAG CTT'는 HindIII 제한효소 (NEB, Ipswitch, MA, USA)가 인식하는 절단 부위이다. 상기 프라이머를 사용하여 통상적인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법을 통해 유전자를 증폭하였다.
형질전환을 위한 숙주세포로 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) (Invitrogen, California, USA)를 선택하고, 이를 위해 플라스미드 pET-28a(+) (Invitrogen, California, USA)를 유전자 전달을 위한 벡터로 활용하였다.
상기 플라스미드 pET-28a(+) 와 증폭된 α-아밀라아제 유전자를 각각 NdeI 제한효소와 HindIII 제한효소로 절단한 후 리가아제(ligase)로 플라스미드에 유전자를 도입하였다. 이후 상기 플라스미드를 대장균 BL21(DE3) 숙주에 통상적으로 알려진 프로토콜을 사용하여 형질전환하였다.
3) 형질전환체에서 α-아밀라아제의 발현
상기 플라스미드가 도입된 대장균 BL21(DE3)을 루리아-버타니(Luria-Bertani, LB; Becton, Dickinso and Company, New Jersey, USA) 배지에서 37 ℃를 유지하고, 카나마이신(Kanamycin; Thermo scientific, Massachusetts, USA) 30 ug/mL이 되도록 배지에 첨가하여 배양하였다.
α-아밀라아제는, 대장균의 OD600 이 0.5 내지 0.6 정도 되었을 때 1 mM 농도의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG; Bio basic, Ontario, Canada)를 첨가하고 30 ℃에서 4시간 배양하여 발현을 유도하였다.
4) 발현된 α-아밀라아제의 분리정제
대장균 BL21(DE3) 균주에서 플라스미드의 추출은 플라스미드 정제 키트(인트론, 성남, 대한민국)를 이용하였다.
상기 IPTG 유도를 통한 발현 후 세포 배양액을 4 ℃, 4,000 x g에서 20 분간 원심분리하여 샘플을 수득하고, 봉입체(inclusion body) 형태로 형성된 재조합 α-아밀라아제 단백질의 분리를 위해, 8 M 농도의 유레아(urea), 0.1 M 제일인산나트륨, 0.01 M Tris-HCl (pH 8.0)와 라이소자임(lysozyme)을 이용하여 재현탁한 후 20분 동안 상온에 방치하였다. 이후 4 ℃, 14,000 x g에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다.
수득한 상등액을 8 M 농도의 유레아(urea), 0.02 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M 염화나트륨 및 0.005 M 이미다졸에 의해 평형화된 Ni2+-NTA 친화성 레진의 컬럼(Thermo scientific, Massachusetts, USA)에 처리하였고, 8 M 농도의 유레아(urea), 0.02 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M 염화나트륨 및 0.02 M 이미다졸로 세척하였다. α-아밀라아제는 완충용액 내의 400 mM 이미다졸을 이용하여 용출시켰다. 용출된 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford M, Anal Biochem, 72, 248-254, 1976)의 방법으로 측정하였다.
이후 재조합 단백질이 본래의 구조로 돌아갈 수 있도록 투석을 통해 유레아를 서서히 제거하였고, 분리된 재조합 단백질을 통상적인 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 방법으로 분리하였다.
그 결과 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 70 kDa 보다 약간 큰 80 kDa 위치에서 밴드가 관측되어 His6-tag를 포함하는 아미노산 서열로부터 추정된 크기에 해당하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제의 생화학적 특성
1) α-아밀라아제 유전자의 활성 측정
아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제 (PAMC 27388_amyl)의 활성도는 2% 가용성 전분이 포함된 50 mM 농도의 Tris-HCl (pH 7.0) 완충용액에서 25 ℃에서 10 분간 전분이 분해되는 동안 유리되는 환원당의 양을 측정하는 방식으로 결정하였다. 상기 방식에서 환원당의 양 결정은 디니트로살리실릭산(dinitrosalicylic acid) 방법(Bernfeld, Meth. Enzymology, 1, 149-158,1955)을 사용하였다. 이 때 α-아밀라아제 활성의 1 단위는 상기 분석 조건에서 분당 포도당(glucose)와 등가의 1 umole 환원당을 유리시키는 α-아밀라아제 효소의 양으로 결정하였다.
2) 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용한 α-아밀라아제 활성
α-아밀라아제 (PAMC 27388_amyl)의 효소적 가수분해에 의해 생성된 최종 산물 분석은 실리카 겔이 코팅된 TLC 플레이트 상에서 수행하였다. 크로마토그래피는 n-부탄올, 아세트산 및 물이 각각 4:8:1의 부피비로 혼합된 용매 혼합액으로 전개하였으며, TLC 플레이트가 완전히 건조된 후 메탄올과 10% 황산이 9:1의 부피비로 혼합된 염색 용액에 담가 발색시켰다. 제조된 TLC 플레이트를 110 ℃에서 10 분간 방치하였다.
[표 1] 활성 측정 결과
Figure 112016015083626-pat00001
상기 방법을 활용하여 α-아밀라아제 (PAMC 27388_amyl)의 효소 활성을 10 내지 70 ℃ 범위에서 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.0)에서 2% (w/w) 가용성 전분과 반응시킨 후 1, 24시간 경과 후 측정한 결과, 20 내지 60 ℃의 넓은 범위에서도 활성을 나타냈으며, 특히 30 ℃에서 최적의 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).
또한, pH를 2부터 10까지 변화시키며 활성을 측정하였는데, pH 2, 3에서는 글리신-HCl, pH 4, 5에서는 아세트산나트륨, pH 6-8에서는 인산칼륨, pH 9에서는 Tris-HCl 및 pH 10에서는 탄산염(carbonate) 각 50 mM을 완충용액으로 이용하여 측정한 결과 활성이 가장 좋게 나타난 pH는 3일 때이었으며, 염기성에서는 활성이 급격하게 저하되는 것을 확인하였다(도 4).
특히 1 mM Co2+ 또는 1% (w/v) 유레아로 처리하였을 때 효소 활성이 30% 가까이 감소하였으나, 1 mM Fe3+를 첨가하였을 경우 효소 활성이 향상되었으며, 이로부터 Fe3+가 α-아밀라아제 (PAMC 27388_amyl)의 효소 활성에 긍정적인 역할을 하는 것임을 확인하였다.
도 1에서의 균주 약어 및 계통 분석에 사용한 효소의 명칭은 아래와 같다.
L77: Arthrobacter sp. L77_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
SPG23: Arthrobacter sp. SPG23_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
UNC362MFT: Artherobacter sp. UNC362MFTsu5.1_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
FB24: Arthrobacter sp. FB24_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
MA-N2: Arthrobacter sp. MA-N2_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
PAMC25486: Arthrobacter sp. PAMC 25486_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
NBRC12137: Arthrobacter globiformis NBRC 12137_glucanase,
Kocuria): Kocuria polaris_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
Streptomyc: Streptomyces regensis_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase,
K.rhizophi: Kocuria rhizophila_alpha-1,4-glucan-maltose-1-phosphate maltosyltransferase.
<110> University Industry Liaison Office Of Chonnam National University <120> Cold-adaptive a-amylase from Arthrobacter agilis and preparation method thereof <130> P15120631439 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 720 <212> PRT <213> Arthrobacter agilis PAMC 27388 <400> 1 Met Thr Thr Thr Thr Asp Gln Asn Arg Asn Ala Pro Tyr Pro Glu Gly 1 5 10 15 Leu Arg Phe Gly Arg Ile Pro Ile Thr Ala Val Ser Pro Val Val Glu 20 25 30 Asp Gly Arg Phe Pro Ala Lys Ala Leu Pro Gly Ser Asp Ile Ala Val 35 40 45 Gly Ala Thr Val Phe Arg Glu Gly His Asp Gln Leu Gly Val Ser Ala 50 55 60 Val Leu Tyr Asp Pro Arg Gly Lys Glu Val Gln Arg Ile Arg Met Thr 65 70 75 80 Pro Val Gly Ser Gly Leu Asp Arg Trp Ala Gly Thr Leu Thr Pro Arg 85 90 95 Ala Lys Gly Leu His Thr Phe Thr Ile Glu Gly Trp Ser Asp Leu Phe 100 105 110 Gly Thr Trp Glu His Asp Ala Thr Ile Lys Ile Ala Ala Gly Val Asp 115 120 125 Val Glu Leu Met Leu Met Glu Gly Ala Ala Leu Phe Thr Arg Ala Ala 130 135 140 Gly Glu Arg Ser Ala Arg Asp Ala Ala Leu Phe Arg Arg Thr Ala Ala 145 150 155 160 Val Leu Ala Asp Ala Ser Leu Ser Val Asp Glu Arg Leu Ala Ala Gly 165 170 175 Leu Thr Pro Gln Ile Arg Glu Ala Val Ala Arg Gln Pro Ile Arg Ser 180 185 190 Leu Val Thr Ala Ser Arg Ala Tyr Pro Ile Asp Val Glu Arg Ala Leu 195 200 205 Ala Gly Arg Ala Ala Trp Tyr Glu Phe Phe Pro Arg Ser Glu Gly Ala 210 215 220 Thr Tyr Asp Pro Glu Thr Ala Gln Trp Thr Ser Gly Thr Phe Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Lys Arg Leu Asp Ala Val Ala Ala Met Asn Phe Asp Val Val 245 250 255 Tyr Leu Pro Pro Ile His Pro Ile Gly His Thr His Arg Lys Gly Pro 260 265 270 Asn Asn Thr Leu Thr Ala Gly Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Trp Ala 275 280 285 Ile Gly Ser Ala Glu Gly Gly His Asp Ala Ile His Pro Asp Leu Gly 290 295 300 Thr Phe Glu Asp Phe Asp Ala Phe Val Ala Arg Ala Gly Glu Leu Gly 305 310 315 320 Leu Glu Val Ala Leu Asp Leu Ala Leu Gln Ala Ala Pro Asp His Pro 325 330 335 Trp Val Gln Thr His Pro Glu Trp Phe Thr Thr Arg Val Asp Gly Thr 340 345 350 Ile Ala Tyr Ala Glu Asn Pro Pro Lys Lys Tyr Gln Asp Ile Tyr Pro 355 360 365 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Pro Gln Gly Leu Ala Lys Glu Ile Leu Arg 370 375 380 Ile Val Leu Met Trp Val Gln His Gly Val Lys Ile Phe Arg Val Asp 385 390 395 400 Asn Pro His Thr Lys Pro Val Gln Phe Trp Glu Trp Leu Ile Ala Lys 405 410 415 Val Asn Lys Lys His Pro Asp Val Ile Phe Leu Ala Glu Ala Phe Thr 420 425 430 Arg Pro Pro Met Met His Ala Leu Gly Arg Ala Gly Phe Gln Gln Ser 435 440 445 Tyr Ser Tyr Phe Thr Trp Arg Asn Thr Lys Thr Glu Leu Glu Glu Tyr 450 455 460 Phe Thr Glu Ile Ser Gln Val Ser Pro Ala Tyr Phe Arg Pro Asn Phe 465 470 475 480 Phe Val Asn Thr Pro Asp Ile Leu Thr Glu Tyr Leu Gln Tyr Gly Gly 485 490 495 Pro Ala Ala Phe Lys Ile Arg Ala Val Leu Ala Ser Met Ala Ser Pro 500 505 510 Leu Trp Gly Val Tyr Ser Gly Tyr Glu Leu Phe Glu His Val Ala Arg 515 520 525 Pro Gly Ala Glu Glu Tyr Ile Asp Asn Glu Lys Phe Gln Tyr Arg Pro 530 535 540 Arg Asp Tyr Ala Ala Ala Glu Ala Glu Gly Arg Ser Leu Ala Pro Phe 545 550 555 560 Ile Thr Arg Leu Asn Ala Ile Arg Arg Ala His Pro Ala Leu Gly Asp 565 570 575 Leu Glu Asn Leu Thr Ile His Ser Ser Thr Asp Pro Ala Thr Leu Val 580 585 590 Ser Ser Ser Thr Ser Arg Arg Arg Arg Ala Arg Thr Arg Ser Ser Ser 595 600 605 Ser Ser Met Ser Ile Arg Thr Ala Pro Ala Arg Val Arg Cys His Ser 610 615 620 Ile Trp Gln Asn Trp Ala Ser Thr Gln Pro Met Ser Thr Arg Pro Gly 625 630 635 640 Arg Ser Ser Trp Thr Ile Ser Ser Arg Val Arg Pro Ser Pro Gly Ala 645 650 655 Asn Thr Thr Thr Ser Gly Trp Met Pro Met Trp Asn Gln Leu Thr Phe 660 665 670 Ser Gln Ser Gly Gly Ser Thr Ser Ala Gln Pro Leu Pro Ala Gln Cys 675 680 685 Thr Trp Thr Gly Pro Arg Pro Pro Val Val Pro Gln Gly Gly Leu Leu 690 695 700 Arg Gly Ser Gly Ala Arg Leu Arg Arg Cys Glu Arg Gly Arg Leu Arg 705 710 715 720 <210> 2 <211> 2163 <212> DNA <213> Arthrobacter agilis PAMC 27388 <400> 2 gtgaccacca ctacggacca gaaccgaaat gccccttatc ccgaaggact gcggttcggc 60 cgcattccca tcaccgcggt cagtcccgtt gtcgaggacg gacgcttccc ggccaaggca 120 cttcccggct cggacatcgc cgtgggtgcc accgtcttca gggaaggaca cgaccagctg 180 ggtgtctcgg ccgtcctgta cgacccccgg ggcaaggagg tgcagcgcat ccggatgacg 240 cccgtcggat ccgggctgga tcgctgggcc ggaaccctga ccccgcgagc gaagggcctg 300 cacaccttca cgatcgaggg ctggtccgac ctcttcggga cgtgggagca cgacgccacc 360 atcaagatcg cagccggcgt cgacgtcgag ctgatgctga tggagggcgc agcactcttc 420 acccgtgcag caggggagcg cagcgcgcgt gacgcggcgc tcttccgccg caccgcggcg 480 gtcctcgccg atgcctccct gagcgtcgac gagcgtctcg ccgcgggcct gacgccccag 540 atccgcgagg cggtcgcccg ccagcccatc cgctcactgg tcaccgcgtc ccgtgcgtac 600 ccgatcgacg tcgagcgggc actcgccggc cgcgccgcct ggtacgagtt cttcccgcgc 660 tccgagggcg ccacctacga cccggagacg gcgcagtgga cctccggcac gttccgggac 720 gccgccaagc ggctcgacgc cgtggccgcc atgaacttcg acgtcgtcta cctgccgccg 780 atccacccga tcggacacac gcaccgcaag ggtccgaaca acacgctcac tgccggcccc 840 ggcgatccgg gctcgccctg ggccatcgga tccgcagaag gcggccacga cgccatccac 900 cccgatctcg gcaccttcga ggacttcgac gccttcgtcg cccgtgccgg tgagctcgga 960 ctcgaggtgg ccctcgacct cgcactgcag gcagcaccgg accacccttg ggtccagacg 1020 caccccgagt ggttcaccac ccgcgtggac ggcaccatcg cctacgcgga gaaccctccg 1080 aagaagtacc aggacattta tccgatcaac ttcgacaacg acccccaggg tctggcgaag 1140 gagatcctgc ggatcgtcct catgtgggtc cagcacggcg tgaagatctt ccgggtggac 1200 aacccgcaca ccaagcccgt ccagttctgg gaatggctca tcgcgaaggt caacaagaag 1260 caccccgatg tcatcttcct ggccgaggcc ttcacgcgcc cgcccatgat gcacgccctc 1320 ggccgcgccg ggttccagca gtcctactcc tacttcacgt ggcgcaacac gaagacggag 1380 ctcgaggagt acttcacgga gatcagccag gtctccccgg cgtacttccg gcccaatttc 1440 ttcgtcaaca ccccggacat cctgaccgag tacctccagt acggcggccc ggccgccttc 1500 aagatccgcg ccgtgctcgc ctccatggcg agcccgctgt ggggtgtcta ctccgggtac 1560 gagctcttcg agcacgtggc caggcccggc gccgaggagt acatcgacaa cgagaagttc 1620 cagtaccgtc cgcgggacta cgcggccgcc gaggccgagg gccggtcgct ggccccgttc 1680 atcacccggc tcaacgccat ccgccgcgca caccccgcgc tcggcgacct cgagaacctc 1740 accatccaca gcagcacgga cccggccacg ctggtctcgt caagcacaag cagacggcgg 1800 agggcaagga cacgatcatc gtcgtcgtca atgtcgatcc gcacagcacc cgcgagagta 1860 cggtgtcact cgatctggca aaattgggcc tcgacgcagc cgatgtcgac gagaccggga 1920 cgttcctcgt ggacgatctc atcacgggtc agaccttcgc ctggggcgaa cacaactacg 1980 tccggctgga tgcccatgtg gaaccagctc acattctctc aatcaggagg cagcactagt 2040 gcccaacccc ttccagctca atgcacctgg actggcccac gaccccctgt ggtaccgcaa 2100 ggcggtcttc tacgaggctc tggtgcgcgg cttcgccgat gcgaacgggg acggctccgg 2160 tga 2163

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 아르스로박터 아길리스(Arthrobacter agilis) PAMC 27388 유래 α-아밀라아제(amylase)를 코딩하는, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 제 3항의 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
  5. 제 4항의 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 형질전환체는 박테리아, 시아노박테리아 또는 미세조류인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 시아노박테리아는 스피루리나 프라텐시스(Spirulina platensis)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 미세조류는 크라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii), 해마토코쿠스 프루비알리스(Haematococcus pluvialis) 또는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  10. 제 3항의 핵산 분자를 포함하는 α-아밀라아제 유전자가 삽입된 도 6의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pET-28a(+):PAMC27388_amyl.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US4032318A (en) 1973-08-24 1977-06-28 Judd Ringer Corporation Composting mixture

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