CN112410322B

CN112410322B - 一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体及应用

Info

Publication number: CN112410322B
Application number: CN202011368793.4A
Authority: CN
Inventors: 张春晓; 高伟强; 陈晓波; 王丽丽
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112410322A

Abstract

本发明选用地衣芽孢杆菌β‑甘露聚糖酶基因，通过易错PCR对该基因进行突变，通过在枯草芽孢杆菌中进行高效分泌表达，筛选得到一个酶活性及pH稳定性提高的突变体。结果表明，β‑甘露聚糖酶及其突变体的最适温度60℃，最适pH 6.0，发酵4天时突变体酶活性达13888±260 U/mL，是野生型的2.2倍，且70℃半衰期为30 min，另外，β‑甘露聚糖酶突变体较野生型具更高的pH稳定性，在pH5.0~10.0范围内37℃保温1h后，残余酶活性均高于80%。该酶在养殖业中展现了良好的应用前景。

Description

一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体及应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）能够随机水解甘露聚糖的β-1，4-甘露糖苷键，产生低分子量的甘露寡糖，在饲料、食品、医药、造纸、纺织等行业方面具广泛应用价值。β-甘露聚糖酶能够降低甘露聚糖的抗营养因子作用，提高家畜饲料的利用价值；另一方面，其降解产物甘露寡糖，能够促进乳酸菌和双歧杆菌的生长，利于动物肠道健康，还具有增强动物免疫、调节糖脂代谢、促生长和抗氧化等作用。

β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、动物和微生物中，但天然来源的酶产量低，难于满足生产需求。来源于地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶，具有良好的热稳定性和碱稳定性，在饲料、食品、造纸等行业都具有潜在应用价值，但该酶在地衣芽孢杆菌产量低，难于满足市场需求。

2020年，饲料端全面限抗，β-甘露聚糖酶因其具有抗营养因子及其水解产物利于动物肠道健康，是很有前途的替抗产品，市场需求量将进一步增加。β-甘露聚糖酶在工业化应用过程中，部分领域需要高温处理，如动物饲料制粒过程中需85 ℃处理约3 min，由于大部分β-甘露聚糖酶的最适温度为 40~75 ℃，高温下酶活性大大降低甚至完全失活；另外，动物胃液呈酸性，而有的酶在酸性环境下酶活性也大大降低，因此，筛选耐酸性或pH稳定性高及热稳定性高的β-甘露聚糖酶是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐酸性且热稳定性高的β-甘露聚糖酶突变体。

本发明采用如下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体在70℃时，半衰期达30 min。

进一步的，所述地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体在pH5.0~10.0范围内37 ℃保温 1h后，残余酶活性均高于80%。

进一步的，所述地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体的最大酶活性出现在发酵的第4天，为13888±260 U/mL。

一种上述地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体的编码基因，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

一种上述编码基因的表达载体。

一种包含上述编码基因的枯草芽孢杆菌细胞。

一种上述地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体在养殖业中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明利用随机诱变PCR，对地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因进行随机突变，筛选酶学性质改善的β-甘露聚糖酶突变体，并利用枯草芽孢杆菌实现了其高效分泌表达，为该酶在养殖业及食品等行业中的应用奠定了基础。

附图说明

图1为β-甘露聚糖酶基因PCR结果。

图1中，泳道M为DNA Marker；泳道1为β-甘露聚糖酶前体编码基因；泳道2为β-甘露聚糖酶基因。

图2为SignalP5.0在线软件分析β-甘露聚糖酶前体氨基酸序列结果。

图3为β-甘露聚糖酶及其突变体工程菌株发酵液SDS-PAGE电泳结果。

图3中，泳道1为WB980；泳道2为MTV13；泳道3为YM102。

图4为β-甘露聚糖酶及突变体的最适温度比较。

图5为β-甘露聚糖酶及突变体在70 ℃下30 min后的残余酶活性结果比较。

图6为β-甘露聚糖酶及突变体的pH稳定性结果比较。

图7为β-甘露聚糖酶及突变体产量比较。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

1 材料与方法

1.1材料及试剂

本发明所用质粒及菌株分别见表1 和表2。Fastpfu、Hifi Taq、easyTaq、dNTP等为北京全式金生物技术有限公司产品，其它材料为国产试剂。Biometra Tone PCR仪为德国耶拿公司产品，SpectraMaxm i3x 多功能酶标仪。

表1 本发明所用质粒

。

备注：[1] Wu SC and Wong SL., Development of improved pUB110-basedvectors for expression and secretion studies in Bacillus subtilis Journal ofbiotechnology 1999，72:185-195。

表2 本发明所用菌株

。

备注：[2] Kawamura F. and DOI RH., Journal of bacteriology,Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellularalkaline and neutral proteases 1984, 160 (1): 442-444。

本发明所用引物如表3所示。

表3 本发明所用引物

。

1.2微生物培养

-70℃保存的地衣芽孢杆菌KD-1和枯草芽孢杆菌 DB104 在LB固体培养基（酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，15 g/L琼脂粉）上划线，37℃倒置培养16h，挑取单克隆，在LB液体培养基中进行培养。

B. subtilis各工程菌株在含有10 mg/L卡那霉素的 LB固体培养基中划线37℃培养，挑取单克隆，在LB液体培养基中200rpm过夜培养，以10%比例转接至发酵培养基（2.0%酵母提取物、 2.5% 蛋白蛋、0.3% K₂HPO₄和3.0% 葡萄糖），200 rpm 37℃培养。

1.3 地衣芽孢杆菌基因组提取

地衣芽孢杆菌基因组提取参考：韩梁彦等. 一种适合PCR 反应的产黄青霉基因组简易提取方法，2015，34（10）：2255-2261进行。

1.4地衣芽孢杆菌manBl基因克隆

以地衣芽孢基因组为模版，采用简并引物Bl man2-F1和BL man2-R1，应用HifiTaq酶扩增β-甘露聚糖酶前体（manBl-p）基因，将PCR产物纯化后连接到pGEMT easy载体，连接后的产物 DH5α转化涂平板进行蓝白斑筛选，对白斑进行测序鉴定。

1.5枯草芽孢杆菌manBl及其突变体基因工程表达载体pWB980-manBl构建

采用POE-PCR的方式将地衣芽孢杆菌manBl基因插入到pWB980载体上。manBl基因克隆以BL man2-F2 和manBT-2为引物，地衣芽孢杆菌KD-1基因组DNA为模版，采用fastpfu进行PCR克隆，PCR条件为95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 S，50 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30个循环；72℃ 5 min。枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因终止子的克隆以amyT-F 和 amyT-R为引物，枯草芽孢杆菌DB104基因组为模版进行PCR基因克隆，PCR条件为95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃20 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃ 5 min。manBl-amyT融合基因克隆以spmanB-F 和amyT-R为引物，上述两种PCR产物为模版，95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40s，30个循环；72 ℃ 5 min。pWB980载体的线性化以Pvf-1 和 Pvf-2为引物，pWB980质粒为模版，95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 5 min。pWB980与manBl-amyT的连接采用POE-PCR方式进行，分别以上述两种PCR产物为模版，98 ℃ 1min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 8 min。

manBl基因的随机诱变以R-manBL-F和R-manBL-R为引物，pWB-manBl为模版，应用easyTaq进行PCR扩增，PCR各组分浓度参考黄留玉等，PCR最新技术原理、方法及应用，北京：化学工业出版社，2004进行，条件如下，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min。载体片段扩增以V-manBl-F和V-manBl-R为引物，pWB-manBl为模板进行PCR扩增。manBl突变体质粒pWB-manBlM的构建也采用POE-PCR方式进行。

1.6 枯草芽孢杆菌感受态制备及转化

B. subtilis DB104 感受态细胞的制备及转化参考文献Vojcic L et al. Anefficient transformation method for Bacillus subtilis DB104. Appl MicrobiolBiotechnol，2012，94: 487–493进行。

1.7 β-甘露聚糖酶活性测定

将魔芋粉浸泡在75% 酒精中处理，烘干以除去魔芋胶中含有的还原糖使其变为精魔芋胶，在酶活性测定时作为底物使用。采用DNS法进行酶活性测定，将精魔芋胶溶于pH6.0磷酸钠缓冲液中配制5 g/L的溶液作为底物，于0.27 mL底物中加入0.03 mL粗酶液，60℃水浴10 min，加入DNS试剂 0.6 mL，混匀后沸水浴5 min显色，马上使其降温，利用SpectraMaxm i3x 多功能酶标仪测定540 nm处吸光值。

酶活性定义：在一定温度和pH值下，以每分钟催化底物水解生成1 μmol D-甘露糖所需的酶量定义为一个酶活性单位（U）。

1.8 β-甘露聚糖酶酶学性质研究

按田庚等热稳定性高β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究，食品工业科技，2020，41（19）：127-131的方法测定β-甘露聚糖酶及其突变体的酶学性质。

2 结果与分析

2.1 manBl基因克隆结果

manBl基因克隆结果如图1所示，泳道1为β-甘露聚糖酶前体（manBl-p）编码基因，泳道2为manBl基因。

测序结果表明，地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶前体（manBl-p）的编码基因为1083bp，如SEQ ID No.1所示。所克隆（β-甘露聚糖酶前体）基因序列与B. licheniformisATCC14580、DSM13、PB3（CP025226.1）及 MCC2514（CP038186.1）、CICC10084等菌株β-甘露聚糖酶前体基因一致性99.82%，只有2个碱基的差别，分别位于第11位和1074位。将manBl-p基因的核苷酸序列应用SnapGene软件进行翻译，编码360个氨基酸，序列如SEQ ID No.4所示，进一步应用SignalP5.0在线软件分析（如图2所示），其N端24个氨基酸为信号肽序列，因此，manBl-p经信号肽酶切割后的β-甘露聚糖酶（manBl）包含336个氨基酸。

将β-甘露聚糖酶（manBl）基因，大小为1011bp，进行随机突变，获得β-甘露聚糖酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，应用SnapGene软件进行翻译，β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

β-甘露聚糖酶突变体基因与pWB980载体的scaB信号肽基因序列，表达后形成融合的突变体前体，其氨基酸序列，如SEQ ID No.5所示，共包含365个氨基酸。

2.2 β-甘露聚糖酶及其突变体在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

将manBl基因及β-甘露聚糖酶突变体基因与pWB980载体通过PCR连接后，转化入B. subtilis DB104感受态细胞中，对获得的转化子进行发酵培养，利用SDS-PAGE电泳研究β-甘露聚糖酶及其突变体的表达情况。图3显示，MTV13（泳道2）和YM102发酵液中出现了浓度较高的特异39kD条带，与预期β-甘露聚糖酶分子量大小一致，而对照菌株WB980没有表达出该蛋白，初步说明β-甘露聚糖酶及其突变体在B. subtilis DB104成功地实现了分泌表达。

2.3 β-甘露聚糖酶及其突变体酶学性质研究

2.3.1 酶的最适温度及热稳定性

图4显示β-甘露聚糖酶及其突变体的最适温度均为60℃，二者不同温度下相对酶活性随温度变化差异不大。70℃热稳定性，β-甘露聚糖酶突变体较野生型有所降低，但70℃半衰期达30 min（见图5），高于多数β-甘露聚糖酶。这对于酶制剂制备中往往需要高温制粒过程尤显重要。

2.3.2 酶的pH稳定性

虽然β-甘露聚糖酶及其突变体最适pH为6.0，在pH4.0~10.0之间，突变体残余酶活性均高于野生型，说明突变体比野生型具有更好的pH稳定性，在pH5.0-10.0范围内37 ℃保温 1h后，残余酶活性均高于80%（见图6）。动物肠道环境为酸性，在pH4.0~6.0范围内该酶的稳定性较野生型更高，更适合在养殖业中应用。

2.4 β-甘露聚糖酶及其突变体酶活性随发酵时间的变化

工程菌株MTV13和YM102所产β-甘露聚糖酶及突变体的酶活性随发酵时间不同而有所变化（见图7），工程菌株MTV13所产β-甘露聚糖酶的最大酶活性出现在发酵的第6天，为7405±653 U/mL；而工程菌株YM102所产β-甘露聚糖酶突变体最大酶活性出现在发酵的第4天，为13888±260 U/mL，突变体酶活性提高了87.5%，并且缩短了发酵周期，对降低生产成本有积极的意义。以同样发酵4天做比较，突变体酶活性是野生型酶活性（6343±43 U/mL）的2.2倍。

本发明的β-甘露聚糖酶突变体，酶活性较野生型提高2.2倍，在70℃半衰期达30min，且在酸性条件下酶的pH稳定性也较野生型有很大提高，如pH4.0和pH5.0时，突变体较野生型残余酶活性分别提高30%和34%（见图6），为该酶在养殖业中的应用奠定了基础。该酶不仅耐酸性环境，在碱性条件（pH<10.0），也展示了很好的稳定性，相对残余酶活性仍保留80%以上，使得该酶具有更广的应用领域。

以上实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所做出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学

<120> 一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体及应用

<130> 2020

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis KD-1

<400> 1

gtgaaaaaaa gcatcgtttg ttcaatcttc gcgctgctcc ttgcttttgc cgtttcgcag 60

ccgagctatg cacacaccgt ttctccggtg aacccgaatg cccagccgac gacgaaagcg 120

gtgatgaact ggctcgccca cctgcccaat cggacggaaa gccgggtgat gtccggggcg 180

ttcggaggat acagcctcga cacattttca acggctgaag ccgaccggat caaacaggca 240

acaggacagc tgccggccat atacggctgc gattatgcaa gaggatggct ggagccggaa 300

aagatcgccg atacgattga ctacagctgc aaccgtgatt tgatcgcata ctggaaaagc 360

ggaggcattc cgcaaatcag catgcacctc gcaaaccccg cgtttacttc gggtcattat 420

aaaactcaga tttcaaacag ccagtatgag agaattttag attcttccac tcctgaagga 480

aagcggcttg aggcgatgct gagcaaaatc gcggacggcc tccaggagct tgaaaatgaa 540

ggcgtgcccg ttctattcag accccttcac gaaatgaacg gcgaatggtt ctggtggggg 600

ctgacgcaat ataatcaaaa agacagcgaa agaatctcct tgtacaaaca gctctatgtg 660

aaaatctatg actatatgac aaaaacaaga ggcctggatc atctcttgtg ggtgtatgcg 720

ccggacgcca acagagactt taaaacggac ttttatccgg gcgcatcata tgtggacatt 780

gtcgggcttg acgcttattt tgatgacccg tacgccattg atggctacga agagctcaca 840

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<210> 2

<211> 1011

<212> DNA

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acgattgact acagctgcaa ccgtgatttg aacgcatact ggaaaagcgg aggcattccg 300

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ctattcagac cccttcacga aatgaacggc gaatggttct ggtgggggct gacgcaatat 540

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<211> 336

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

His Thr Val Ser Pro Val Asn Pro Asn Ala Gln Pro Thr Thr Lys Ala

1 5 10 15

Val Met Asn Trp Leu Ala His Leu Pro Asn Arg Thr Glu Ser Arg Val

20 25 30

Met Ser Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Ser Leu Asp Thr Phe Ser Thr Ala

35 40 45

Glu Ala Asp Arg Ile Lys Gln Ala Thr Gly Gln Leu Pro Ala Ile Tyr

50 55 60

Gly Cys Asp Tyr Ala Arg Gly Trp Leu Glu Pro Glu Lys Ile Ala Asp

65 70 75 80

Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn Arg Asp Leu Asn Ala Tyr Trp Lys Ser

85 90 95

Gly Gly Ile Pro Gln Ile Ser Met His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Thr

100 105 110

Ser Gly His Tyr Lys Thr Gln Ile Ser Asn Ser Gln Tyr Glu Arg Ile

115 120 125

Leu Asp Ser Ser Thr Pro Glu Gly Lys Arg Leu Glu Ala Met Leu Ser

130 135 140

Lys Ile Ala Asp Gly Leu Gln Glu Leu Glu Asn Glu Gly Val Pro Val

145 150 155 160

Leu Phe Arg Pro Leu His Glu Met Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly

165 170 175

Leu Thr Gln Tyr Asn Gln Lys Asp Ser Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys

180 185 190

Gln Leu Tyr Val Lys Ile Tyr Asp Tyr Met Thr Lys Thr Arg Gly Leu

195 200 205

Asp His Ile Leu Trp Val Tyr Ala Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys

210 215 220

Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Ser Tyr Val Asp Ile Val Gly Leu Asp

225 230 235 240

Ala Tyr Phe Asp Asp Pro Tyr Ala Ile Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Thr

245 250 255

Ser Leu Asn Lys Pro Phe Ala Phe Thr Glu Val Gly Pro Gln Thr Thr

260 265 270

Asn Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Arg Phe Ile His Ala Ile Lys Glu Lys

275 280 285

Tyr Pro Lys Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Trp Asn Asp Glu Trp Ser Pro

290 295 300

Ala Val Asn Lys Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Leu His Pro Trp Thr Leu

305 310 315 320

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325 330 335

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<213> Bacillus licheniformis KD-1

<400> 4

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<211> 365

<212> PRT

<213> 人工合成

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165 170 175

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Leu Asp Tyr Ala Arg Phe Ile His Ala Ile Lys Glu Lys Tyr Pro Lys

305 310 315 320

Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Trp Asn Asp Glu Trp Ser Pro Ala Val Asn

325 330 335

Lys Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Leu His Pro Trp Thr Leu Asn Lys Gly

340 345 350

Glu Ile Trp Asp Gly Asp Ser Leu Thr Pro Val Val Glu

355 360 365

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的表达载体。

4.一种包含权利要求2所述编码基因的枯草芽孢杆菌细胞。