CN103184206B - 甘露聚糖酶及其突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物工程技术领域。本发明提供了高酶活的甘露聚糖酶及其突变体。本发明提供了6个从地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis ）不同菌株中克隆得到的甘露聚糖酶基因及其编码的甘露聚糖酶，并通过生物信息学分析了6个突变体间的差异和亲缘关系。本发明提供的甘露聚糖酶在中性pH条件下具有高活性，其最适温度适中，可作为作饲用酶制剂。
Description
本申请是申请日为2011年8月16日、申请号为201110234218.X、“甘露聚糖酶及其突变体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及甘露聚糖酶及其突变体，属于微生物工程技术领域。
背景技术
β-1, 4-D-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）又称为甘露聚糖酶，它能水解含有β-1, 4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖或甘露多糖，属于半纤维素酶类。
在自然界中，甘露聚糖是仅次于纤维素的第二大可再生的半纤维素碳水化合物，广泛存在于植物细胞壁，尤其是在豆科植物种子中，半乳糖-甘露聚糖含量高达干重的20%以上。同时，甘露聚糖的结构也有很多种，如半乳糖-甘露聚糖、葡萄糖-甘露聚糖和半乳糖-葡萄糖-甘露聚糖等。半乳糖-甘露聚糖的结构是主链由β-1, 4-D-甘露糖苷键连接而成的甘露聚糖，侧链则是α-1, 6-半乳糖苷键连接的半乳糖。葡萄糖-甘露聚糖主链是由β-1, 4-D-甘露糖苷键连接而成，但其主链上一些甘露糖被葡萄糖取代。
半纤维素酶，包括甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等，广泛用于纤维素生产乙醇、食品、饲料和造纸等行业。饲用酶制剂要适应动物如猪和禽类等的消化道特点，需要具有耐酸性强，同时在pH6.0~7.0范围活性最强等特点。大豆粕是生产饲料的重要原料，如果在饲料中添加适量甘露聚糖酶，既能提高饲料的消化率，又能降低饲料成本（杨鸿昆等，2007，饲料研究；段蕾等，2008，饲料研究；范志恒，2008，饲料工业）。
很多微生物能产甘露聚糖酶，包括曲霉，芽孢杆菌甚至是链霉菌等。但是，通过菌种的筛选和诱变选育的自然菌株所产的甘露聚糖酶的酶活水平≤100U/ml，往往不能满足工业生产的需要（杨文博，1995，微生物通报）。因此，克隆基因进行异源表达而获得高效表达工程菌是当前开发甘露聚糖酶的热点（丁宏标等，2006，畜牧与饲料；谭秀华等，2005，微生物学报）。
作为饲料添加剂，寻找高酶活、耐酸和最适温度接近体温的甘露聚糖酶是当前研究的热点和难点。而蛋白质工程改造是获得理想蛋白的重要手段之一。定向进化是获得理想的饲用甘露聚糖酶的重要手段（毛绍名等，2007，微生物通报）。定向进化是利用随机突变而筛选大量突变体来获得目的蛋白，其工作量大，偶然性也非常大（张红缨等，1999，科学通报；许钦坤等，2005，生物技术通讯）。而理性设计虽然工作量相对较小，但是往往难于找到合适氨基酸位点进行突变改造（张秀艳等，2006，生物工程杂志；王凡业等，2006，应用化工）。
本发明提供了pH偏中性的甘露聚糖酶及其多个酶的突变体。这些突变体是从地衣芽孢杆菌的不同菌株中克隆得到，它们间不完全同源，同源性为99%。尽管这些突变体的同源性非常高，但是彼此间活性（比活）存在很大的差异。这说明这些突变/取代位点是影响其活性的关键位点，这为甘露聚糖酶的定向进化和理性设计通过提供了可供选择的关键位点和方向。
发明内容
本发明的目的是提供高酶活的甘露聚糖酶及其变体。
本发明提供了新的重组甘露聚糖酶及其突变体，其中所述重组甘露聚糖酶的氨基酸序列：
（a） 包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 12其中之一；或者
（b） 是在选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 12其中之一上取代、缺失或添加一个或数个氨基酸残基得到。
在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 4，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。
在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6，，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。
在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 8，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 7。
在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 9。
在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 11。
酶活实验结果表明：本发明提供的甘露聚糖酶具有良好的酶活。其中氨基酸为SEQ ID NO：12的高比活甘露聚糖酶具有很好的稳定性。在70℃、80℃、85℃和90℃条件下水浴5分钟，分别还能保持90%、30%、20%和18%的酶活。最适pH分析显示，该酶在pH5.0-9.0范围内均有活性，且有2个最适pH作用峰，即pH6.5和pH8.5。
另一方面，本发明还提供了一种制备重组甘露聚糖酶的方法，该方法包括：
（a） 提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA；
（b） 以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
（c） 将PCR扩增产物克隆入表达载体；
（d） 用步骤（c）得到的重组表达载体转化表达宿主；
（e） 分离、鉴定并纯化表达产物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增使用的引物对为
P1：GCACACACCGTTTCTCCGGTG，和
P2：CACGACAGGCGTCAAAGAATCG。
在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增条件为: 95℃ 4min；94℃ 30s；55℃ 40s，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述表达载体为pET28。
在本发明的一个优选实施方案中，所述表达宿主为大肠杆菌BL21。
在本发明的具体实施方案中，所述扩增产物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11。
在本发明的一个优选实施方案中，利用pPIC9K质粒构建了SEQ ID NO: 11的重组表达载体，并转化毕赤酵母GS115菌株,获得了高效表达的毕赤酵母工程菌，为规模化的发酵和应用奠定了基础。
本申请用生物软件DNAMAN6.0分析显示所述酶编码基因之间存在不同位点的不同程度突变。为研究这些突变对酶学活性的影响，分别将这些突变基因进行了重组表达。通过Ni-agarose纯化重组蛋白并分析其酶学性质。酶学性质分析显示6个突变体的酶活（比活）存在明显的差异，说明这些位点氨基酸残基是影响甘露聚糖酶活性的关键位点。本发明提供了地衣芽孢杆菌6个甘露聚糖酶突变体基因及其相应的氨基酸序列。6个甘露聚糖酶氨基酸序列之间存在20、27、31、48、64、78、81、89、102、105、122、123、179、187、195、234、248、254、255、292、302、312、313和325位点上存在突变。这些位点氨基酸残基的突变造成酶活的较大差异，这为甘露聚糖酶的理性设计和定向进化提供了参考。
另一方面，本发明还提供了一种测定甘露聚糖酶测定方法，该方法包括：
以0.6%槐豆胶甘露聚糖（Sigma公司, Batch#125K0091）为底物。以0.1M 醋酸-醋酸钠（pH5.5）为缓冲液，将甘露聚糖底物 37℃平衡20min；将待测酶液 37℃平衡10min。取4支试管，分别加入酶液2ml，取其中3支作为测定管，分别加入2ml 底物溶液，另一支作为空白管加入5ml DNS溶液，在37℃±0.5℃水浴30分钟，三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml 底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml，以空白管调零，在分光光度计540nn 处测吸光度。酶活定义是在37℃ pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生1μmol甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。
附图说明
图1 图示的是用DNAMAN比对分析蛋白序列
图2 图示的是Clustal X分析蛋白序列的系统发育
图3图示的是 Man6酶学性质最适温度和pH分析
本发明优点：
从不同地衣芽孢杆菌菌株中克隆多个甘露聚糖酶基因的突变体，并分析甘露聚糖酶突变体酶学特性。这些甘露聚糖酶氨基酸序列同源性最高达99%以上，但是不同位点的突变取代造成了酶活性的明显差别。这为蛋白质的定向进化和蛋白质工程改造提供了选择位点，为选择高活性的甘露聚糖酶进行异源高效表达奠定基础
实施例
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例1 地衣芽孢杆菌甘露聚糖酶基因的克隆
1.1 提取地衣芽孢杆菌不同菌株的总基因组DNA
将本实验室保存的6株地衣芽孢杆菌过夜培养，各取1.5ml，12000rpm离心1分钟，除上清；加入200μl裂解缓冲液（60mM Tris-HCl，pH7.8, 20mM Na-Ac, 1mM EDTA, 1.5% SDS），用移液器剧烈吹打；加入66μl 5M高氯酸钠溶液混匀，12000rpm离心10分钟，取上清；加入等体积苯酚抽提一次，12000rpm离心2分钟，取上清；加入等体积异丙醇沉淀5分钟，12000rpm离心5分钟；70%乙醇洗涤两次；最后将干燥的DNA溶于ddH2O。
基因克隆
以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物对（GCACACACCGTTTCTCCGGTG和CACGACAGGCGTCAAAGAATCG）进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
测序分析
将1.2中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为pMDT-Man1、pMDT-Man2、pMDT-Man3、pMDT-Man4、pMDT-Man5和pMDT-Man6；最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果为：Man1、Man2、Man3、Man4、Man5、Man6的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11。其编码蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12。
实施例2 甘露聚糖酶的序列分析
将测序结果在NCBI上BLAST比对分析显示这些序列与甘露聚糖酶基因高度同源。利用生物软件DNAMAN6.0分析核酸序列发现6个序列不是完全同源。把相应的核酸序列翻译为氨基酸序列，并分别命名为Man1、Man2、Man3、Man4、Man5和Man6。对氨基酸序列同源比对分析，结果显示以下一个位点或几个位点存在突变，即：20、27、31、48、64、78、81、89、102、105、122、123、179、187、195、234、248、254、255、292、302、312、313和325位点。这些位点的氨基酸残基可能的取代是Y20N，D27N，N31 S，L48 T，V64I，E78 K，V81D，S89R，R102Q，L105M，S122P，S123N，S179T，A187E，R195Q，H234Y，H248Y，D254E，Q255E，N292K，G302E，G312D，A313T，D325E，序列比对分析结果见图1。生物软件Clustal X分析蛋白的氨基酸序列的系统发育，6个突变体亲缘关系特别近，见图2。
实施例3 甘露聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达及纯化
分别以质粒pMDT-Man1、pMDT-Man2、pMDT-Man3、pMDT-Man4、pMDT-Man5和pMDT-Man6为模板，利用引物（AGA GCTAGC GCACACACCGTTTCTCCGGTG---NheI和ACA CTCGAG CACGACAGGCGTCAAAGAATCG---XhoI）进行PCR扩增，PCR扩增条件是95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行NheI酶切，然后回收酶切产物进行XhoI酶切。同样，对表达质粒pET28a也分别进行NheI酶切和XhoI酶切。用T4连接酶把双酶切产产物即克隆基因和表达载体4℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒分别命名为pET-Man1、pET-Man2、pET-Man3、pET-Man4、pET-Man5和pET-Man6。
把阳性克隆菌落接种5ml LB培养基，37℃培养至OD600=0.3时加入1mM IPTG诱导表达4-5小时。离心收集表达细胞于-20℃冻存过夜，然后加入1mL裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole）进行超声波破碎，不时进行显微镜观察，待细胞完全破碎后按照QIAGEN公司的Ni-NTA SPIN试剂盒所提供的方法进行蛋白纯化回收。电泳结果显示回收得到相应的目的蛋白。
实施例4 酶学性质分析
以0.6%槐豆胶甘露聚糖（Sigma公司, Batch#125K0091）为底物。测定在实施例3中所纯化的重组甘露聚糖酶的活性，步骤如下：以0.1M 醋酸-醋酸钠（pH5.5）为缓冲液，将甘露聚糖底物 37℃平衡20min；将待测酶液 37℃平衡10min。取4支试管，分别加入酶液2ml，取其中3支作为测定管，分别加入2ml 底物溶液，另一支作为空白管加入5ml DNS溶液，在37℃±0.5℃水浴30分钟，三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml 底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml，以空白管调零，在分光光度计540nn 处测吸光度。酶活定义是在37℃ pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生1μmol甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。
纯化蛋白酶活为5.5~5620IU/ml不等，比活测定为12~7020IU/mg不等。其中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5编码的蛋白Man4和Man5活性极低。
此外，还测定了Man6在不同pH和温度条件下酶学活性，其中缓冲液分别是0.1M 醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.0 、pH 5.0、pH 6.0）、0.1M磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH6.5、7.0，7.5、8.0）和0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH8.5、9.0、10.0）。结果如图3所示，最适温度为50℃，在pH6.5和pH8.5是2个最适峰，而且在pH6.0-7.0之间甘露聚糖酶酶活很稳定。
实施例5 在毕赤酵母中的表达
5.1 表达质粒pPIC-Man2的构建
设计引物Man2-F和Man2-R（ATAGAATTCGCACACACCGTTTCTCCGGTG [EcoRI] 和 ATAGCGGCCGCCACGACAGGCGTCAAAGAATCG[Not I]）以质粒pET-Man2为模板，以Man2-F和Man2-R为引物进行PCR扩增。PCR条件为：95℃ 4min；94℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 7min。凝胶回收PCR产物，并以Eco RI和Not I双酶切。同样，以Eco RI和Not I双酶切pPIC9K，然后把两个酶切产物连接过夜后导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pPIC-Man6。
重组工程菌的构建
表达质粒pPIC-Man2用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1 mL预冷的电泳缓冲液中(含1mM MgCl2，10mM HEPES, 250mM 蔗糖, pH 7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.5%甲醇），挑选重组菌株。
摇瓶诱导表达
将挑选工程菌接种于5ml BMGY ( 1％酵母提取物， 2％蛋白陈， 1. 34 % YNB, 4×10-5%生物素，l％甘油）, 30℃培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1. 34 % YNB, 4×10-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加50μL甲醇。
酶活测定
不同时间取样测定上清酶活，结果显示其上清液最高酶活为600 IU/mL。
序列表
<110> 青岛康地恩生物科技有限公司
<120> 甘露聚糖酶及其突变体
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1008
<212> DNA
<213> 重组序列
<220>
<221> 编码基因
<222> (1)..(1008)
<400> 1
gcacacaccg tttctccggt gaatccgaat gcccagccga cgacgaaagc ggtgatgaac 60
tggcttgccc acctgcccaa tcggacggaa aaccgagtga tgtccggggc attcggagga 120
tacagccttg acacattttc gctggctgaa gccgaccgga tcaaacaagc aacaggacag 180
ctgccagcca tatacggctg cgattatgca aggggatggc tggagccgga agagatcgcc 240
gatacgattg actacagctg caacagcgat ttgatcgcat actggaaaag cggaggcatt 300
ccgcaaatca gcctgcacct cgcaaacccc gcgtttactt cgggtcatta taaaactcag 360
atttcaaaca gccagtatga gagaatttta gattcttcca cgcccgaagg aaaacggctt 420
gaggcgatgc tgagcaaaat cgccgatggc cttcaggagc ttgaaaatga aggcgtgccc 480
gttctattca gaccccttca tgaaatgaac ggcgaatggt tctggtgggg gctgacgcaa 540
tataatcaaa aagacagcgc gagaatctcc ttatacaaac ggctctatgt gaaaatctat 600
gactatatga caaagacaag aggcttggat catctgttgt gggtgtatgc gcctgacgcc 660
aacagagact ttaaaacaga cttttatccg ggcgcatcat atgttgacat cgtcgggctt 720
gacgcttatt ttgatgaccc gcacgccatt gatggctacg atcagctcac atctctgaac 780
aagccgtttg cctttacaga ggtcgggcca cagacgacaa acggcgggct ggattacgcg 840
cggtttatcc atgcaatcaa agagaaatac ccgaatacga cgtacttcct ggcgtggaac 900
gatgggtgga gccctgctgt gaataaggga gcgggcgccc tctatcttca tccatggacg 960
ctgaataagg gagacatctg ggacggcgat tctttgacgc ctgtcgtg 1008
<210> 2
<211> 336
<212> PRT
<213> 重组序列
<220>
<221> 甘露聚糖酶
<222> (1)..(336)
<400> 2
Ala His Thr Val Ser Pro Val Asn Pro Asn Ala Gln Pro Thr Thr Lys
1 5 10 15
Ala Val Met Asn Trp Leu Ala His Leu Pro Asn Arg Thr Glu Asn Arg
20 25 30
Val Met Ser Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Ser Leu Asp Thr Phe Ser Leu
35 40 45
Ala Glu Ala Asp Arg Ile Lys Gln Ala Thr Gly Gln Leu Pro Ala Ile
50 55 60
Tyr Gly Cys Asp Tyr Ala Arg Gly Trp Leu Glu Pro Glu Glu Ile Ala
65 70 75 80
Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn Ser Asp Leu Ile Ala Tyr Trp Lys
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Pro Gln Ile Ser Leu His Leu Ala Asn Pro Ala Phe
100 105 110
Thr Ser Gly His Tyr Lys Thr Gln Ile Ser Asn Ser Gln Tyr Glu Arg
115 120 125
Ile Leu Asp Ser Ser Thr Pro Glu Gly Lys Arg Leu Glu Ala Met Leu
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Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Gln Glu Leu Glu Asn Glu Gly Val Pro
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Val Leu Phe Arg Pro Leu His Glu Met Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp
165 170 175
Gly Leu Thr Gln Tyr Asn Gln Lys Asp Ser Ala Arg Ile Ser Leu Tyr
180 185 190
Lys Arg Leu Tyr Val Lys Ile Tyr Asp Tyr Met Thr Lys Thr Arg Gly
195 200 205
Leu Asp His Leu Leu Trp Val Tyr Ala Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe
210 215 220
Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Ser Tyr Val Asp Ile Val Gly Leu
225 230 235 240
Asp Ala Tyr Phe Asp Asp Pro His Ala Ile Asp Gly Tyr Asp Gln Leu
245 250 255
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Thr Asn Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Arg Phe Ile His Ala Ile Lys Glu
275 280 285
Lys Tyr Pro Asn Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Trp Asn Asp Gly Trp Ser
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Pro Ala Val Asn Lys Gly Ala Gly Ala Leu Tyr Leu His Pro Trp Thr
305 310 315 320
Leu Asn Lys Gly Asp Ile Trp Asp Gly Asp Ser Leu Thr Pro Val Val
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<210> 3
<211> 1008
<212> DNA
<213> 重组序列
<220>
<221> 编码基因
<222> (1)..(1008)
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gcacacaccg tttctccggt gaacccgaat gcccagccga cgacgaaagc ggtgatgtac 60
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gatacgattg actacagctg caaccgtgat ttgatcgcat actggaaaag cggaggcatt 300
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<211> 336
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<221> 甘露聚糖酶
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Claims (8)
1.重组甘露聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12。
2.编码权利要求1所述甘露聚糖酶的DNA分子。
3.权利要求2所述的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11。
4.一种重组表达质粒，其中含有权利要求2或3所述的DNA分子。
5.一种表达宿主，其被权利要求4所述的重组表达质粒转化。
6.权利要求5所述的表达宿主，其选自大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母或芽孢杆菌。
7.权利要求6所述的表达宿主，其中所述的酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
8.权利要求6所述的表达宿主，其中所述的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
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