CN100582224C - 一种纤维糊精酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维糊精酶及其编码基因与应用。本发明提供的纤维糊精酶，其氨基酸残基序列是下述之一：1)自序列表中SEQ ID NO：2的氨基端第26-332位所示的氨基酸残基序列；2)序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列。实验证明本发明的纤维糊精酶具有很高的纤维糊精酶活性(达42019U/g)，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供纤维糊精酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。

Description

一种纤维糊精酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种纤维糊精酶及其编码基因与应用。

背景技术

纤维素主要是植物利用二氧化碳和水在太阳能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×10⁹吨，其中89％尚未被人类利用(Dunlap C，Chiang GC.Utilization and recycle of agriculture wastes and residues.Shuler M L.Boca Raton，Florida.USA：CRC Press Inc.1980.19)。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，包括三类酶即内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖(Tomme P，WarrenR A J，Gi lkes N R.1995.Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi.Adv.Microbiol.Physiol.，37：1-81.1995；Bhat M K，Bhat S.1997.Cellulosedegrading enzymes and their potential industrial applications.BiotechnologyAdvances，15：583-620)。葡萄糖可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食和饲料短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素酶可广泛应用于酿酒、饲料、食品、纺织、造纸等行业。如纤维素酶作为饲料添加剂可增加饲料的可消化性，减少排泄的粪便量。纤维素酶可取代浮石进行牛仔裤的“石洗”处理，也可处理其它含纤维织物以降低粗糙度和增加光亮。纤维素酶可添加到洗涤剂中以提高洗涤剂的清洁能力(Bhat MK.2000.Cellulases and related enzymes in biotechnology.BiotechnologyAdvances，18：355-383)。由于纤维素酶的广泛用途以及针对不同的用途需要使用不同性质的纤维素酶，更由于纤维素酶的效率低、价格高而使以纤维素为原料生产燃料酒精的成本太高以至于无法真正实现产业化，因此，需要新的纤维素酶。

纤维素酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域如碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding modules，CBMs)组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families)(Davies G.，Henrissat B.1995.Structures and mechani sms of glycosyl hydrolases.Structure 3：853-859；Henrissat B.1991.A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.280：309-316；Henrissat B.，Bairoch A.1993New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities.Biochem.J.293：781-788；Henrissat B.，BairochA.1996.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696)。根据Cazy服务器(server)(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有108个家族，纤维素酶分属于糖基水解酶类家族1、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。将未知的纤维素酶与已知的纤维素酶做序列同源性比较可对其进行分类。

纤维糊精酶(EC 3.2.1.74，cellodetrinase)被定义为外切纤维素酶的一种，该酶主要作用于纤维素寡糖，以连续的方式从纤维素寡糖的还原端或非还原端释放葡萄糖或纤维二糖(Lynd L R.，Weimer P J，van Zyl W H and PretoriusIS.Microbialcellulose utilization：fundamentals and biotechnology.2002.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：506-577)。纤维糊精酶能水解硝基苯酚纤维二糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-cellobioside，p-NPC)而产生从无色变成黄色的颜色反应，还能水解4’甲基伞形纤维二糖苷(4-methylumbelliferylbeta-D-cellobioside，4-MUC)而产生荧光反应，所以4-MUC经常作为筛选纤维糊精酶的底物，p-NPC作为测定纤维糊精酶酶学特性的底物。

人类所克隆的大部分纤维素酶基因都是从纯培养的微生物中来的，但并不是自然界中所有微生物都是可以被分离、培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1％(Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H.1995.Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbiol.Rev.59：143-169)，那么剩余的99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离基因已是成熟技术(Lorenz P，Schleper C.2002.Metagenome-achallenging source of enzyme discovery.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic19-20：13-19)。目前世界上已克隆得到来源于不同环境的未培养微生物的纤维素酶基因，其中包括Healy等(Healy F G，Ray R M，Aldrich H C，Wilkie A C，Ingram L Oand Shanmugam K T.1995.Direct isolation of functional genes encoding cellulases fromthe microbial consortia in a thermophilic，anaerobic digester maintained on lignocellulose.Appl Microbiol Biotechnol.43：667-674.)报道从厌氧高温木头堆里克隆到了一个纤维素酶基因；Rees等(Rees HC，Grant S，Jones B，Grant WD，Heaphy S.2003.Detectingcellulase and esterase enzyme activities encoded by novel genes present in environmentalDNA libraries.Extremophiles.7(5)：415-421)报道从湖水和湖床沉积物未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(Voget S，Leggewie C，Uesbeck A，Raasch C，Jaeger KE，Streit WR.2003.Prospecting for novel biocatalysts in asoil metagenome.Appl Environ Microbiol.，69(10)：6235-6242；Voget S，Steele H L，andStreit W R.2006.Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase.J.Biotechnol.126：26-36)报道从土壤未培养微生物中克隆到3个纤维素酶基因gnuB、uvs080和cel5A；Ferrer等(Ferrer M，Golyshina OV，Chernikova T N，Khachane A N，Reyes-Duarte D，Santos V A，Strompl C，Elborough K，Jarvis G，Neef A，Yakimov M M，Timmis K N，and Golyshin P N.2005.Novel hydrolase diversity retrieved from ametagenomic library of bovine rumen microflora.Environ Microbiol.7：1996-2010)从牛瘤胃未培养微生物中鉴定了9个纤维素酶基因。Feng等(Feng Y，Duan CJ，Pang H，MoXC，Wu CF，Yu Y，Hu YL，Wei J，Tang JL，and Feng JX.2007.Cloning and identificationof novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum andcharacterization of the expressed cellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol.75：319-328)从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了11个纤维素酶基因。这些来源于未培养微生物宏基因组的纤维素酶基因从序列上来说都是新的，说明宏基因组方法是得到新基因的好方法。反刍动物的瘤胃是自然界中纤维素降解最剧烈的主要场所之一，植物的纤维素类物质是被瘤胃中共生的纤维素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、细菌、原生动物和古细菌。目前研究认为瘤胃中有85％的微生物是未培养的(KrauseD O，Denman S E，Mackie R I，Morrison M，Rae A L，Attwood G T，and McSweeney C S.2003.Opportunities to improve fiber degradation in the rumen：microbiology，ecology，and genomics.FEMS Microbiol Rev 27：663-693)，可以推测这些未培养微生物中一定含有大量的基因资源如纤维素酶基因资源，通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库，极有可能从中筛选得到比目前已知的最好的纤维素酶还要好的酶的基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维糊精酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的纤维糊精酶，名称为Umcel5C，来源于水牛瘤胃未培养细菌，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)自序列表中的SEQ ID№.2的氨基端第26-332位氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID №.2的氨基端第26-332位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维糊精酶活性的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由332个氨基酸残基组成。自序列2的氨基端的第36-317位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。Umcel5C同栖瘤胃黄色瘤胃球菌的(Ruminococcus flavefaciens)的纤维糊精酶(GenBank索引号P16169)的同源性最高，两者的相似性为70％、相同性为52％。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的Umcel5C便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLI SEEDL

上述(b)中的Umcel5C可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Umcel5C的编码基因可通过将序列表中SEQ ID№：1的自5′端第231至1229位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述纤维糊精酶编码基因(umcel5C)也属于本发明的保护范围。

上述纤维糊精酶的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中SEQ ID №.1的5′端第306-1226位核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №.1的核苷酸序列；

3)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的序列1由1807个脱氧核苷酸组成，自序列1的5’端的第231至1229位核苷酸为umcel5C的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自序列1的5’端的第231-233位核苷酸为umcel5C基因的起始密码子ATG，自序列1的5’端的第1227-1229位核苷酸为umcel5C基因的终止密码子TAA。序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2的核苷酸序列。自序列表中序列1的5′端第306-1226位核苷酸序列编码自序列表中的序列2的氨基端第26-332位氨基酸残基序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的纤维糊精酶活性平板检测筛选法，得到了新的纤维糊精酶基因，该纤维糊精酶基因可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该纤维糊精酶，用于纤维素的降解，实验证明本发明的纤维糊精酶具有很高的纤维糊精酶活性(达42019U/g)，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供纤维糊精酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。

附图说明

图1为从水牛瘤胃内容物样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。

图2为水牛瘤胃未培养微生物基因文库克隆的限制性内切酶BamHI酶切分析图。

图3为瘤胃未培养微生物基因文库中表达MUCase酶(纤维糊精酶)活性克隆的筛选，阳性克隆EPI100/pGXNDM1所在的平板图。

图4为能降解4-MUC的文库克隆质粒pGXNDM1的BamHI酶切带型。

图5为初筛获得的重组质粒pGXNDM1转化大肠杆菌后得到的转化子对4-MUC降解水解圈照片。

图6为表达质粒pET-umcel5C重组质粒经EcoRI和HindIII双酶切后电泳图。

图7为重组大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5C和大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-30a羧甲基纤维素降解检测。

图8umcel5C基因的表达、表达产物Umcel5C的纯化及活性胶检测。

图9Umcel5C在不同pH值条件下的酶相对活力曲线。

图10Umcel5C在不同温度条件下的酶相对活力曲线。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI100(购自Epicentre公司)；表达菌株Rosetta^TM(DE3)(购自Novagen公司)；柯斯质粒载体pWEB::TNC(购自Epicentre公司)；文库制备试剂盒(购自Epicentre公司，pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)；表达载体pET-30a(购自Novagen公司)；限制性内切酶、修饰酶、对硝基苯酚纤维二糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-cellobioside，p-NPC)及4’甲基伞形纤维二糖苷(4-methylumbelliferylbeta-D-cellobioside，4-MUC)等试剂购自Promega、TAKARA、SIGMA或MBI。

实施例1、纤维糊精酶Umcel5C及其编码基因的获得

一、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建

1、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的提取

取50g水牛瘤胃内容物(样品的来源为南宁市肉联厂刚屠宰的水牛的瘤胃，采集的样品立即用液氮保存)，悬浮在200ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，轻轻震荡均匀，放置10分钟，让瘤胃内容物中的纤维素颗粒自动沉淀，弃上清液，再加入200ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH6.5)洗沉淀块两次，最后一次的沉淀块用直接提取法提取吸附于纤维素颗粒的微生物的宏基因组DNA。在沉淀块中加入100ml提取缓冲液(100mM sodium phosphate pH8.0；100mM Tirs-HCl pH8.0；100mM EDTA pH8.0；1.5M NaCl；1％CTAB；2％SDS)混合均匀，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次后，加入2ml的溶菌酶(20mg/ml)溶液(溶菌酶终浓度为0.4mg/ml)37℃水浴1小时，期间每10分钟颠倒混匀一次，然后加入2ml的蛋白酶K(50mg/ml)溶液(蛋白酶K终浓度为1mg/ml)37℃水浴1小时，期间每10分钟颠倒混匀一次。加入40ml PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone)溶液(购自Sigma公司，目录号P-6755)(PVPP溶液：每100mg PVPP与1ml 0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)混匀)，振荡30秒，再加入2ml 3M CaCl₂溶液，振荡30秒后，在Beckman Coulter Avanti J-E离心机(购自Beckman Coulter公司，目录号369003)JA-10转头用8,000g室温离心20分钟，上清液转移到另一个干净的离心管。在沉淀物中再加入100ml提取缓冲液，混合均匀，在65℃放置60分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，8,000g离心20分钟，合并两次的上清液。在上清液中加入等量的氯仿，上下颠倒离心管混匀，8,000g离心10分钟，取上清入另一个离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，用灭菌的Tip头挑出絮状DNA，用70％乙醇洗两次，于室温中晾干，用5ml TE溶解。

2、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的纯化获得30kb以上的DNA

将DNA粗提物加到Sephadex G200(购自Pharmacia公司，目录号17-0080-01)的层析柱(200mm×10mm，含有2％PVPP(购自Sigma公司，目录号P-6755)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分1ml分段收集洗脱液，每一组分加入100μl的3M醋酸钠溶液(pH5.2)及1ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7％琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA，回收纯化的DNA电泳图如图1所示，其中泳道1为λDNA(48.5kb)；泳道2为λDNA用EcoRI酶切(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道3为从水牛瘤胃内容物提取的DNA粗提物；泳道4为经过SephadexG-200凝胶初步纯化的DNA；泳道5为经过电洗脱法回收得到的30kb以上的DNA。

3、纯化获得30kb以上的末端补平的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组

为了用上述电洗脱法回收纯化的DNA制作基因文库，首先对这些DNA进行末端补平，以产生平头末端而和文库制备试剂盒(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)中已处理好的同样具平头末端的pWEB::TNC载体相连，具体方法为：依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：6μl 10×末端修补缓冲液(330mM Tris-醋酸(pH7.8)，660mM醋酸钾，100mM醋酸镁，5mM DTT)，6μl 2.5mM dNTP混合物(每种dnNTP2.5mM)，6μl 10mM ATP，10ug 30kb以上的DNA，2μl末端修补酶混合物(T₄DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmidcloning kit，目录号WEBC931)，加灭菌的去离子水补充到总体积60ul。25℃下放置45分钟，再转移到70℃水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收。

4、末端补平后的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组与pWEB::TNC的连接反应

将上述末端补平后回收的DNA片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的pWEB::TNC载体在T₄DNA连接酶的作用下连接起来，具体方法为：依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：12μl无菌水，2μl 10倍快速连接缓冲液(10×Fast-Link Ligation Buffer)，1μl 10mM ATP，1μl pWEB::TNC载体(0.5μg)，3μl低熔点琼脂糖凝胶回收的30kb-45kb的DNA(0.1μg/μl)，1μl快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase，2单位/μl)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)，混匀后在25℃下放置2个小时，再在70℃放置10分钟以终止酶反应。

5、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的获得及质量检验

连接反应产物用λ包装蛋白包装，具体方法为：将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)的一个组分，总共50ul/管)25μl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10μl连接反应产物，充分混匀后置于30℃90分钟后，再往其中加入另外25μl溶化的λ包装提取物，充分混匀后置于30℃90分钟，向其中加入500μl噬菌体稀释缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)，100mM NaCl，10mM MgCl₂)，得到560μl包装反应产物。

再将上述得到的560μl包装反应产物加入到5.6mL的OD₆₀₀＝1.0的宿主大肠杆菌EPI100培养液(培养基为LB(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；pH7.0)+10mM MgSO₄)中，25℃下放置20分钟让上述得到的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞E.coli EPI100，在含氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)和氯霉素(终浓度为12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白胨(0xoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；琼脂粉，15g，pH7.0)上筛选转导子。结果共获得约15,000个转导子，任意提取14个克隆的质粒DNA，限制性内切酶BamHI酶切后用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果所有质粒除都有一个5.8kb的载体片段外，都含有插入片段，且没有发现有两个质粒具有相同的酶切带型，酶切结果如图2所示，其中泳道1为λDNA用EcoRI酶切片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；其它泳道分别为使用限制性内切酶BamHI酶切的文库克隆质粒。结果表明文库含有非常随机的插入DNA片段，插入片段最大的为42kb，最小的为22kb，平均大小为35kb。说明文库的克隆容量也是相当大的，文库的质量相当好。

二、纤维糊精酶及其编码基因(umcel5C)的获得

1、从水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组文库中筛选表达纤维糊精酶活性的克隆

用平板影印法将步骤一中在含氨苄青霉素和氯霉素的LA平板上得到的文库(每平板约200个菌落左右)分别影印到含氨苄青霉素(终溶度100μg/mL)和氯霉素(终溶度12ug/ml)的LA平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养36小时后，在培养好的LA平板的菌落的上面加入2ml含有质量百分浓度为0.04％4-methylumbelliferylbeta-D-cellobioside(4-MUC)的0.6％的琼脂糖，继续在37℃培养1小时，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光。

结果如图3所示，箭头所指的菌落为周围有荧光的克隆。结果表明筛选到1个菌落周围有水荧光的克隆(EPI100/pGXNDM1)，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pGXNDM1，用限制性内切酶BamHI完全酶切pGXNDM1后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4所示，结果表明pGXNDM1除有一个5.8kb的载体片段外，还有另外11条BamHI酶切片段，大小分别为7.0kb，3.5kb，3.1kb，3kb，2.7kb，2.5kb，1.6kb，1.3kb，1.2kb，1kb和0.5kb。其中1.6kb，1.3kb分别是两个片段的重叠，结果表明pGXNDM1含有31.8kb的插入片段。其中，图4中，泳道1为λ用EcoRI酶切后的片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp)；泳道3为pGXNDM1的BamHI酶切产物(从上至下分别为7.0kb，3.5kb，3.1kb，3kb，2.7kb，2.5kb，1.6kb，1.3kb，1.2kb，1kb和0.5kb)。

为了证实pGXNDM1的插入片段确实含有纤维糊精酶基因，用pGXNDM1质粒DNA和空载体pWEB::TNC分别转化E.coliEPI100，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选转化子，随机挑取由每个质粒转化得到的10个转化子点接到LA平板上，37℃培养24小时后，在培养好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04％4-MUC的0.6％的琼脂糖，继续在37℃培养1小时，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光，结果表明所有10个由空载体pWEB::TNC转化得到的转化子周围都没有荧光，所有10个由pGXNDM1转化得到的转化子周围都有荧光，其中一个转化子的检测结果如图5所示。结果表明重组质粒pGXNDM1的插入片段上确实含有纤维素酶基因。图5中，右边的菌落为初筛获得的重组质粒pGXNDM1转化大肠杆菌后得到的转化子(降解4-MUC)，左边的菌落为空载体pWEB::TNC转化大肠杆菌后得到的转化子(不能降解4-MUC)。

2、纤维糊精酶及其编码基因(umcel5C)的获得

为了测定重组质粒pGXNDM1上纤维糊精酶基因的DNA序列，采用亚克隆的方法对该基因进行定位。使用限制性内切酶PstI对重组质粒pGXNDM1进行了亚克隆。亚克隆的步骤：取质粒pGXNDM1用PstI完全酶切后加入连接酶在25℃连接一个小时(在pGXNDM1完全酶切后，该重组质粒含有的载体pWEB::TNC的5.0kb的部分可以利用来克隆各个外源PstI片断)。连接产物用化学法转化大肠杆菌XL1-Blue，涂布在含氯霉素(终浓度34ug/ml)的LA平板上。在培养好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04％4MUC的0.6％的琼脂糖，继续在37℃培养1小时，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光。任意挑选24个有荧光反应的转化子，提取质粒做PstI酶切分析，其中一个重组质粒只有一条1.7kb的外源片段，将此质粒命名为pGXNDM1-17。将1.7kb片段回收与经PstI酶切的pGEM3zf(+)连接，连接产物用化学法转化大肠杆菌XL1-Blue，涂布在含氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)的LA平板上。在培养好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04％4-MUC的0.6％的琼脂糖，继续在37℃培养1小时，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光，任意挑选24个有荧光反应的转化子，提取质粒做PstI酶切分析，所有有荧光活性的转化子的重组质粒都有1.7kb的外源片段，最后将目的基因定位在1.7kb的PstI片断上，将含有该1.7kb片段的重组质粒命名为pGXNP17。

将该重组质粒pGXNP17寄送大连宝生物工程公司采用双脱氧核苷酸法对该亚克隆进行双向双链测序。测序结果用软件DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，得到纤维糊精酶的编码基因，该基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，命名为umcel5C。序列表中的序列1由1807个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5′端的第231至1229位核苷酸为umcel5C的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，由999个核苷酸组成，自序列1的5′端的第231-233位核苷酸为umcel5C基因的起始密码子ATG，自序列1的5′端的1227-1229位核苷酸为umcel5C基因的终止密码子TAA。。

纤维糊精酶基因umcel5C编码一个含332个氨基酸的蛋白质Umcel5C，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为38376.23道尔顿，等电点pI为4.9。用简单组件结构研究工具(Simple ModularArchitecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析纤维糊精酶Umcel5C的组件结构，结果是自序列2的氨基端的第36-317位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。Umcel5C与黄色瘤胃球菌的(Ruminococcus flavefaciens)的纤维二糖苷酶(GenBank索引号P16169)的同源性最高，两者的相似性为70％、相同性为52％。

实施例2、Umcel5C在大肠杆菌中的表达

1、可表达umcel5C的重组载体(pET-umcel5C)的构建

带有编码信号肽的基因在体内表达后很有可能将表达产物分泌到细胞外。为避免表达产物分泌到细胞外，只需要人工合成序列1的自5′端第306位至1226位碱基(即umcel5C基因中除编码序列2的氨基端前25位氨基酸和终止密码子外的DNA序列，主要是防止前25位氨基酸形成信号肽)，921bp，预计其编码蛋白的分子量为35.39691KDa，等电点pI为4.65。

人工合成umcel5C基因除了编码序列2的氨基端前25位氨基酸和终止密码子以外的全部序列(即自序列1的5′端第306-1226位核苷酸序列)，合成umcel5C基因两端带有EcoRI和HindII酶切位点，将合成后并测序表明正确的umcel5C基因片段用EcoRI和HindIII酶切后，插入载体pET-30a(+)(购自Novagen公司)的EcoRI和HindIII位点间，得到重组表达载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将酶切和测序表明含有umcel5C基因编码序列的正确的重组载体命名为pET-umcel5C。起始密码子和终止密码子由表达载体pET30a(+)提供。表达产物的N端有一个由表达载体提供的His标签(6×His Tag)。其中，pET-umcel5C重组质粒的酶切电泳图谱如图6所示，图6中可以看到重组质粒经EcoRI和HindIII双酶切后释放出一条5.3kb的载体带和一条与人工合成umcel5C基因经EcoRI和HindIII酶切后同样大小的921bp外源插入片段。图6中，泳道1为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；泳道2为重组质粒经EcoRI和HindIII双酶切后结果。

2、umcel5C基因在E.coli Rosetta^TM(DE3)中的表达

把pET-umcel5C转化至E.coli Rosetta^TM(DE3)中得到含有pET-umcel5C的转化子RosettaTM(DE3)/pET-umcel5C，挑取Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5C单菌落于LA平板上(含氯霉素34μg/mL，卡那霉素25μg/ml，IPTG 1.0mmol/L)，同时用RosettaTM(DE3)/pET-30a(转入pET-30a的Rosetta^TM(DE3))作为空白对照，37℃培养24小时。菌体经氯仿破壁后用含0.04％4-MUC的0.6％琼脂糖覆盖再培养1小时，在紫外灯下观察菌落周围有无荧光。

结果如图7所示，结果表明重组菌Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5C周围有荧光，而空白对照Rosetta^TM(DE3)/pET-30a周围无荧光，说明靶基因umcel5C在E.coliRosetta^TM(DE3)中已经高效表达出了有纤维素(4-MUC)降解活性的蛋白质产物。图7中右边的菌落为重组大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5C(能降解4-MUC)，左边的菌落为含有空载体的大肠杆菌RosettaTM(DE3)/pET-30a(不能降解4-MUC)。

3、Umcel5C的表达和纯化

1)RosettaTM(DE3)/pET-umcel5C菌体发酵

接种RosettaTM(DE3)/pET-umcel5C到10ml含有34μg/ml氯霉素(CAM)与25μg/ml卡那霉素LB培养液中，37℃200rpm培养过夜。取5ml过夜培养物到100ml含有34μg/ml氯霉素(CAM)与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，在37℃培养200rpm培养至OD₆₀₀为0.6。加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养5个小时，5,000g离心收集菌体。共作2瓶样品，收集200ml的培养液的菌体。

2)Umcel5C的提取与纯化

在步骤1)收集获得的菌体中，按每克菌体重量加入5ml的裂解缓冲液(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole(咪唑)，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH8.0)，悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400w作用20次，每次作用时间10s，每次作用间隔12s。12,000g离心20分钟，收集上清得到Umcel5C粗酶液。取5ul用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。

Umcel5C的纯化使用Qiagen公司的The QIAexpressionist kit试剂盒(方法参照试剂盒说明书)。按每4ml上述获得的裂解上清液加入1ml质量百分含量为50％的NI-NTA胶体，在4℃用200rpm摇60分钟，混合物灌注到The QIAexpressionist kit试剂盒附带的柱子。加4ml洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mMimidazole，1mM PMSF，pH8.0)到柱子里，缓慢搅拌，重复冲洗6次。加入0.5ml的洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，1mM PMSF，pH8.0)，收集流出物，重复洗脱8次。合并8管蛋白质，即为镍柱纯化后的Umcel5C，取5ul用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。

结果如图8所示，结果显示umcel5C基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达产物Umcel5C分子量为40kDa左右，与预计的分子量基本一致，粗酶液经镍柱纯化后，已去掉绝大部分杂蛋白，SDS-PAGE显示还有一条杂蛋白。

选择Sephadex G-100对Umcel5C进行进一步的纯化，取5g Sephadex G-100于100ml去离子水中，室温放置72小时或沸水煮沸5小时，备用；取一长为40cm，内径为1cm的层析柱，洗净，柱子下端用具有滤过功能的海绵球堵住，向柱内装入1/4体积的pH为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后将溶胀好的Sephadex G-100装入柱内。用pH为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡柱内Sephadex G-100；取1ml经镍柱纯化的Umcel5C沿管壁加在胶面上，用pH为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，按0.5ml每管收集洗脱液即得到分子筛纯化后的Umcel5C。每管洗脱液取5ul检测蛋白质纯度。

结果如图8所示，结果表明经分子筛(Sephadex G-100)纯化后，Umcel5C已达到SDS-PAGE单条纯。

为了检测纯化的Umcel5C是否还有纤维糊精酶活性，用活性胶染色法进行了检测，过程如下。首先Umcel5C在聚丙烯酰胺变性胶上进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，然后对电泳后在变性胶中已变性的Umcel5C进行复性处理。复性处理：把电泳后的变性胶浸入在50ml的复性缓冲液中(复性缓冲液的配制：Tris 3.025g，0.5M EDTA(pH 8.0)5ml，β-巯基乙醇0.173ml，加水至总体积500ml)，4℃下浸泡30分钟，更换复性缓冲液，重复三次，前两次在复性缓冲液中添加0.5ml的异丙醇。再用10mM pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗胶两次。把处理好的复性胶置于干净的培养皿上，滴加1ml浓度为1.25mM的pNPC溶液，用玻璃棒涂均匀，用塑料袋包裹平板，在37℃保温1小时。直接在胶上观察水解带。可以见到在复性胶的Umcel5C的位置有一条黄色的带，活性胶检测表明该目标带具有纤维糊精酶活性，说明Umcel5C是按正确的阅读框架表达的。图8中M为分子量标准(marker)；1为umcel5C基因的表达的粗酶液2为镍柱纯化后Umcel5C；3为Sephadex G100柱纯化的Umcel5C；4为Umcel5C的活性胶检测

4、Umcel5C酶学特性的研究

纤维糊精酶的酶活测定，具体操作如下：

(1)对硝基苯酚(p-NP)浓度标准曲线的制作

①用去离子水配制10mM的p-NP标准液。

②在试管中按表1加入溶液。

表1.p-NP浓度标准样的制备

编号	1	2	3	4	5	6
							p-NP标准液(μl)	0	10	20	30	40	50
去离子水(μl)	1000	990	980	970	960	950
							p-NP 浓度(mM)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5

③取各浓度标准溶液140μl加入1.5ml的离心管，分别加入70ul 0.4M的Na₂CO₃溶液，用移液枪小心吸打混匀，避免出现气泡。

④取200μl溶液加入96孔酶标板，用酶标仪测410nm下的吸光值，绘制标准曲线，保存在测定程序中。

(2)纤维糊精酶活力测定

①配制25mM的p-NPC水溶液作为底物，用小管分装，管外用铝箔包裹避光，保存于-20℃冰箱。

②取特定pH值(pH为6.0)的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液116μl，加入14μl步骤①制备的底物，置于45℃温度的水浴锅中预热2分钟，加入10μl步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5C酶液(Umcel5C终浓度为0.777ug/ml)，同预热温度一致保温反应15分钟。

③反应结束后，立即加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液，终止反应。

④取200μl溶液加入96孔酶标板，用酶标仪测410nm下的吸光值，根据步骤(1)绘制的p-NP标准曲线计算反应体系中产生的p-NP浓度。按照下述酶活力和比活力定义计算Umcel5C的活力和比活力。

酶活力单位(U)定义：1U为每分钟催化产生1μmol p-NP所需的酶量。

比酶活的定义：每g蛋白质所含的酶活力(U/g)。

结果表明，Umcel5C在最适pH(pH为6.0)和最适温度(45℃)的条件下的酶比活为42019U/g。

(3)酶的最适pH值的测定

分别取pH值为3～7.5(梯度为0.5)的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液116μl，分别加入14μl底物(25mM的p-NPC水溶液)，置于温度为37℃的水浴锅中预热2分钟，加入10μl步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5C酶液(Umcel5C终浓度为0.777ug/ml)，37℃保温反应15分钟。反应结束后，立即加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液，终止反应。按照步骤(2)的方法计算酶活力和比活力，在37℃的反应条件下，Umcel5C在pH 6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力。

结果如图9所示，结果表明Umcel5C的最适pH为6.0。

(4)酶的最适温度的测定

在Umcel5C的最适pH6.0条件下测定不同温度下(30℃～60℃)的酶活。具体方法为：取pH值为6.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液116μl，分别加入14μl底物(25mM的p-NPC水溶液)，共配制6份，分别置于温度为30℃～60℃的水浴锅中预热2分钟，加入10μl步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5C酶液(Umcel5C终浓度为0.777ug/ml)，分别于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃保温反应15分钟。反应结束后，立即分别加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液，终止反应。按照步骤(2)的方法计算酶活力和比活力。在pH值为6.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中反应条件下，Umcel5C在45℃时比活力最高，以此为100％，换算各温度下的相对酶活力。结果如10所示，结果表明Umcel5C对pNPC的最适温度为45℃。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1807

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

ctgcagaatt acaacatcgt gggacatgtg acgtggacgc aggcgatcct cgaggccacc    60

tggtccggtt ccgccgccgc ggaagaggcg gaggacaccg cggaggggat cgcggaggac    120

gcgccccagg tcacggacga ctgatttccc ggcggcccgc tcccgaaagg gggcgggtcc    180

tttcatgttc ttcggccgtc ccctgtacaa aaggcgcggg atgtgttatc atggaagcac    240

atggaagaac cggccagtgg aatgaaccgg accgacagac gaaaaggaga agagctatgg    300

caaacggatt cggaatcatg cgcggcgtga acctcggcgg atggctttcc cagtgcagcg    360

gggagaccga gcatctcgac accttcatcc gggaggagga catcgcccgg atcgcctcct    420

gggggatgga ccatgtgcgc ctccccgtcg actatgacgt cctggcgcgc gacgacggct    480

tcgaccgcgt ggacgaggcg atcggctggt gccgcaagaa cggcctgaag ctggtcctgg    540

acctgcacaa gaccgccggc ttctccttcg acgccggcga aaacgagagc ggcttcttcg    600

acagcgcgga ctaccaggag cagttctaca gcctctggga gcggctggcc gcccgcttcg    660

gctccctgta tgaggacgtg gccttcgagc tcctcaacga ggtgacggat taccgctaca    720

tggcgacctg gaaccgcatc gccgtcgagt gcatccggcg catccggccc atcgccccgc    780

agacgtggat cctcttcggc ggctacgaca acaacgcgcc ttacgccgtg cccaccctcg    840

aggtgccgga cgacgagcgg atcatcctca acctccactg ctacatgccc gtggagttca    900

cccaccaggg cgcctactgg gtgccgtggc tcaaccgcga ggaccgcgtc tcctacgagg    960

cgtccggcgc gacggaggag tatttcgagg gcattttcca cccggcggtg ttctgcgcgt    1020

ggaggaccgg ccgctccctg tactgcggcg agtacggcgt catcgacatc gcctccccgg    1080

aggacaccct gcgctggtac cgcgccatcc acgccgtctt cgagcgccac ggcatcgccc    1140

gctgcgcctg gagctacaag gccatggact tcggcctcgg cgatccccgg atggacggcg    1200

tgcgggatga gctgatcaag ctgctgtgac cgcgggctga gggtgtccgc cgcggcggat    1260

cgcccgaaca gcgccggaga gaccgggacg gaaccgcccc gtcgaggaag gatttgcgct    1320

tcacccgcgc aaagtccttc ctttttttcg gttcttgtga taggattatc ctgcgggcgg    1380

agggcctttt cgcccgcgga acgatcccga aaaaagcgag ggaacaggca tgaacagctc    1440

agtcatccag gcggtggacg ccatcctcag cgattattcc caggggcggc tcatcgaccg    1500

tctccagatg ccgcaccggc ccgacaagga ggtcgtgtac gacctgctcg accagctctt  1560

ctcgatcctc tattacggct attacccctg cccgggccgc ctggcggacg accccgccga  1620

aggcctgcgg atgaccgtgg aggacgccat gatgcgcatg cggcatctgg tgatcagcgc  1680

cctgcccggg gacgcgcgct atgccagctg gtccacggcg gagctctcgg aggaggccgc  1740

cgagatcacc gacgcctttt tccgcgcgat tccctccgtg cgcgccctgc tgatgacgga  1800

cctgcag                                                            1807

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223>

<400> 2

Met Glu Ala His Gly Arg Thr Gly Gln Trp Asn Glu Pro Asp Arg Gln

1               5                   10                  15

Thr Lys Arg Arg Arg Ala Met Ala Asn Gly Phe Gly Ile Met Arg Gly

            20                  25                  30

Val Asn Leu Gly Gly Trp Leu Ser Gln Cys Ser Gly Glu Thr Glu His

        35                  40                  45

Leu Asp Thr Phe Ile Arg Glu Glu Asp Ile Ala Arg Ile Ala Ser Trp

    50                 55                   60

Gly Met Asp His Val Arg Leu Pro Val Asp Tyr Asp Val Leu Ala Arg

65                  70                  75                  80

Asp Asp Gly Phe Asp Arg Val Asp Glu Ala Ile Gly Trp Cys Arg Lys

                85                  90                  95

Asn Gly Leu Lys Leu Val Leu Asp Leu His Lys Thr Ala Gly Phe Ser

            100                 105                 110

Phe Asp Ala Gly Glu Asn Glu Ser Gly Phe Phe Asp Ser Ala Asp Tyr

        115                 120                 125

Gln Glu Gln Phe Tyr Ser Leu Trp Glu Arg Leu Ala Ala Arg Phe Gly

    130                 135                 140

Ser Leu Tyr Glu Asp Val Ala Phe Glu Leu Leu Asn Glu Val Thr Asp

145                 150                 155                 160

Tyr Arg Tyr Met Ala Thr Trp Asn Arg Ile Ala Val Glu Cys Ile Arg

                165                 170                 175

Arg Ile Arg Pro Ile Ala Pro Gln Thr Trp Ile Leu Phe Gly Gly Tyr

            180                 185                 190

Asp Asn Asn Ala Pro Tyr Ala Val Pro Thr Leu Glu Val Pro Asp Asp

        195                 200                 205

Glu Arg Ile Ile Leu Asn Leu His Cys Tyr Met Pro Val Glu Phe Thr

    210                 215                 220

His Gln Gly Ala Tyr Trp Val Pro Trp Leu Asn Arg Glu Asp Arg Val

225                 230                 235                 240

Ser Tyr Glu Ala Ser Gly Ala Thr Glu Glu Tyr Phe Glu Gly Ile Phe

                245                 250                 255

His Pro Ala Val Phe Cys Ala Trp Arg Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Cys

            260                 265                 270

Gly Glu Tyr Gly Val Ile Asp Ile Ala Ser Pro Glu Asp Thr Leu Arg

        275                 280                 285

Trp Tyr Arg Ala Ile His Ala Val Phe Glu Arg His Gly Ile Ala Arg

    290                 295                 300

Cys Ala Trp Ser Tyr Lys Ala Met Asp Phe Gly Leu Gly Asp Pro Arg

305                 310                 315                 320

Met Asp Gly Val Arg Asp Glu Leu Ile Lys Leu Leu

                325                 330

Claims (8)

1、一种纤维糊精酶，其氨基酸残基序列是下述之一：

1)自序列表中SEQ ID NO：2的氨基端第26-332位所示的氨基酸残基序列；

2)序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列。

2、权利要求1所述的纤维糊精酶的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述纤维糊精酶的编码基因是下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第306-1226位所示的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述的纤维糊精酶编码基因的重组表达载体。

5、含有权利要求2或3所述的纤维糊精酶编码基因的转基因细胞系。

6、含有权利要求2或3所述的纤维糊精酶编码基因的宿主菌。

7、权利要求1所述的纤维糊精酶在纤维素降解中的应用。

8、权利要求2或3所述的纤维糊精酶编码基因在纤维素降解中的应用。

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