CN101338307B

CN101338307B - 一种纤维素酶和它的编码基因与应用

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Publication number: CN101338307B
Application number: CN2008101167980A
Authority: CN
Inventors: 冯家勋; 刘利; 段承杰; 封毅; 唐纪良
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2028-07-17
Also published as: CN101338307A

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶及其编码基因与应用。该纤维素酶是是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2的氨基酸残基序列；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维素酶活性的蛋白质。该纤维素酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。该纤维素酶具有很高的对底物p-NPC的活性达192U/mg，能使CMC液化，较适合偏酸性的环境，是个中温性的酶，对pH值的适应范围非常广。EDTA螯合了溶液中的金属离子后，可使其酶活提高。

Description

一种纤维素酶和它的编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶和它的编码基因与应用。

背景技术

纤维素主要是植物利用二氧化碳和水在太阳能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×109吨，其中89％尚未被人类利用(Dunlap C，Chiang G C.Utilization andrecycle of agriculture wastes and residues.Shuler M L.Boca Raton，Florida.USA：CRCPress Inc.1980.19)。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，包括三类酶即内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖(Tomme P，Warren R A J，Gilkes N R.1995.Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi.Adv.Microbiol.Physiol.，37：1-81.1995；Bhat M K，Bhat S.1997.Cellulose degrading enzymes and theirpotential industrial applications.Biotechnology Advances，15：583-620)。葡萄糖可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食和饲料短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素酶可广泛应用于酿酒、饲料、食品、纺织、造纸等行业。如纤维素酶作为饲料添加剂可增加饲料的可消化性，减少排泄的粪便量。纤维素酶可取代浮石进行牛仔裤的“石洗”处理，也可处理其它含纤维织物以降低粗糙度和增加光亮。纤维素酶可添加到洗涤剂中以提高洗涤剂的清洁能力(Bhat M K.2000.Cellulases and related enzymes in biotechnology.BiotechnologyAdvances，18：355-383)。由于纤维素酶的广泛用途以及针对不同的用途需要使用不同性质的纤维素酶，更由于纤维素酶的效率低、价格高而使以纤维素为原料生产燃料酒精的成本太高以至于无法真正实现产业化，因此，需要新的纤维素酶。

纤维素酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域如碳水化合物结合组件(carbohydrate-bindingmodules，CBMs)组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families)(Davies G.，Henrissat B.1995.Structures and mechanisms ofglycosyl hydrolases.Structure 3：853-859；Henrissat B.1991.A classification of glycosylhydrolases based on amino-acid sequence similarities.Biochem.J.280：309-316；HenrissatB.，Bairoch A.1993 New families in the classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities.Biochem.J.293：781-788；Henrissat B.，Bairoch A.1996.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696)。根据Cazy服务器(server)(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有108个家族，纤维素酶分属于糖基水解酶类家族1、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。将未知的纤维素酶与已知的纤维素酶做序列同源性比较可对其进行分类。

人类所克隆的大部分纤维素酶基因都是从纯培养的微生物中来的，但并不是自然界中所有微生物都是可以被分离、培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1％(Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H.1995.Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbiol.Rev.59：143-169)，那么剩余的99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离基因已是成熟技术(Lorenz P，Schleper C.2002.Metagenome-a challengingsource of enzyme discovery.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 19-20：13-19)。目前世界上已克隆得到来源于不同环境的未培养微生物的纤维素酶基因，其中包括Healy等(Healy F G，Ray R M，Aldrich H C，Wilkie A C，Ingram L O and Shanmugam KT.1995.Direct isolation of functional genes encoding cellulases from the microbialconsortia in a thermophilic，anaerobic digester maintained on lignocellulose.ApplMicrobiol Biotechnol.43：667-674.)报道从木质纤维降解的厌氧环境中克隆到了一个纤维素酶基因；Rees等(Rees HC，Grant S，Jones B，Grant WD，Heaphy S.2003.Detectingcellulase and esterase enzyme activities encoded by novel genes present in environmentalDNA libraries.Extremophiles.7(5)：415-421)报道从湖水和湖床沉积物未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(Voget S，Leggewie C，Uesbeck A，Raasch C，Jaeger KE，Streit WR.2003.Prospecting for novel biocatalysts in asoil metagenome.Appl Environ Microbiol.，69(10)：6235-6242；Voget S，Steele H L，andStreit W R.2006.Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase.J.Biotechnol.126：26-36)报道从土壤未培养微生物中克隆到3个纤维素酶基因gnuB、uvs080和cel5A；Ferrer等(Ferrer M，Golyshina OV，Chernikova T N，Khachane A N，Reyes-Duarte D，Santos V A，Strompl C，Elborough K，Jarvis G，Neef A，Yakimov M M，Timmis K N，and Golyshin P N.2005.Novel hydrolase diversity retrieved from ametagenomic library of bovine rumen microflora.Environ Microbiol.7：1996-2010)从牛瘤胃未培养微生物中鉴定了9个纤维素酶基因。Feng等(Feng Y，Duan CJ，Pang H，MoXC，Wu CF，Yu Y，Hu YL，Wei J，Tang JL，and Feng JX.2007.Cloning and identificationof novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum andcharacterization of the expressed cellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol.75：319-328)从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了11个纤维素酶基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶和它的编码基因与应用

本发明所提供的纤维素酶，名称为Umcel5N，来源于水牛瘤胃未培养细菌，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)自序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维素酶活性的蛋白质。

其中，序列表中序列2由345个氨基酸残基组成。自序列2的氨基端的第15-329位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。Umcel5N与一个来自热纤维梭菌的内切葡聚糖酶(GenBank索引号：ABN54006.1)的同源性最高，具有44％的一致性和60％的相似性。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的Umcel5N便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的Umcel5N可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Umcel5N的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №：1的自5′端第149至1186位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述Umcel5N的氨基末端添加上信号肽序列。

上述纤维素酶编码基因(umcel5N)也属于本发明的保护范围。

上述纤维素酶编码基因的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中SEQ ID №：1的5′端第149-1186位核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2所示蛋白质序列的多核苷酸；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。

其中，序列表中的序列1由2217个脱氧核苷酸组成，自序列1的5’端的第149-1186位核苷酸为umcel5N的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自序列1的5’端的第149-151位核苷酸为umcel5N基因的起始密码子ATG，自序列1的5’端的第1184-1186位核苷酸为umcel5N基因的终止密码子TGA。序列表中序列1编码序列表中序列2的蛋白质序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的纤维素酶基因是通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的纤维素酶活性平板检测筛选法，得到了新的纤维素酶基因，该纤维素酶基因可在宿主细胞中大量表达本发明的纤维素酶。本发明所提供纤维素酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。

实验证明本发明的纤维素酶具有很高的对底物p-NPC的活性(达192U/mg)，而且本发明的纤维素酶较适合偏酸性的环境，是个中温性的酶，对pH值的适应范围非常广。

在最适反应条件下，Umcel5N对昆布多糖、羟基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose，CMC)的都具有降解活性；而对地衣多糖、木聚糖、Avicel有微弱的降解活性。

本发明的纤维素酶Umcel5N对CMC溶液粘度影响的测定实验说明：随着反应时间的推移，CMC溶液的粘度下降，但是测不到还原糖的产生，这表明Umcel5N是一个能使CMC液化的酶，且是一个新的CMC液化酶。

在测定金属离子及金属离子螯合剂(EDTA)对Umcel5N酶活力的影响实验中，尚未发现有增强本发明纤维素酶活性的金属离子，且较低浓度的螯合剂EDTA可以显著提高其酶活，如5mM的EDTA可使其酶活达到167.037％，10mM的EDTA可使其酶活达到197.79％，50mM的EDTA可使其酶活达到137.57％，这说明金属离子抑制了其酶活，EDTA螯合了溶液中的金属离子后，可使其酶活提高，这表明了纤维素酶Umcel5N不是一个金属酶，这与纤维素酶是金属酶的普遍观点不一致，可以利用其这一特性在特殊环境中降解纤维素，该特性也对纤维素酶的研究提供了新的材料。

附图说明

图1为从水牛瘤胃内容物样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。

图2为水牛瘤胃未培养微生物基因文库克隆的限制性内切酶BamHI酶切分析图。

图3为能降解4-MUC的文库克隆质粒pGXLM2的BamHI酶切带型。

图4为初筛获得的重组质粒pGXLM2转化大肠杆菌后得到的转化子降解4-MUC的照片。

图5为表达重组质粒pET-umcel5N经EcoR I和Hind III双酶切后电泳图。

图6为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-umcel5N对4-MUC活性检测。

图7umcel5N基因的表达、表达产物Umcel5N的纯化及活性胶检测。

图8Umcel5N在不同pH值条件下的酶相对活力曲线。

图9Umcel5N在不同温度条件下的酶相对活力曲线。

图10Umcel5N的pH耐受性检测结果。

图11Umcel5N的温度耐受性检测结果。

图12Umcel5N可以降低CMC溶液粘度实验结果

图13金属离子、鏊合剂、表面活性剂对Umcel5N酶活力的影响结果

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI100(购自Epicentre公司)；表达菌株Rosetta^TM(DE3)(购自Novagen公司)；柯斯质粒载体pWEB::TNC(购自Epicentre公司)；文库制备试剂盒(购自Epicentre公司，pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)；表达载体pET-30a(购自Novagen公司)；限制性内切酶、修饰酶、聚合酶、羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose，CMC)、地衣多糖(lichenan)、羟甲基纤维素(2-hydroxyethyl cellulose)、甲基纤维素(methyl cellulose)、燕麦芽木聚糖(oat spelt xylan)、桦木木聚糖(birchwood xylan)、昆布多糖(laminarin)、微晶纤维素(Avicel)、对硝基苯酚葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)及对硝基苯酚纤维二糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-cellobioside，p-NPC)及4’甲基伞形纤维二糖苷(4-methylumbelliferyl beta-D-cellobioside，4-MUC)等试剂购自Promega、TAKARA、SIGMA、FLUKA或MBI。

实施例1、纤维素酶Umcel5N及其编码基因的获得

一、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建

1、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的提取及纯化

样品的来源为南宁市肉联厂刚屠宰的水牛的瘤胃，新鲜采集的样品装入无菌保鲜袋，带回实验室-20℃保存。用直接提取法提取水牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA，具体方法为：取水牛瘤胃内容物样品58g放入500ml的离心管，各加入100ml提取缓冲液(含有100mM磷酸钠盐(sodium phosphate)、100mM Tirs-HCl、100mMEDTA、1.5M NaCl、质量百分含量为1％的CTAB、质量百分含量为2％的SDS，pH为8.0的溶液)混合均匀，并用搅拌机充分搅拌打碎内容物，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次后，混合物中加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，加入蛋白酶K至终浓度0.5mg/ml，37℃保温1小时，期间每20分钟缓慢颠倒混匀一次。混合物中再加入SDS至终质量百分比浓度为2％，65℃水浴30分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次。将混合物在在Beckman Coulter Avanti J-E离心机(购自Beckman Coulter公司，目录号369003)JA-10转头用8,000g室温离心25分钟。取上清液，加入等体积的异丙醇，缓慢混匀，室温静置10分钟后，8,000g离心20分钟。弃上清，用70％乙醇漂洗沉淀块两次，室温晾干，用适量的1×TE溶解，加入等体积的氯仿抽提两次，吸取上清夜。加入0.6体积的异丙醇，充分混匀后即可看见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70％乙醇洗两次DNA沉淀，室温干燥后，用适量1×TE溶解，获得粗提DNA，立即进行纯化。

将上述得到的DNA粗提物加到Sephadex G200(购自Pharmacia公司，目录号17-0080-01)的层析柱(200mm×10mm，含有2％PVPP(购自Sigma公司，目录号P-6755)上，用TE缓冲液(含有10mM Tris-HCl、1mM Na₂EDTA，pH为8.0的溶液)洗脱，按每组分1ml分段收集洗脱液，每一组分加入100μl的3M醋酸钠溶液(pH5.2)及1ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE(含有10mM Tris-HCl、1mMNa₂EDTA，pH为8.0的溶液)中，合并所得DNA溶液，0.7％琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA，回收纯化的DNA电泳图如图1中A和图1中B所示，其中图1中A中，泳道1为λDNA用EcoRI酶切(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为λDNA(48.5kb)；泳道3为从水牛瘤胃内容物提取的DNA粗提物；图1中B中，泳道2为λDNA(48.5kb)；泳道4为经过Sephadex G-200凝胶和电洗脱法回收得到纯化的25kb以上的DNA。

2、纯化获得25kb以上的末端补平的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组

为了用上述电洗脱法回收纯化的DNA制作基因文库，首先对这些DNA进行末端补平，以产生平头末端而和文库制备试剂盒(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)中已处理好的同样具平头末端的pWEB::TNC载体相连，具体方法为：依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：6μl 10×末端修补缓冲液(含有330mM Tris-醋酸，660mM醋酸钾，100mM醋酸镁，5mM DTT，pH7.8的水溶液)，6μl 2.5mM dNTP混合物(每种dnNTP2.5mM)，6μl 10mM ATP，10ug 30kb以上的DNA，2μl末端修补酶混合物(T₄DNA聚合酶和T₄多聚核苷酸激酶)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmidcloning kit，目录号WEBC931)，加灭菌的去离子水补充到总体积60ul。25℃下放置45分钟，再转移到70℃水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含25kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收(如图1中C所示)。图1中C中，泳道1为λDNA用EcoRI酶切(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道5为25kb-45kb的末端补平的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA。

3、末端补平后的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组与pWEB::TNC的连接反应

将上述末端补平后回收的DNA片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的pWEB::TNC载体在T₄ DNA连接酶的作用下连接起来，具体方法为：依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：12μl无菌水，2μl 10倍快速连接缓冲液(10×Fast-Link Ligation Buffer)，1μl 10mM ATP，1μl pWEB::TNC载体(0.5μg)，3μl低熔点琼脂糖凝胶回收的30kb-45kb的DNA(0.1μg/μl)，1μl快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase，2单位/μl)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)，混匀后在25℃下放置2个小时，再在70℃放置10分钟以终止酶反应。

4、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的获得及质量检验

将步骤3所述的连接反应产物用λ包装蛋白包装，具体方法为：将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloningkit，目录号WEBC931)的一个组分，总共50ul/管)25μl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10μl连接反应产物，充分混匀后置于30℃90分钟后，再往其中加入另外25μl溶化的λ包装提取物，充分混匀后置于30℃90分钟，向其中加入500μl噬菌体稀释缓冲液(含有10mM Tris-HCl，100mMNaCl，10mM MgCl₂，pH为8.3的水溶液)，得到560μl包装反应产物。

再将上述得到的560μl包装反应产物加入到5.6mL的OD600＝1.0的宿主大肠杆菌EPI100培养液(培养基为LB(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；pH7.0)+10mM MgSO₄)中，25℃下放置20分钟让上述得到的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞E.coli EPI100，在含氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)和氯霉素(终浓度为12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；琼脂粉，15g；pH7.0)上筛选转导子。结果共获得约15,000个转导子，任意提取23个克隆的质粒DNA，限制性内切酶BamHI酶切后用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果所有质粒除都有一个5.8kb的载体片段外，都含有插入片段，且这些外源DNA片段的酶切带型都各不相同。酶切结果如图2所示，其中图2中，泳道1为λDNA用EcoRI酶切片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；其它泳道分别为使用限制性内切酶BamHI酶切的不同文库克隆质粒。结果表明该宏基因组文库中克隆的外源DNA具有很好的随机性。插入片段最大的为60kb，最小的为25kb，平均大小为41.6kb，该文库中外源DNA的克隆容量约为6.5×10⁵kb。

二、纤维素酶及其编码基因(umcel5N)的获得

1、从水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组文库中筛选表达纤维素酶活性的克隆

用平板影印法将含氨苄青霉素和氯霉素的LA平板上得到的文库(每平板约200个菌落左右)分别影印到含氨苄青霉素(终溶度100μg/mL)和氯霉素(终溶度12ug/ml)的LA平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养36小时后，在培养好的LA平板的菌落的上面加入2ml含有质量百分含量为0.04％4-methylumbelliferylbeta-D-cellobioside(4-MUC)的0.6％的琼脂糖凝胶，继续在37℃培养45min，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光，若菌落为周围有荧光的克隆则表明筛选到了对4-MUC有活性的阳性克隆。本文库中共筛选得到的5个对4-MUC有活性的阳性克隆，经转化验证后这些克隆仍具有4-MUC活性。提取这5个克隆的质粒，经BamHI酶切分析发现，共有3个独立的克隆，分别命名为LM2、LM4和LM5。选取对4-MUC降解活性最强(根据在紫外灯下荧光的强弱来判断)的LM2原始克隆提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pGXLM2，用限制性内切酶BamHI完全酶切pGXLM2后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示，pGXLM2除有一个5.8kb的载体片段外，还有另外4条BamHI片段，大小分别为21.0kb，11kb，9.0kb，7.0kb。结果表明pGXLM2含有48.0kb的插入片段。其中，泳道1为λ用EcoRI酶切后的片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp)；泳道3为pGXLM2/BamHI(从上至下分别为21.0kb，11kb，9.0kb，7.0kb)

为了证实pGXLM2的插入片段确实含有纤维素酶基因，用pGXLM2质粒DNA和空载体pWEB::TNC分别转化E.coli EPI100，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选转化子，随机挑取由每个质粒转化得到的10个转化子点接到LA平板上，37℃培养24小时后，在培养好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04％4-MUC的0.6％的琼脂糖，继续在37℃培养45min，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光，结果表明所有10个由空载体pWEB::TNC转化得到的转化子周围都没有荧光，所有10个由pGXLM2转化得到的转化子在紫外灯下周围都有荧光，其中一个转化子的检测结果如图4所示(图4中左侧菌落为空载体pWEB::TNC转化得到的转化子，右侧菌落为由pGXLM2转化得到的转化子)。结果表明重组质粒pGXLM2的插入片段上确实含有纤维素酶基因。

2、纤维素酶及其编码基因(umcel5N)的获得

为了测定重组质粒pGXLM2上纤维素酶基因的DNA序列，采用亚克隆的方法对该基因进行定位。亚克隆的具体步骤是：使用限制性内切酶BamHI对重组质粒pGXLM2(约48kb)进行了完全酶切后加入连接酶在16℃连接两个小时(在pGXLM2完全酶切后，该重组质粒含有的载体pWEB::TNC的5.0kb的部分可以利用来克隆各个外源BamHI片断)。连接产物用化学法转化大肠杆菌EPI-100，涂布在含氯霉素(终浓度34ug/ml)的LA平板上。在培养好的LA平板的菌落的上面铺上一层含有质量百分含量为0.04％的4-MUC的0.6％的琼脂糖凝胶，继续在37℃培养1小时，然后在紫外灯下检测菌落周围有无荧光。任意挑选24个有荧光反应的转化子，提取质粒做BamHI酶切分析，其中一个重组质粒只有一条21kb的外源片段；然后用同样的步骤再选用Sac II对该片段进行亚克隆，把编码纤维素酶的基因定位在5.7kb的Sac II片段上；最后选用EcoRI对该片段进行亚克隆，得到只含有约4.8kb EcoRI外源片段的仍保持有4-MUC降解活性的亚克隆。将该重组质粒pGXLM2寄送大连宝生物工程公司采用双脱氧核苷酸法对该亚克隆进行双向双链测序。测序结果用软件DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，得到纤维素酶的编码基因，该基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，命名为umcel5N。自序列表中序列1的5′端的第149至1186位核苷酸为umcel5N的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，由1038个核苷酸组成，自序列1的5′端的第149-151位核苷酸为umcel5N基因的起始密码子ATG，自序列1的5′端的1184-1186位核苷酸为umcel5N基因的终止密码子TGA。umcel5N可通过人工合成得到。

纤维素酶基因umcel5N编码一个含345个氨基酸的蛋白质Umcel5N，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为39.812道尔顿，等电点pI为6.16。用简单组件结构研究工具(Simple ModularArchitecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析纤维素酶Umcel5N的组件结构，结果表明，自序列2的氨基端的第15-329位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。Umcel5N与一个来自热纤维梭菌的内切葡聚糖酶(GenBank索引号：ABN54006.1)的同源性最高，具有44％的一致性和60％的相似性。

实施例2、umcel5N在大肠杆菌中的表达

1、可表达umcel5N的重组载体(pET-umcel5N)的构建

人工合成umcel5N基因的编码序列，即合成具有序列1的自5′端第149位至1183位核苷酸的DNA片段，合成umcel5N基因两端带有EcoRI和HindI酶切位点，将合成后并测序表明正确的umcel5N基因片段用EcoRI和HindI酶切后，插入载体pET-30a(+)(购自Novagen公司)的EcoRI和HindI位点间，得到重组表达载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将酶切和测序表明含有umcel5N基因编码序列(序列1的自5′端第149位至1183位核苷酸的DNA片段)的正确的重组载体命名为pET-umcel5N。起始密码子和终止密码子由表达载体pET30a(+)提供。表达产物的N端和C端分别有一个由表达载体提供的His标签(6×His Tag)。其中，pET-umcel5N重组质粒的酶切电泳图谱如图5所示，图5中可以看到重组质粒经EcoRI和HindI双酶切后释放出一条5.3kb的载体带和一条与人工合成umcel5N基因经EcoRI和HindI酶切后同样大小的1.038kb的片段。图5中，泳道1为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；泳道2为重组质粒pET-umcel5N经EcoRI和HindI双酶切后结果。

2、umcel5N基因在E.coli BL21(DE3)中的表达

把pET-umcel5N转化至E.coli BL21(DE3)中，得到转化子，将得到的转化子提取质粒并进行测序验证，将测序表明正确的含有pET-umcel5N的转化子命名为BL21(DE3)/pET-umcel5N。用同样的方法将pET-30a转入BL21(DE3)中，得到含有pET-30a的转化子，将测序表明正确的转化子命名为BL21(DE3)/pET-30a。

挑取BL21(DE3)/pET-umcel5N单菌落于LA平板上(含氯霉素34μg/mL，卡那霉素25μg/ml，IPTG 1.0mmol/L)，同时用BL21(DE3)/pET-30a(转入pET-30a的BL21(DE3))作为空白对照，37℃培养24小时。菌体经氯仿破壁后用含质量百分含量为0.04％的4-MUC的0.6％琼脂糖凝胶覆盖，然后培养45min，在紫外灯下观察菌落周围有无荧光。结果如图6所示，结果表明重组菌BL21(DE3)/pET-umcel5N周围有荧光(图6中的右侧菌落)，而空白对照BL21(DE3)/pET-30a周围无荧光(图6中的左侧菌落)，说明靶基因umcel5N在E.coli BL21(DE3)中已经高效表达出了有纤维素降解活性的蛋白质产物。

3、Umcel5N的纯化

1)BL21(DE3)/pET-umcel5N菌体发酵

挑取BL21(DE3)/pET-umcel5N单菌落接种到10ml含有34μg/ml氯霉素(CAM)和25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃200rpm培养12小时。取5ml培养液接种到100ml含有34μg/ml氯霉素(CAM)与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，在37℃培养200rpm培养至OD₆₀₀为0.6。加入IPTG至终浓度为0.3mM，16℃继续培养20个小时，5,000g离心收集菌体。用同样的方法培养BL21(DE3)/pET-30a并收集菌体作为空白对照。

2)Umcel5N的提取与纯化

在步骤1)收集获得的BL21(DE3)/pET-umcel5N或BL21(DE3)/pET-30a菌体中，分别按每克菌体重量加入5ml的裂解缓冲液(含有50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole(咪唑)，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH8.0的水溶液)，悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400w作用20次，每次作用时间10s，每次作用间隔12s。12,000g离心20分钟，收集上清分别得到Umcel5N粗酶液(BL21(DE3)/pET-umcel5N细胞裂解上清液)和BL21(DE3)/pET-30a细胞裂解上清液。

使用Qiagen公司的The QIAexpressionist kit试剂盒(方法参照试剂盒说明书)进行纯化。将上述得到的Umcel5N粗酶液(BL21(DE3)/pET-umcel5N细胞裂解上清液)，按每4ml裂解上清液加入1ml质量百分含量为50％的NI-NTA胶体，在4℃用200rpm摇60分钟，混合物灌注到The QIAexpressionist kit试剂盒附带的柱子。加4ml洗涤缓冲液(含有50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，1mM PMSF，pH8.0的水溶液)到柱子里，缓慢搅拌。重复冲洗6次。加入0.5ml的洗脱缓冲液(含有50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，1mM PMSF，pH值为8.0的水溶液)，收集流出物，重复洗脱8次。合并8管蛋白质溶液即得到Umcel5N蛋白液，取5ul用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。

SDS-PAGE结果如图7所示，结果表明umcel5N基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达产物Umcel5N分子量为45kDa左右，与预计的分子量基本一致，粗酶液经镍柱纯化后，基本去掉了杂蛋白，Umcel5N已达到SDS-PAGE单条纯。以BL21(DE3)/pET-30a的总蛋白(以上述得到的BL21(DE3)/pET-30a细胞裂解上清液为材料进行电泳)SDS-PAGE作为空对照。

用活性胶染色法检测了Umcel5N的纤维素酶活性，首先Umcel5N在聚丙烯酰胺非变性胶上进行蛋白质电泳(Native-PAGE)，然后把非变性胶置于干净的培养皿上，滴加1ml浓度为1.25mM的pNPC溶液，用玻棒平涂均匀，用塑料袋包裹平板，在37℃中保温10-20分钟后，如果蛋白条带具有纤维素酶活性，即直接在胶上就可观察到一条清晰的黄色水解带。活性胶检测该目标带具有p-NPCase活性，说明umcel5N是按正确的阅读框架表达的。图7中，泳道1为分子量标准(marker)；泳道2为BL21(DE3)/pET-30a的总蛋白(以上述得到的BL21(DE3)/pET-30a细胞裂解上清液为材料进行电泳，作为空对照)；泳道3为Umcel5N基因的表达的粗酶液；泳道4为镍柱纯化后Umcel5N；泳道5为Umcel5N的活性胶检测。

4、Umcel5N酶学特性的研究

将经过上述步骤3纯化的重组酶Umcel5N蛋白液用pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液稀释到蛋白浓度1.95ug/ml，用来进行酶学特性试验。酶活测定中，每个样品均作三次重复。

(1)内切葡聚糖酶的酶活力测定采用DNS法，具体操作如下：

1)DNS试剂的配制

称取10g NaOH用约400ml ddH₂O溶解，再称取10g二硝基水杨酸、2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠、200g四水酒石酸钾钠，将其溶解于约300ml ddH₂O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存一周后使用。

2)葡萄糖浓度标准曲线的制作

①用去离子水配制2.0mg/ml葡萄糖标准水溶液。

②在试管中按表1加入溶液。

表1.葡萄糖浓度标准样的制备

编号	1	2	3	4	5	6
							葡萄糖标准液(μl)	0	50	75	100	150	200
去离子水(μl)	1000	950	925	900	850	800

葡萄糖浓度(μg/ml)	0	100	150	200	300	400
							DNS试剂(ml)	2	2	2	2	2	2

③混匀后在沸水中反应5分钟，用自来水冲洗管壁冷却。

④各试管取200μl溶液加入96孔酶标板，用酶标仪测530nm下的吸光值，绘制标准曲线，保存在测定程序中。

3)内切葡聚糖酶活力测定

①用CMC(羧甲基纤维素)作底物测定内切葡聚糖酶活力。

②将200μl 0.01g/ml CMC(溶解于pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中)溶液与90μl相同pH值的缓冲液(pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液)在试管中混合，置于最适温度(55℃)的水浴锅中预热5分钟。

③加入10μl上述稀释得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液，保温反应15分钟。

④待反应结束后，立即加入700μl的去离子水(补足1000μl体积)和2ml的DNS试剂，置于沸水中水浴5分钟，用自来水冷却至室温。

⑤取200l溶液加入96孔酶标板，用酶标仪测530nm下的吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算反应体系中产生的葡萄糖浓度。

酶活力单位(U)定义：1U为每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量。

比酶活的定义：每mg或g蛋白质所含的酶活力(U/mg或U/g)。

结果表明，在pH值为5.5，温度为55℃的条件下，Umcel5N对羧甲基纤维素降解酶活的比活力为0.374U/g。

(2)Umcel5N对底物p-NPC、p-NPG的酶活力测定

1)对硝基苯酚(p-NP)浓度标准曲线的制作

①用去离子水配制10mM的p-NP标准液。

②在试管中按表2加入溶液。

表2.p-NP浓度标准样的制备

编号	1	2	3	4	5	6
							p-NP标准液(μl)	0	10	20	30	40	50
去离子水(μl)	1000	990	980	970	960	950
							p-NP浓度(mM)	0	0.1	.0.2	0.3	0.4	0.5

③取各浓度标准溶液140μl加入小离心管，分别加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液，用移液抢小心吸打混匀，避免出现气泡。

④取200μl溶液加入96孔酶标板，用酶标仪测410nm下的吸光值，绘制标准曲线，保存在测定程序中。

2)以对硝基苯酚二糖苷(p-NPC)、对硝基苯酚葡萄糖苷(p-NPG)分别为底物测定Umcel5N活力。方法如下：

①配制浓度为25mM的p-NPC水溶液、25mM的p-NPG水溶液分别作为底物，用小管分装，管外用铝箔包裹避光，保存于-20℃冰箱。

②取pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中116μl，加入14μl底物溶液(25mM的p-NPC水溶液或5mM的p-NPG水溶液)，置于一定温度的水浴锅中预热5分钟，加入10μl酶液(上述稀释得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)，保温反应10分钟。

③反应结束后，立即加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液，终止反应。

④取200μl溶液加入96孔酶标板，用酶标仪测410nm，根据p-NP标准曲线计算反应体系中产生的p-NP浓度。

酶活力单位(U)定义：1U为每分钟催化产生1μmol p-NP所需的酶量。

比酶活的定义：每mg或g蛋白质所含的酶活力(U/mg或U/g)。

结果表明，在pH值为5.5，温度为55℃的条件下，Umcel5N对对硝基苯酚二糖苷(p-NPC)降解酶活的比活力为192U/g，在pH值为5.5，温度为55℃的条件下，Umcel5N对对硝基苯酚葡萄糖苷(p-NPG)无降解能力。

(3)Umcel5N对pNPC降解的最适pH值的测定

按照步骤(2)的方法测定37℃时，不同pH(范围为3.0～10.0)Umcel5N对pNPC降解的酶活和比酶活，其中在pH 3.0～7.0范围内使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0～8.0使用0.1M磷酸二氢钠缓冲液-磷酸氢二钠缓冲液，pH 7.0～9.0范围内使用0.1M的Tris-HCl缓冲液，pH 8.5～10.0范围内使用0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。反应体系为：14μl 25mmol/L的pNPC，10μl酶液(上述稀释得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)，116μl不同pH的缓冲液，37℃反应10分钟，加入70μl 0.4mol/L的Na2CO₃溶液以终止反应，反应后用酶标仪测A410。

按照步骤(2)的方法计算酶活力和比活力，在37℃的反应条件下，Umcel5N在pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力。结果如图8所示(图中◆表示pH 3.0～7.0范围内所使用的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，■表示pH 7.0～9.0范围内所使用0.1M的Tris-HCl缓冲液，▲表示pH 8.5～10.0范围内所使用0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，结果表明Umcel5N对pNPC的最适pH为5.5。

(4)Umcel5N的最适温度的测定

按照步骤(2)所述反应体系及方法，在Umcel5N的最适pH 5.5条件下测定不同温度下(20℃～70℃)的相对酶活。结果如图9所示，表明Umcel5N对pNPC的最适温度为55℃。

(5)Umcel5N的pH耐受性实验

将酶保存于不同pH值的缓冲液(在pH 3.0～7.0范围内使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0～8.0使用0.1M磷酸二氢钠缓冲液-磷酸氢二钠缓冲液，pH 7.0～9.0范围内使用0.1M的Tris-HCl缓冲液，pH 8.5～10.0范围内使用0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)中，于4℃放置24小时后，按照步骤(2)所述反应体系及方法，在最适pH值(pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液)和最适温度(55℃)下测定酶活。以酶活最高为100％酶活换算其他反应条件下的相对酶活。结果如10所示(图中◆表示pH 3.0～7.0范围内所使用的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，■表示pH 7.0～9.0范围内所使用0.1M的Tris-HCl缓冲液，▲表示pH 8.5～10.0范围内所使用0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，表明Umcel5N在pH4.0～10.0之间具有较好的稳定性。

(6)Umcel5N的热稳定性分析

将酶保存于最适pH值的缓冲液(pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液)中，置于不同温度下(4℃～70℃)放置1小时后，然后按照按照步骤(2)所述反应体系及方法，在最适pH值(pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液)和最适温度(55℃)下测定酶活。结果如图11所示，表明在20-45℃范围内，Umcel5N的酶活力稳定性较好。

(7)Umcel5N的底物特异性

按步骤(1)所述的CMC酶活力的测定方法，检测重组酶Umcel5N的酶液(上述稀释得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)在最适pH值(pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液)和最适温度(55℃)下分别以质量百分含量为1％的各种多糖溶液(CMC、地衣多糖(lichenan)、羟甲基纤维素(2-hydroxyethyl cellulose)、甲基纤维素(methyl cellulose)、燕麦芽木聚糖(oat spelt xylan)、桦木木聚糖(birch woodxylan)、昆布多糖(laminarin)、微晶纤维素(Avicel)、酸洗膨胀纤维素(acid swollencellulose))为底物溶液时的酶活力。其中，对CMC、地衣多糖(lichenan)反应时间为15分钟；对羟甲基纤维素(2-hydroxyethyl cellulose)、甲基纤维素(methylcellulose)、燕麦芽木聚糖(oat spelt xylan)、桦木木聚糖(birch wood xylan)、昆布多糖(laminarin)反应时间为2小时；对微晶纤维素(Avicel)、酸洗膨胀纤维素(acid swollen cellulose)反应时间为24小时。

此外，还按步骤(2)所述反应体系及方法检测了以pNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)为底物的活性，反应时间为2小时。结果表明，在pH值为5.5，温度为55℃的条件下，Umcel5N对对硝基苯酚葡萄糖苷(p-NPG)无降解能力。

(8)Umcel5N对CMC溶液粘度的测定

使用BROOKFIELD旋转粘度计对Umcel5N在不同时间对CMC溶液粘度的测定。反应体系为：Umcel5N酶液(上述稀释得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)10μl，质量百分含量为1％的CMC溶液(pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解)650μl；每个样品均作三个重复。将反应体系在37℃反应，分别在不同时间段(0.5h、1h、2h、3h、4h、5h)取出反应产物在沸水中煮沸灭活5min，取出灭活500μl反应液加入BROOKFIELD旋转粘度计进行粘度测定，可直接读出粘度数值，以粘度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，根据所作图对Umcel5N的特性进行判断。

结果如图12所示，结果表明随着反应时间的推移，CMC溶液的粘度下降，但是不产生还原糖，这表明Umcel5N是一个能使CMC液化的酶。(图中◆表示粘度值的变化，■表示还原糖量的变化)

(9)金属离子、螯合剂、表面活性剂对Umcel5N酶活影响的测定

按照步骤(2)的方法，在以pNPC为底物的酶反应体系中，分别加入5mM的金属离子KCl(图13中K⁺)、LiCl(图13中Li⁺)、CaCl₂(图13中Ca²⁺)、MnCl₂(图13中Mn²⁺)MgCl₂(图13中Mg²⁺)、CoCl₂(图13中Co²⁺)、FeCl₂(图13中Fe²⁺)、ZnCl₂(图13中Zn²⁺)、CrCl₂(图13中Cr²⁺)、FeCl₃(图13中Fe³ ⁺)、CuCl₂(图13中Cu²⁺)或金属离子螯合剂EDTA(5mM(图13中5E)、10mM(图13中10E)、50mM(图13中50E)或100mM(图13中100E))或0.25g/ml的表面活性剂SDS，在Umcel5N的最适作用条件下测定酶活力。以按照步骤(2)的方法，在以pNPC为底物的酶反应体系中不添加上述试剂的反应测定的酶活力为100％(图13中ck)，在Umcel5N的最适作用条件下测定各处理酶活力，并计算的相对酶活。

结果如图13所示，实验表明在测定金属离子及金属离子螯合剂(EDTA)对Umcel5N酶活力的影响实验中，尚未发现有增强其酶活性的金属离子，且较低浓度的螯合剂EDTA可以显著提高其酶活，如5mM的EDTA可使其酶活达到167.037％，10mM的EDTA可使其酶活达到197.79％，50mM的EDTA可使其酶活达到137.57％，这说明金属离子抑制了其酶活，EDTA螯合了Umcel5N中的金属离子后，可使其酶活提高，但是当EDTA的浓度达到100mM时可使酶活降至9.77％，同时这也表明了纤维素酶Umcel5N不是一个金属酶，这与纤维素酶是金属酶的普遍观点不一致。

序列表

<160>2

<210>1

<211>2217

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

cgttccgggg gctgctcaac gttggcgtgc gcacctacga cgagaagtac aattcgcagt 60

gagacggtca ggaaacgctt gtcgcgcgtc gcgacgttaa acatggcccg gggcggcccc 120

gggatagaca tcacgaaagg agaacgacat ggcaacgcgt tgggaaggct tcatggcggg 180

cgccaacctc gggcactgga tctcccagta cgagaaccat ggcaacaagg agcattggga 240

caactatatc attgcctccg acttcgcgca gatgcgctcg tgggggatgg accacgttcg 300

cctgccggtg gactacccga tgttcgagcg cgacgacgcc ccggggcaat acctcgagga 360

agggctccat tacatcgact gggcgcttga gcagtgccgc cgcaacgggc tgaacttggt 420

gctcgacctt cacaagacgc ccggcttctt cttcttcgac aacaaggaag cgggcaagaa 480

cgacctgttc aacagcccgg cgaagcagga gcgctttttg aacatctggc ggatgttcgc 540

caagcgttac gcgggcgagg gcgacaacct cgctttcgag ctgctgaacg aattggtctg 600

cgaggattcg ctcccgtgga acgccttgtg gcccaaggcg gtcgccgcca tccgcgagat 660

ctccccgaag cgcaagatcg tcgtcggcag caaccgctgg aactcggtgg acgagctgaa 720

gaacctgacc ctcaccgacg attccaacgt catttacaac ttccattgct acgcccccat 780

cgtcttcacc caccagcggg cgccgtggga aagctggctg atggagtacc agacctcggt 840

ggtctacccg gtgccggtcg aggagcatcg cgtcttcctg gagaagcaca acccgacctt 900

ccttggcaaa tacaaggtca tcgaccgcgc cgccatggct gacatcctcc gcccggcggc 960

ggagttcatc gccgcccatc agcggccgct ctactgcggc gagtacgggg tcatcgccaa 1020

cgccgacctt ggcagcacgg tgcgctggct cgacgacatc acctccatct tcaacgagct 1080

gggcatcggc cacgccgtct ggagctatcg cggcttcgcc aaggtcaccg acgcgaaccg 1140

ccgcccggtc tgccccgggg tcatcgccgc catctcccgc cactgagcgc ccggggcgtc 1200

gcctccgccc ccggtttgcc gccgcggcgt tgtcgtcatc catgggcgcc cccctcggtc 1260

accgcgcacg gccccggcag gcgtttcagc cgctccaggt ccgccggggt catccgcacc 1320

gtggccaccg cctcgtcgcc ctcgtagcgg acggcgaggc cgacgccgta ttggttgagg 1380

acggcgagcc gccgcccgtc gcccgcggcc gggaacagca ggaggaaaga agatggaaaa 1440

acggacaagc aaggcatggt cgctggcgtt ggcgttggtg gcggcgctaa tggccccggg 1500

gctcgcggag gaggcgcccg ccgccacgga gtcggccatc ggcgtggcgg tgtcaccggg 1560

caagccgttc cagttcaggg tttttgacga ctatgcggtc ctcagcggct acagcgcgct 1620

ggaaccgacc atcgtcattc cgacggagac tgagggacgc aaggtcatgg tcatcggcaa 1680

gagcgcgttc tccatgaacc cccatattac cgccgtgacc attcccgctg ggatcgttcg 1740

catcgaggac atggctttca ccgcttgcac gcggttggcc gccgtggaca tccccgggag 1800

cgtgcaggag attggcactg gagctttcgc ggggtgcgcg gggttggcca gcgtgacttt 1860

gcatgagggg acgcgcgtca tcggcatagg cgctttctcg aaatgcgccg cgctcaaggc 1920

cattgccttg cccgccggga cgcagaagat cgagatgggc gcgttcagcg agtgcccagc 1980

gctcgcctcc gtgactttgg cgtcgggatt gcaggagatt ggcgtccgcg cgtttgcgga 2040

ctgtcgcgaa ttgaaacagg tcacgatccc gggatcctct ccctatagtg agtcgtatta 2100

tgcggccgcg aattccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg 2160

ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt cttaaaaagg ccgtaatatc cagcgag 2217

<210>2

<211>345

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

Met Ala Thr Arg Trp Glu Gly Phe Met Ala Gly Ala Asn Leu Gly His

1 5 10 15

Trp Ile Ser Gln Tyr Glu Asn His Gly Asn Lys Glu His Trp Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile Ile Ala Ser Asp Phe Ala Gln Met Arg Ser Trp Gly Met Asp

35 40 45

His Val Arg Leu Pro Val Asp Tyr Pro Met Phe Glu Arg Asp Asp Ala

50 55 60

Pro Gly Gln Tyr Leu Glu Glu Gly Leu His Tyr Ile Asp Trp Ala Leu

65 70 75 80

Glu Gln Cys Arg Arg Asn Gly Leu Asn Leu Val Leu Asp Leu His Lys

85 90 95

Thr Pro Gly Phe Phe Phe Phe Asp Asn Lys Glu Ala Gly Lys Asn Asp

100 105 110

Leu Phe Asn Ser Pro Ala Lys Gln Glu Arg Phe Leu Asn Ile Trp Arg

115 120 125

Met Phe Ala Lys Arg Tyr Ala Gly Glu Gly Asp Asn Leu Ala Phe Glu

130 135 140

Leu Leu Asn Glu Leu Val Cys Glu Asp Ser Leu Pro Trp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Trp Pro Lys Ala Val Ala Ala Ile Arg Glu Ile Ser Pro Lys Arg Lys

165 170 175

Ile Val Val Gly Ser Asn Arg Trp Asn Ser Val Asp Glu Leu Lys Asn

180 185 190

Leu Thr Leu Thr Asp Asp Ser Asn Val Ile Tyr Asn Phe His Cys Tyr

195 200 205

Ala Pro Ile Val Phe Thr His Gln Arg Ala Pro Trp Glu Ser Trp Leu

210 215 220

Met Glu Tyr Gln Thr Ser Val Val Tyr Pro Val Pro Val Glu Glu His

225 230 235 240

Arg Val Phe Leu Glu Lys His Asn Pro Thr Phe Leu Gly Lys Tyr Lys

245 250 255

Val Ile Asp Arg Ala Ala Met Ala Asp Ile Leu Arg Pro Ala Ala Glu

260 265 270

Phe Ile Ala Ala His Gln Arg Pro Leu Tyr Cys Gly Glu Tyr Gly Val

275 280 285

Ile Ala Asn Ala Asp Leu Gly Ser Thr Val Arg Trp Leu Asp Asp Ile

290 295 300

Thr Ser Ile Phe Asn Glu Leu Gly Ile Gly His Ala Val Trp Ser Tyr

305 310 315 320

Arg Gly Phe Ala Lys Val Thr Asp Ala Asn Arg Arg Pro Val Cys Pro

325 330 335

Gly Val Ile Ala Ala Ile Ser Arg His

340 345

Claims

1.一种纤维素酶，其特征在于：所述纤维素酶的氨基酸残基序列为序列表中序列2所示的氨基酸残基序列。

2.权利要求1所述的纤维素酶的编码基因，其特征在于：所述纤维素酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID №：1。

3.权利要求1所述的纤维素酶的编码基因，其特征在于：所述纤维素酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：1的5′端第149-1186位。

4.含有权利要求2或3所述的纤维素酶编码基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的纤维素酶编码基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述的纤维素酶编码基因的宿主菌。

7.权利要求1所述的纤维素酶在纤维素降解中的应用。

8.权利要求2或3所述的纤维素酶编码基因在纤维素降解中的应用。