CN103602646B - 一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 - Google Patents

一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用，该突变体蛋白的最适反应温度为48℃；与野生型蛋白相比，酶活水平基本没有变化，并具有良好的热稳定性；本发明的突变体为β-葡萄糖苷酶的应用提供了一种新的途径，可以用于高温条件下纤维素材料的降解以及食品、化工等领域。

Description

一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
（一）技术领域
本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体，尤其涉及一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
（二）背景技术
β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），其英文名为：beta glucosidase，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，属于水解酶类，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。根据氨基酸序列的相似性和底物特异性，β-葡萄糖苷酶被划为糖苷酶57个家族中的第一家族，该家族的显著特征是高度的序列同源性和广泛的底物特异性，主要是对底物的糖苷配基部分显示出广泛的底物特异性。
β-葡萄糖苷酶分布较为广泛，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍，微生物β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、细菌、真菌和链霉菌中，已从多种微生物中分离得到β-葡萄糖苷酶。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大，一般在40-250kDa之间，而其可能是单亚基、双亚基或多亚基的。多数研究结果表明，β-葡萄糖苷酶为酸性蛋白，其最适pH一般在3.0-6.0之间，许多酵母、细菌的胞内β-葡萄糖苷酶的最适pH都接近6.0。
β-葡萄糖苷酶在许多领域都有着广泛的应用，例如：在工业上可以用于生产低聚龙胆糖，生产过程中，将高浓度的葡萄糖液用霉菌来源的β-葡萄糖苷酶进行反应，使葡萄糖发生转移反应和缩合反应来合成低聚龙胆糖；β-葡萄糖苷酶还可以用于纤维素的降解，纤维素是葡萄糖以β-1,4-键结合的聚合物，为植物细胞壁的构成成分，是非常丰富的可再生资源，β-葡萄糖苷酶在纤维素水解成葡萄糖的过程中起着关键作用；β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力可用于乳品工业来分解乳糖，可与其他酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白；β-葡萄糖苷酶还能用于改良果汁风味，其可以释放出潜在的芳香成分，对于天然香精香料工业有着重要意义；此外，β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性可用于生产日化工业的非离子表面活性剂烷基糖苷，以及用于饲料工业和医药领域等。
目前工业上常用的瑞氏木霉来源的β-葡萄糖苷酶最适反应温度通常在35℃左右，无法满足高温工业的应用，获得最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶将具有重大意义。本发明利用来源于瑞氏木霉的β-葡萄糖苷酶，通过定点突变的方法获得了最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶，突变体的最适反应温度为48℃，并且具有良好的热稳定性，其可以用于高温条件下纤维素的降解以及食品工业等相关领域。
（三）发明内容
本发明的目的是提供一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶突变体，以及高温条件下该突变体在纤维素材料降解和食品工业等领域的应用。
本发明通过PCR的方法从瑞氏木霉中克隆得到了野生型的β-葡萄糖苷酶BGL1，其基因全长1455bp，编码484个氨基酸；将其编码基因重组到表达载体pET-32a中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达并纯化得到重组蛋白，酶活测定结果显示，其最适反应温度为36℃。
为了提高BGL1的最适反应温度，利用生物信息学分析可能会影响其最适反应温度的氨基酸残基，结果显示105位Ser、273位Ile以及409位Phe可能是影响其最适反应温度的关键位点，之后通过定点突变的方式，对这三个氨基酸残基进行突变：将105位Ser分别突变为Ala和Asn，得到S105A和S105N；将273位Ile分别突变为Ala和Asn，得到I273A和I273N；将409位Phe分别突变为Ala和Asn，得到F409A和F409N；将105位Ser和273位Ile均突变为Asn，得到双突变体S105N-I273N；对上述七个不同的突变体的酶活进行了研究，结果表明双突变体S105N-I273N的最适反应温度提高程度最高，达到48℃，其在45-50℃的高温条件下均可以对底物产生较高的活性。
有益效果
本发明得到的β-葡萄糖苷酶突变体的最适反应温度相对于野生型得到了提高，可以用于较高温度时的纤维素材料降解以及食品、日化等领域中，为β-葡萄糖苷酶的应用提供了更多途径的选择，具有重要的经济价值。
（四）附图说明
图1：野生型β-葡萄糖苷酶和单一位点氨基酸突变体的酶活最适反应温度曲线；图1A：野生型；图1B：F409A；图1C：F409N；图1D：S105A；图1E：I273A；图1F：S105N；图1G：I273N；
图2：双突变体S105N-I273N酶活最适反应温度曲线；
图3：野生型β-葡萄糖苷酶和双突变体S105N-I273N酶活热稳定曲线；虚线（…）表示野生型β-葡萄糖苷酶在36℃保温12小时的酶活变化曲线；实线（—）表示双突变体S105N-I273N在48℃保温12小时的酶活变化曲线。
（五）具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明作出更进一步的说明，以便本领域技术人员了解本发明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：β-葡萄糖苷酶BGL1基因的分离
（1）以编号为ATCC 26921的瑞氏木霉为材料，对其进行接种、培养、收集菌丝；采用Trizol法提取RNA，将RNA进行反转录得到cDNA，RNA的提取以及反转录采用本领域的常规技术手段即可实现，本发明利用了Invitrogen公司的Trizol试剂以及反转录试剂盒得到了cDNA。
（2）设计引物进行β-葡萄糖苷酶BGL1的 cDNA的扩增，引物序列如下：BGL1F：ccggaattccccgagtcgctagctctgcc；BGL1R：cccaagctttgccgccactttaaccctctg；利用酶切连接的方法将BGL1连接到表达载体pET32a，得到重组载体，对其进行测序，得到BGL1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：β-葡萄糖苷酶BGL1突变体的获得
采用融合PCR的方法对BGL1野生型基因进行单一位点氨基酸突变，得到不同突变体的核苷酸序列和氨基酸序列，通过本领域的常规技术手段即可得到；单一位点突变体的核苷酸序列和氨基酸序列如表1所示：
表1：单一位点氨基酸突变后的核苷酸和氨基酸序列
实施例3：重组β-葡萄糖苷酶的制备和活性分析
将BGL1野生型和不同单一位点氨基酸突变体的编码基因重组至表达载体pET32a，将测序验证正确的重组载体转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得含有重组质粒的大肠杆菌表达菌株。
将含有重组质粒的大肠杆菌表达菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm=0.6，加入终浓度为200uM的IPTG，26℃诱导过夜；之后，离心收集菌体，对菌体超声破碎，收集上清，对上清液采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳验证，均可得到分子量大约为68KDa的目的蛋白。
将纯化的重组β-葡萄糖苷酶在不同温度下测定对底物pNPG（对硝基苯-β-D葡萄糖苷）的活性，测定方法为：将底物pNPG以2mM的浓度溶于pH 6.0的缓冲液中，加入等体积的酶液，在不同温度下反应10min后，加入1M的碳酸钠，测量OD405nm，酶活单位定义为：每分钟释放1umol pNPG所需要的酶量（U/mL）。
图1显示了野生型和单一位点氨基酸突变体的酶活测定结果。野生型BGL1的最适反应温度为36℃，F409A和F409N的最适反应温度与野生型相比没有变化，表明409位的Phe对最适反应温度没有影响；但是，该氨基酸位点的突变会影响β-葡萄糖苷酶的酶活，F409A和F409N的最高酶活只能达到野生型的80%，也就是说，409位的Phe可能是BGL1发挥活性的关键位点。S105N和I273N与野生型相比，最适反应温度均有不同程度的提高，S105N为42℃，I273N则为46℃；但是，S105A和I273A与野生型相比，最适反应温度没有变化；即，105位Ser和273位Ile会影响BGL1的最适反应温度，如果突变成为结构简单的Ala，对最适温度影响不大；相反，突变成为酰胺类的氨基酸Asn，会在不同程度上提高最适反应温度。酰胺类的氨基酸Asn或者Glu通常会在蛋白质或酶的活性中发挥重要作用，这可能是由于在蛋白质折叠的过程中有助于形成独特的构象从而使得蛋白质行使特定的功能。另一方面，105位Ser和273位Ile的突变没有影响BGL1的最大反应酶活。
实施例4：双位点氨基酸突变对β-葡萄糖苷酶活性的影响
为了进一步研究105位Ser和273位Ile的共同突变是否会有协同效应，从而进一步提高β-葡萄糖苷酶的最适反应温度，进行了双位点氨基酸突变，即105位Ser和273位Ile均突变为Asn，得到S105N-I273N，核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.15-16所示；按照实施例3的方法，对S105N-I273N进行了重组表达、纯化并对活性进行了测定；图2显示S105N-I273N的最适反应温度可以提高到48℃左右，表明105位Ser和273位Ile共同突变具有协同效应。
图3显示双突变体S105N-I273N在48℃时的酶活与野生型在36℃时的酶活相差不大，即，双位点氨基酸的突变没有影响β-葡萄糖苷酶的活性；而且，突变体在48℃保温12小时后，仍然具有80%以上的酶活性，表明其具有良好的热稳定性。
上述结果表明，双突变体S105N-I273N的最适反应温度提高到了48℃，其活性没有降低，并具有良好的热稳定性，可以用于高温条件下纤维素材料的降解以及食品工业等领域。
（六）核苷酸和氨基酸序列
SEQ ID NO.1
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acagcaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccatct tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctactttgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.2
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Phe Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.3
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acgcgaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccatct tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctactttgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.4
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Ala Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Phe Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.5
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acaacaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccatct tcttgaagaa ggactatcca  gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctactttgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.6
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Asn Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Phe Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.7
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acagcaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccgcgt tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctactttgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.8
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ala Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Phe Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.9
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acagcaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccaact tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctactttgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.10
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Asn Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Phe Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.11
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acagcaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccatct tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctacgcggac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.12
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Ala Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.13
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acagcaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccatct tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctacaacgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.14
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Asn Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.15
atgcccgagt cgctagctct gcccaacgac tttgaatggg gcttcgcaac ggccgcctac cagatcgaag gcgccgtcaa agaaggtggc cgcggcccgt ccatctggga cacgtactgc cacctggagc catcgcgcac caacggcgcc aacggcgatg tggcttgcga tcactaccac cgctacgatg aggactttga tctcttgacc aagtacggcg caaaggccta ccgcttctcc ttgtcgtggt cgcggatcat tcccctcggc ggcaggctgg atcccgtcaa cgaggaggga attgagtttt acaacaaact gattgacgcc ctgttgaggc ggggtatcac gccttgggtg actttgtacc actgggatct gcctcaggcg cttcacgatc gctatggagg ctggctcaac gtggaagagg tccagctgga ctttgagcgg tatgcgaggt tgtgctttga acgttttggg gaccgagtcc agaactggat caccatcaac gaaccctgga ttcaggccat ctatggatat gccaccggca gcaacgcccc gggcaggagc agcattaaca agcactccac cgagggcaac actgccactg agccgtggct cgctggaaag gcccagatca tgagccatgc ccgcgccgtg gccgtctaca gcagggactt tcgcccctcg caaaagggcc agatcggcat ctcgctcaac ggcgactact atgagccctg ggacagcaat gagcctcggg acaaggaggc tgctgagcga cggatggaat ttcacattgg ctggtttgcc aatcccaact tcttgaagaa ggactatcca gagagcatga agaagcagct gggcgagagg cttccagccc tcactcccgc ggactttgcc atcctcaatg ccggagagac cgacttctac ggcatgaatt actacacatc ccagttcgcg cgccacctag acggtcccgt ccccgagacg gactatctcg gcgccatcca tgagcaccag gagaataagg acggcagccc cgttggcgag gagagcggcc tcgcctggct gcgctcctgc ccggacatgt tccggaagca tctcgcccgg gtgtacggcc tgtacggcaa gcccatctac atcaccgaga acggatgccc gtgccctgga gaggagaaca tgacgtgcga ggaggccgtc aacgacccct tccgcatccg ctactttgac tcgcacttgg actcgatttc caaggccatt acccaggacg gcgtcgtcgt caaggggtac tttgcgtggg cgttgctcga taacttggaa tggtcagatg gctacggacc cagattcggc gtcacgttca cagactacac caccctcaag cgcacgccca agaagtctgc cctggtcctc aaggacatgt ttgcggcccg gcagagggtt aaagtggcgg cataa
SEQ ID NO.16
Met Pro Glu Ser Leu Ala Leu Pro Asn Asp Phe Glu Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Cys His Leu Glu Pro Ser Arg Thr Asn Gly Ala Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Asp Glu Asp Phe Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Leu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Leu Asp Pro Val Asn Glu Glu Gly Ile Glu Phe Tyr Asn Lys Leu Ile Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp Leu Asn Val Glu Glu Val Gln Leu Asp Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Glu Arg Phe Gly Asp Arg Val Gln Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Gly Asn Thr Ala Thr Glu Pro Trp Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ile Met Ser His Ala Arg Ala Val Ala Val Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Pro Ser Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Pro Trp Asp Ser Asn Glu Pro Arg Asp Lys Glu Ala Ala Glu Arg Arg Met Glu Phe His Ile Gly Trp Phe Ala Asn Pro Asn Phe Leu Lys Lys Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Ile Leu Asn Ala Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Gly Met Asn Tyr Tyr Thr Ser Gln Phe Ala Arg His Leu Asp Gly Pro Val Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Gly Ala Ile His Glu His Gln Glu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Ala Trp Leu Arg Ser Cys Pro Asp Met Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Val Tyr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Cys Pro Cys Pro Gly Glu Glu Asn Met Thr Cys Glu Glu Ala Val Asn Asp Pro Phe Arg Ile Arg Tyr Phe Asp Ser His Leu Asp Ser Ile Ser Lys Ala Ile Thr Gln Asp Gly Val Val Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ser Asp Gly Tyr Gly Pro Arg Phe Gly Val Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Thr Leu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Leu Lys Asp Met Phe Ala Ala Arg Gln Arg Val Lys Val Ala Ala
SEQ ID NO.17
ccggaattcc ccgagtcgct agctctgcc
SEQ ID NO.18
cccaagcttt gccgccactt taaccctctg

Claims (7)

1.一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶S105N-I273N，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，所述β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为48℃。
2.编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶S105N-I273N的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
4.包含权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.包含权利要求4所述表达载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶S105N-I273N在高温条件下降解纤维素材料的应用，所述高温条件为45-50℃。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高温条件为48℃。
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