KR20110051132A - 소의 반추위 메타게놈에서 유래된 신규의 다기능 글리코실 하이드롤라아제 유전자 및 이로부터 코딩되는 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소 반추위 메타게놈에서 유래된 신규의 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의한 형질전환체 및 상기 형질전환체에 의해 생산된 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 단백질에 관한 것으로, 소의 반추위 메타게놈 라이브러리로부터 종래의 기술로 배양하기 힘든 반추세균 유래의 신규 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자를 제공하고 이를 통하여 재조합 효소를 대량 생산할 경우에 세제, 펄프 및 제지산업, 가축의 사료와 식품, 바이오에너지 등 다양한 분야에서 상업적인 용도로 활용이 가능하다.

Description

소의 반추위 메타게놈에서 유래된 신규의 다기능 글리코실 하이드롤라아제 유전자 및 이로부터 코딩되는 단백질{Novel gene encoding multifunctional glycosyl hydrolase from cow rumen metagenome}

본 발명은 소 반추위 메타게놈에서 유래된 신규 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의한 형질전환체 및 상기 형질전환체에 의해 생산된 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소의 반추위 메타게놈 라이브러리를 제작하여 셀룰라아제 활성을 가지는 클론을 선발하고, 상기 클론으로부터 동정된 신규한 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의한 형질전환체 및 상기 형질전환체에 의해 생산된 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 단백질에 관한 것이다.

자연계에 존재하는 미생물 중 배양이 가능한 것들은 대략 0.1~1% 미만에 지나지 않는 것으로 알려져 있다. 메타게놈(Metagenome)은 배양이 불가능한 미생물로부터 유용한 유전자를 발굴하기 위한 효과적인 수단으로서, 1998년 위스콘신 대학에서 미지의 토양미생물을 이용하여 신약탐색에 사용된 이후 해양, 사막, 강 및 온천 등 다양한 환경 시료들에 적용되고 있다. 메타게놈을 이용할 경우 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보는 얻기 힘들지만 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있다는 장점이 있기 때문에 최근에는 유용 유전자 발굴의 대표적인 방법이 되고 있다.

셀룰로오스(cellulose)는 포도당이 베타-1,4-글리코시드 결합(beta-1,4-glycosidic bond)으로 연결된 고분자의 선형 다당류로서 자연계에 존재하는 가장 풍부한 유기물이며 재활용될 수 있는 에너지 자원으로 가치가 매우 높다. 셀룰로오스는 셀룰라아제(cellulase)라는 가수분해 효소에 의해서 구성성분인 포도당으로 분해된다. 현재까지 알려진 셀룰라아제는 크게 엔도-베타-1,4-글루카나제(endo-beta-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4), 엑소-베타-1,4-글루카나제(exo-beta-1,4-glucanase, EC 3.2.1.91), 그리고 베타-글루코시다제(beta-glucosidase, EC 3.2.1.21)의 세가지 형태로 분류될 수 있다. 엔도-베타-1,4-글루카나제는 셀룰로오스 내부 사슬의 베타-1,4 결합을 무작위로 가수분해하고, 엑소-베타-1,4-글루카나제는 엔도-베타-1,4-글루카나제에 의해 생성된 셀룰로오즈 중합체의 환원말단 및 비환원말단을 차례로 가수분해하여 2분자의 포도당이 결합된 셀로비오스를 생산한다. 상기의 셀로비오스는 베타-글루코시다제에 의하여 가수분해되어 최종적으로 포도당이 생성된다.

셀룰라아제는 세제, 펄프 및 제지산업, 가축의 사료와 식품 등 다양한 분야에서 널리 쓰이고 있으며, 최근에는 화석연료를 대체할 차세대 에너지원으로 식물의 바이오매스(biomass)를 분해하여 에탄올을 생산하는 산업에서 핵심기술로 이용되고 있다. 셀룰라아제는 현재 전세계의 산업효소 중 세 번째 규모의 시장을 형성하고 있는데 바이오매스 유래의 수송용 바이오에너지가 상용화 될 경우 시장규모가 더욱 확대될 수 있을 것으로 예측되고 있다.

우수한 셀룰라아제를 확보하기 위하여 많은 연구개발이 이루어져 왔지만 특히 바이오에탄올을 얻기 위한 목질계 바이오매스 유래의 셀룰로오스의 당 변환에 사용될 수 있는 바람직한 특성 및 활성을 가지는 신규 셀룰라아제 개발에 대한 필요성은 여전히 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 우수한 신규 셀룰라아제를 발굴하고자 연구를 진행한 끝에 소의 반추위 메타게놈에서 기존에 밝혀져 있지 않은 셀룰라아제 뿐만 아니라 헤미셀룰라아제 기능을 가진 다기능 글라이코실 하이드롤라아제(glycosyl hydrolase)를 클로닝함으로서 본 발명을 완성하였다

본 발명의 목적은 소 반추위 메타게놈에서 유래된 신규의 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자 및 이로부터 코딩되는 신규의 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소 반추위 메타게놈 유래의 신규 다기능 글라이코실 하이드롤라아제의 코딩 유전자들의 염기서열과 아미노산 서열들을 제공함을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공함을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 소 반추위 시료에서 메타게놈 DNA를 추출하고 이를 포스미드(fosmid) 벡터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 제작하는 단계; 상기 메타게놈 라이브러리에서 셀룰라아제를 스크리닝하는 단계; 셀룰라아제 활성이 있는 메타게놈 클론을 서브 클로닝하고 염기서열을 분석하는 단계; 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 길이가 다른 세 개의 전사해독프레임(open reading frame, ORF)을 얻은 뒤 이들을 각각 발현벡터에 도입하는 단계; 상기의 유전자가 도입된 발현벡터들을 숙주세포에 도입하여 형질전환시키는 단계; 상기의 형질전환체들을 이용하여 재조합 단백질을 발현시키고 다양한 다당류들에 대한 가수분해 활성을 확인하는 단계; 최종적으로 선발된 전사해독프레임이 도입된 발현벡터에서 발현된 재조합 효소를 정제하고 효소의 특성을 파악하는 단계로 구성된다.

본 발명은 소의 반추위 메타게놈 라이브러리로부터 종래의 기술로 배양하기 힘든 반추세균 유래의 신규의 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자를 이용하여 재조합 다기능 글라이코실 하이드롤라아제를 대량 생산할 경우에 세제, 펄프 및 제지산업, 가축의 사료와 식품, 바이오에너지 등 다양한 분야에서 상업적인 용도로 활용이 가능하다.

도 1은 콩고레드(Congo red) 염색방법으로 평판 배지 위에서 메타게놈 라이브러리에서 셀룰라아제 활성이 있는 재조합 플라스미드를 가진 형질전환체를 선발하는 그림이다(A: 메타게놈 라이브러리의 셀룰라아제 활성 확인, B: 선발된 형질전환체의 셀룰라아제 활성 재확인).
도 2는 본 발명에 의해 확보된 ORF-E의 유전자 구조를 도식적으로 함축하여 표현한 것이다(GH: glycoside hydrolase).
도 3은 ORF-E와 기존의 알려진 Prevotella bryontii의 자일라나제(AAC97596), 반추동물 위에서 분리한 셀룰라아제(ABB46200)와의 상동성 비교를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명에 의한 전사해독프레임들을 코딩하는 유전자들과 이들이 삽입된 재조합 발현벡터들을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5은 글라이코실 하이드롤라아제 코딩 유전자인 reng13을 포함하는 재조합 벡터 pEREng13의 모식도이다.
도 6은 글라이코실 하이드롤라아제 코딩 유전자인 reng43을 포함하는 재조합 벡터 pEREng43의 모식도이다.
도 7은 글라이코실 하이드롤라아제 코딩 유전자인 reng16을 포함하는 재조합 벡터 pEREng16의 모식도이다.
도 8은 메타게놈 유래 신규 글라이코실 하이드롤라아제 유전자로 형질전환시킨 대장균 E. coli HIT-21/pEREng13, E. coli HIT-21/pEREng43, E. coli HIT-21/pEREng63, E.coli HIT-21/pEREng16에서 발현된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 그림으로서,
lane M은 분자량 표준 마커;
lane 1, lane 3, lane 6 및 lane 8은 pET21a가 형질전환된 음성대조군의 세포추출액;
lane 2은 0.5mM의 IPTG를 처리한 E.coli HIT-21/pEREng13의 세포추출액;
lane 4은 IPTG를 처리하지 않은 E.coli HIT-21/pEREng43의 세포추출액;
lane 5는 0.5mM의 IPTG를 처리한 E.coli HIT-21/pEREng43의 세포추출액;
lane 7은 0.5mM의 IPTG를 처리한 E.coli HIT-21/pEREng63의 세포추출액;
lane 9는 IPTG를 처리하지 않은 E.coli HIT-21/pEREng16의 세포추출액;
lane 10은 0.5mM의 IPTG를 처리한 E.coli HIT-21/pEREng16의 세포추출액을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 의한 형질전환 대장균 E. coli HIT-21/pEREng13, E. coli HIT-21/pEREng43, E. coli HIT-21/pEREng63, E. coli HIT-21/pEREng16에서 발현된 단백질들의 다당류들에 대한 가수분해 활성을 나타낸 그림이다.
도 10은 재조합 단백질 REng13 및 REng43의 발현 및 정제를 SDS-PAGE로 확인한 결과로서,
lane M은 분자량 표준 마커;
lane C는 pET21a가 형질전환된 음성대조군의 세포추출액;
lane CL은 0.5mM의 IPTG를 처리한 E.coli HIT-21/pEREng13 또는 E.coli HIT-21/pEREng43의 세포추출액;
lane E3~E7은 0.5mM의 IPTG를 처리한 E.coli HIT-21/pEREng13 또는 E.coli HIT-21/pEREng43의 세포추출액을 HIS*Bind 컬럼에 가하고 수차례 세척한 후 용출시킨 분획들을 나타낸다.
도 11은 재조합 단백질 REng13 및 REng43의 활성에 온도가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 재조합 단백질 REng13 및 REng43의 활성에 pH가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다(파란색: REng13, 붉은색: REng43).
도 13은 재조합 단백질 REng13 및 REng43의 셀로올리고당 가수분해산물을 TLC로 분석한 결과를 나타낸 그림으로서,
Lane 1은 셀로올리고당 혼합물(G1, 글루코스; G2, 셀로비오스; G3, 셀로트리오스; G4, 셀로테트라오스; G5, 셀로펜타오스);
Lane 2는 셀로비오스를 재조합 REng13 또는 REng43와 반응시킨 가수분해산물;
Lane 3는 셀로트리오스를 재조합 REng13 또는 REng43와 반응시킨 가수분해산물;
Lane 4는 셀로테트라오스를 재조합 REng13 또는 REng43와 반응시킨 가수분해산물;
Lane 5는 셀로펜타오스를 재조합 REng13 또는 REng43와 반응시킨 가수분해산물을 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

<실시예 1>

소 반추위 시료의 메타게놈 라이브러리의 구축

1-1. 소 반추위 시료의 메타게놈 DNA의 분리

자동시료추출장치 캐뉼라를 이용하여 반추위 시료를 확보하였다. 반추위 시료는 4℃에서 자연침전시켜 입자가 큰 불순물들을 우선 제거한 후 1,000rpm 미만의 저속으로 원심분리시켜 균체외의 불순물들을 추가로 제거하여 미생물체를 모았다. 상기의 미생물체는 metagenomic DNA isolation kit(Metagenomic DNA isolation kit for water, Epicentre, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 DNA end-repair 효소 혼합액(Epicentre, USA)으로 추출된 DNA말단을 블런트 엔드(blunt end)로 수선하였다.

1-2. 반추위 메타게놈 라이브러리 구축

상기 1-1의 블런트 엔드(Blunt end)로 수선된 DNA는 0.4%의 아가로즈 겔로 전기영동하여 약 40kb 크기의 DNA만을 겔 추출키트(QIAEX II gel extraction kit, Qiagen, Germany)로 정제한 뒤 포스미드 라이브러리 제조 키트(Copy Control Fosmid Library Production Kit, Epicentre, USA)를 이용하여 포스미드 pCC1FOS 벡터에 연결한 후 λDNA 패키징 키트에 포장하여 대장균(E.coli) EPI300-T1에 형질도입하여 반추위 메타게놈 라이브러리를 확보하였다.

<실시예 2>

셀룰라아제 활성을 가진 재조합 플라스미드의 탐색 및 분리

메타게놈 라이브러리에서 셀룰라아제 활성이 있는 재조합 플라스미드를 찾기 위하여 0.5%의 CM-셀룰로오스(carboxymethyl-cellulose)가 포함된 LB 평판배지에 상기 형질전환체들을 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 평판 배지를 0.5%(w/v) 콩고레드용액으로 15분간 염색한 후 1M NaCl로 15분간 탈색시켰다. 셀룰라아제 효소 활성은 콜로니 주위에 형성되는 투명한 환형으로 알 수 있는데, 여기에서는 1개의 형질전환체가 셀룰라아제 활성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 1). 상기의 셀룰라아제 활성을 나타내는 형질전환체를 R1-4-G9이라 명명하였다.

<실시예 3>

셀룰라아제 활성을 가진 재조합 플라스미드로부터 셀룰라아제 유전자 염기서열 결정

3-1. 셀룰라아제 활성을 가진 재조합 플라스미드의 샷건 라이브러리 제작

상기 실시예 2의 셀룰라아제 활성이 있는 형질전환체 R1-4-G9으로부터 플라스미드 미디 키트(Plasmid midi kit, QIAGEN, Germany)를 사용하여 재조합 플라스미드 pC1R14G9를 분리하였다. 상기 분리된 재조합 플라스미드는 하이드로쉐어(hydroshear)장비를 이용하여 조각화(shearing)한 뒤 DNA말단을 블런트 엔드(blunt end)로 수선하였다. 수선된 DNA 조각들은 전기영동하여 2~5kb 위치에 해당하는 겔만을 도려낸 후 겔 추출키트로 정제한 뒤 pC31A21벡터에 서브클로닝하여 샷건 라이브러리를 제작하였다.

3-2. 셀룰라아제 활성을 가진 재조합 플라스미드의 염기서열 분석

상기 3-1에서 제작된 샷건 라이브러리의 염기서열 분석은 자동염기서열분석기(ABI 3730 DNA analyzer)를 이용하여 수행하였다. 샷건 라이브러리의 염기서열 분석결과를 조합한 결과 상기 재조합플라스미드 pC1R14G9에는 32,747bp로 이루어진 DNA 단편이 도입되어 있다는 것을 알 수 있었다. 상기 DNA 단편의 염기서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 ORF finder로 분석한 결과 셀룰라아제 중 하나인 엔도-베타-1,4-글루카나제로 추정되는 2,760bp의 전사해독프레임(open reading frame, ORF)를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 전사해독프레임을 ORF-E라 명명하였다.

<실시예 4>

신규 셀룰라아제 염기서열의 분석

상기 실시예 3에서 밝혀낸 엔도-베타-1,4-글루카나제로 추정되는 전사해독프레임 ORF-E는 920개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 N-말단 부위에 세포막통과영역(transmembrane domain)을 가지며, 두개의 글리코시드 하이드롤라아제(glycoside hydrolase) 활성부위(catalytic domain)를 가지고 있었다(도 2). 글리코시드 하이드롤라아제는 2개 또는 그 이상의 탄수화물 사이에서 혹은 탄수화물과 비탄수화물 사이의 글리코시딕 결합(glycosidic bond)을 가수분해 하는 효소로 각 효소간의 아미노산 상동성 및 구조적인 특성을 기초로 약 115개의 그룹으로 나뉘어져 있다. ORF-E에 존재하는 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 26계열(glycoside hydrolase family 26)은 베타-만나나아제(beta-mannanase)와 베타-1,3-자일라나제(beta-1,3-xylanase) 활성을 보이는 것으로 알려져 있고, 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 5계열(glycoside hydrolase family 5)의 경우 키토사나아제(chitosanase), 베타-만노시다제(beta-mannosidase), 셀룰라아제(cellulase) 등의 광범위한 활성을 보이는 것으로 알려져 있다. 또한 ORF-E의 염기서열을 이용한 아미노산 상동성 분석 결과, 기존에 알려진 Prevotella bryantii의 자일라나제(Xylanase) 혹은 반추동물의 위에서 분리한 셀룰라아제와 각각 54%, 62% 일치함을 확인할 수 있었다(도 3).

<실시예 5>

대장균에서 신규 셀룰라아제의 기능적 발현

5-1. 형질전환체의 제조

본 발명의 신규 셀룰라아제를 발현시키기 위하여 상기 실시예 3의 ORF-E의 염기서열에서 개시코돈(ATG)의 위치 및 포함하는 활성부위(catalytic domain)에 따라서 네 종류의 전사해독프레임을 코딩하는 DNA 단편들을 BamHI과 XhoI 제한효소 부위가 포함되도록 PCR로 증폭하였다. 상기의 PCR로 증폭된 DNA 단편들은 reng13(염기 서열: 서열번호 1, 아미노산 서열: 서열번호 2), reng43(염기서열: 서열번호 3, 아미노산 서열: 서열번호 4), reng63(염기서열: 서열번호 5, 아미노산서열: 서열번호 6), reng16(염기서열: 서열번호 7, 아미노산서열: 서열번호 8)이라 명명하였다. 이 DNA 단편들은 상기 제한효소들로 절단한 후, 동일한 효소로 절단된 pET21a(Novagen, USA) 벡터에 도입하고, 이들을 각각 pEREng13, pEREng43, pEREng63, pEREng16으로 명명하였다(도 4). 상기 재조합 벡터 pEREng13에 대한 개열지도는 도 5에, 재조합 벡터 pEREng43에 대한 개열지도는 도 6에, 재조합 벡터 pEREng16에 대한 개열지도는 도 7에 나타내었다. 상기의 벡터들을 발현숙주로서 사용된 대장균 균주 E.coli HIT-21(RBC, USA)에 도입하여 형질전환시켰다. 이들을 각각 E.coli HIT-21/pEREng13, E.coli HIT-21/pEREng43, E.coli HIT-21/pEREng63, E.coli HIT-21/pEREng16 라고 명명하였다.

5-2. 셀룰라아제 효소의 발현

상기 형질전환체들을 액상의 LB배지에서 O.D.값이 0.4~0.6이 되도록 현탁배양한 후 배지에 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 30℃, 200rpm에서 4시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 상기의 배양액들은 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 균체만을 모은 뒤 Bugs Buster Master Mix 용액(Novagen, USA)을 가하여 세포를 파괴시킨 후 원심분리하여 불용성인 잔여물을 제거하였다. 여기서 얻은 세포추출액들을 효소활성을 확인하는데 사용하였다. 한편, 세포추출액들은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였는데, 형질전환체 E.coli HIT-21/pEREng13, E.coli HIT-21/pEREng43, E.coli HIT-21/pEREng63, E.coli HIT-21/pEREng16에서 각각 약 103, 63, 54, 40 kDa 크기의 재조합 단백질들이 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 8). 유전자 reng13, reng43, reng16으로부터 발현된 재조합 단백질들을 각각 REng13, REng43, REng16이라 명명하였다.

5-3. 재조합 글라이코실 하이드롤라아제들의 가수분해 활성 확인

상기 5-2의 세포추출액들을 사용하여 다당류들에 대한 가수분해 활성을 확인하였다. 효소반응은 100 mM Sodium Acetate 완충용액 pH 5.5, 1%(w/v)의 다당류 그리고 10%(v/v)의 세포추출액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 진행하였다. 효소의 활성은 다당류가 분해되어 나오는 환원당을 정량하여 측정하였으며 환원당의 정량에는 공지의 DNS 방법(Miller GL. Anal. Chem., (1959) 31: 426-428)을 이용하였다. 분석결과 재조합 단백질 REng13은 CM-셀룰로오스, 자일란(xylan), 베타-글루칸(beta-glucan), 베타-만난(beta-mannan)을 모두 가수분해하였고, 재조합 단백질 REng43은 CM-셀룰로오스, 자일란, 베타-글루칸을 가수분해할 수 있었다. 재조합 단백질 REng16은 베타-만난만을 분해하는 활성을 가지고 있었으며, 재조합 단백질 REng63은 아무 활성도 나타나지 않았다(도 9).

이상의 결과를 통하여 본 발명에 의한 재조합 단백질 REng13은 셀룰로오스 뿐만 아니라 자일란, 베타-만난과 같은 헤미셀룰로오스도 분해할 수 있는 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 임을 알 수 있었다.

한편, 재조합 단백질 REng43과 REng16 사이에 존재하는 기질 특이성의 차이를 통하여 두 활성부위 중 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 26계열은 베타-만난아제(beta-mannanase) 활성을 나타내며, 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 5계열은 셀룰라아제와 자일라나아제(xylanase) 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

상기 형질전환체 E.coli HIT-21/pEREng43은 2009년 9월 16일자에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였으며, 상기 형질전환체 E. coli HIT-21/pEREng13과 E.coli HIT-21/pEREng16은 2010년 3월 15일자에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. 상기 형질전환체 E.coli HIT-21/pEREng43의 기탁번호는 KCTC 11556BP이고, 상기 형질전환체 E.coli HIT-21/pEREng13의 기탁번호는 KCTC 11655BP 이며, 상기 형질전환체 E.coli HIT-21/pEREng16의 기탁번호는 KCTC 11656BP이다.

<실시예 6>

재조합 단백질의 특성 파악

6-1. 재조합 단백질 REng13 및 REng43의 발현 및 정제

본 발명에 의한 재조합 단백질 REng13 및 REng43을 각각 발현시킨 후 정제하여 특성을 살펴보았다. 상기 5-2와 동일한 방법으로 형질전환체 E.coli HIT-21/pEREng13 과 E.coli HIT-21/pEREng43으로부터 각각 단백질을 발현시킨 후 HIS*Bind 컬럼(Novagen, USA) 및 HIS*Bind buffer 키트(Novagen, USA)를 사용하여 재조합 단백질들을 정제하였다(도 10).

6-2. 온도 및 pH에 대한 특성 파악

본 발명에 의한 재조합 단백질 REng13 및 REng43의 활성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위하여 30~80℃ 사이에서 CM-셀룰로오스 가수분해 반응을 수행한 결과 재조합 단백질 REng13 및 REng43 모두 43℃에서 최적의 활성을 나타내었다(도 11).

재조합 단백질들의 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 다양한 pH의 완충용액에서 CM-셀룰로오스 가수분해 반응을 수행한 결과 본 발명의 재조합 단백질 REng13과 REng43은 모두 pH 3.5 에서 최적의 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 12).

6-3. 재조합 단백질들의 셀로올리고당(cellooligosaccharide) 분해양상 확인

본 발명에 의한 재조합 단백질들의 셀로올리고당 분해 양상을 확인해보았다. 셀로펜타오스(cellopentaose), 셀로테트라오스(cellotetraose), 셀로트리오스(cellotriose), 셀로비오스(cellobiose)를 각각 5mg/mL씩 첨가한 100mM sodium acetate 완충용액(pH 5.3) 20μL에 효소용액 5μL를 혼합하여 43℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 가수분해산물을 TLC로 확인하였다. 이동상으로는 1-부탄올:아세트산:물 (v/v/v, 2:1:1)을 사용하였으며 전개 후 5% 황산이 포함된 메탄올 용액을 분사하고 100℃로 가열하여 반응을 확인하였다. TLC 전개 결과 재조합 단백질 REng13과 REng43 사이에 차이는 없었으며 셀로펜타오스는 거의 완벽하게 분해시킨 반면 셀로테트라오스는 부분적으로 분해시킬 수 있었다(도 13). 셀로트리오스나 셀로비오스는 거의 분해시키지 못하는 것으로 보아 본 발명에 의한 재조합 단백질들은 4개 이상 결합된 셀로올리고당을 기질로 이용 가능한 것으로 보인다.

한국생명공학연구원 KCTC11556BP 20090916 한국생명공학연구원 KCTC11655BP 20100225 한국생명공학연구원 KCTC11656BP 20100225

<110> KOREA YAKULT CO., LTD <120> Novel gene encoding multifunctional glycosyl hydrolase from cow rumen metagenome <130> P10-10 <150> KR 10-2009-0107596 <151> 2009-11-09 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2760 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DNA isolated from cow remen directly <400> 1 atgaagaaca tgaaatcatt actcacaatg gttgtgttgc tgctgacggc aagtgccatg 60 tatgcagaca tccccacaat gcctcaaacg gcatcgaccg atgctgctaa gaagctgtat 120 ggctatttcg ttgagcagta tggtcagaag accatctcca gcgtgatggc tgatgtcaac 180 tggaacaata cgattgctga gaaggtgaag accttcacag gcaagtatcc cgccatgaac 240 tgctatgact ttatccatat ctacgtgccc aatcagggca gcaatgggtg ggttaactac 300 tcggatatca cgcctgttag cgagtggcat aatgctggcg gtattgtaca gttgatgtgg 360 cacttcaatg ttcctctaat ggagactacc gagatcaagg atgatggttc gggtgttacc 420 tgttcacccg acaagaccac gttcaaagca cagaacgctt tggtcagtgg cacgtgggag 480 aacaaatggt tctacgaaca gatggacaag gtcgttgccg tagtcctgaa actgcaggag 540 gctggcatcg ctgccacgtg gcgtccgttt cacgaggctg ccggcaatgc tacgctgaag 600 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gtcttggttc tggtggggct acgatggtgc cgataccttt 660 aaaaaactgt gggtggctat gttcgactac ttcaagcaga agggtgtcca gaacctcatc 720 tggatatgga ccacgcagaa ctacaatggt gacagcatgt cgtacaatca ggacacagac 780 tggtatcctg gtgatgccta cgttgatatg gtggcccgcg atctctatgg ctacgatgct 840 gacaagaata agctggagtt cacagaaatc caggctgctt atccaaacaa gatggttgta 900 ttgggcgagt gtggcaaggg cgacagcggc gagcaaggta cgatgagcga ctgttggact 960 aagggtgcca agtggggcca ctttttggtg tggtatcagg gcgaacaggg ttctaccaac 1020 accatgtgca gcgatgcttg gtggaaggat gctatgagta gtgccaacgt cgtgacccgt 1080 gaccagttgc ctaacctcgt tccaggtaag gtggagtttg agactgctac tgat 1134 <210> 8 <211> 352 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Otained from cow rumen <400> 8 Met Pro Gln Thr Ala Ser Thr Asp Ala Ala Lys Lys Leu Tyr Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Val Glu Gln Tyr Gly Gln Lys Thr Ile Ser Ser Val Met Ala Asp 20 25 30 Val Asn Trp Asn Asn Thr Ile Ala Glu Lys Val Lys Thr Phe Thr Gly 35 40 45 Lys Tyr Pro Ala Met Asn Cys Tyr Asp Phe Ile His Ile Tyr Val Pro 50 55 60 Asn Gln Gly Ser Asn Gly Trp Val Asn Tyr Ser Asp Ile Thr Pro Val 65 70 75 80 Ser Glu Trp His Asn Ala Gly Gly Ile Val Gln Leu Met Trp His Phe 85 90 95 Asn Val Pro Leu Met Glu Thr Thr Glu Ile Lys Asp Asp Gly Ser Gly 100 105 110 Val Thr Cys Ser Pro Asp Lys Thr Thr Phe Lys Ala Gln Asn Ala Leu 115 120 125 Val Ser Gly Thr Trp Glu Asn Lys Trp Phe Tyr Glu Gln Met Asp Lys 130 135 140 Val Val Ala Val Val Leu Lys Leu Gln Glu Ala Gly Ile Ala Ala Thr 145 150 155 160 Trp Arg Pro Phe His Glu Ala Ala Gly Asn Ala Thr Leu Lys Ser Gly 165 170 175 Ala Ser Trp Gly Lys Ser Trp Phe Trp Trp Gly Tyr Asp Gly Ala Asp 180 185 190 Thr Phe Lys Lys Leu Trp Val Ala Met Phe Asp Tyr Phe Lys Gln Lys 195 200 205 Gly Val Gln Asn Leu Ile Trp Ile Trp Thr Thr Gln Asn Tyr Asn Gly 210 215 220 Asp Ser Met Ser Tyr Asn Gln Asp Thr Asp Trp Tyr Pro Gly Asp Ala 225 230 235 240 Tyr Val Asp Met Val Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Tyr Asp Ala Asp Lys 245 250 255 Asn Lys Leu Glu Phe Thr Glu Ile Gln Ala Ala Tyr Pro Asn Lys Met 260 265 270 Val Val Leu Gly Glu Cys Gly Lys Gly Asp Ser Gly Glu Gln Gly Thr 275 280 285 Met Ser Asp Cys Trp Thr Lys Gly Ala Lys Trp Gly His Phe Leu Val 290 295 300 Trp Tyr Gln Gly Glu Gln Gly Ser Thr Asn Thr Met Cys Ser Asp Ala 305 310 315 320 Trp Trp Lys Asp Ala Met Ser Ser Ala Asn Val Val Thr Arg Asp Gln 325 330 335 Leu Pro Asn Leu Val Pro Gly Lys Val Glu Phe Glu Thr Ala Thr Asp 340 345 350

Claims (12)

1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자.
   
2. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 단백질.
   
3. 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자.
   
4. 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 단백질.
   
5. 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 만난아제 유전자.
   
6. 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 만난아제 단백질.
   
7. 서열번호 1의 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자를 포함하는 도 5에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터 pEREng13.
   
8. 제7항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) HIT-21/pEREng13 형질전환체(기탁번호: KCTC 11655BP).
   
9. 서열번호 3의 다기능 글라이코실 하이드롤라아제 유전자를 포함하는 도 6에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터 pEREng43.
   
10. 제9항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) HIT-21/pEREng43 형질전환체(기탁번호: KCTC 11556BP).
    
11. 서열번호 7의 만난아제 유전자를 포함하는 도 7에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터 pEREng16.
    
12. 제11항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) HIT-21/pEREng16 형질전환체(기탁번호: KCTC 11656BP).

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