KR101190632B1

KR101190632B1 - 소의 반추위 메타게놈에서 유래된 신규 베타-글루코시다아제 유전자

Info

Publication number: KR101190632B1
Application number: KR1020100082034A
Authority: KR
Inventors: 박수동; 허건; 안영태; 이정희; 허철성
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2012-10-15
Also published as: KR20120018986A

Abstract

본 발명은 소 반추위 메타게놈에서 유래된 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 소의 반추위 메타게놈 라이브러리로부터 종래의 기술로 획득하기 힘든 반추세균 유래의 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자를 이용하여 재조합 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 대량 생산할 경우 세제, 펄프, 가축의 사료와 식품, 바이오에너지 등의 다양한 분야에서 상업적인 용도로 활용이 가능하다.

Description

소의 반추위 메타게놈에서 유래된 신규 베타-글루코시다아제 유전자{Novel gene encoding β-glucosidase from cow rumen metagenome}

본 발명은 소의 반추위 제1위인 루멘(rumen)으로부터 분리한 메타게놈에서 유래된 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소의 반추위 메타게놈 라이브러리를 제작하여 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성을 가지는 클론을 선발하고, 상기 클론으로부터 동정된 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

셀룰로오스는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질로 석탄이나 석유처럼 고갈에 대하여 걱정할 필요가 없는 재생 가능한 자원이다. 또한 이들 자원은 농산 폐기물이 범람하는 현재에 있어 주요한 환경오염원으로 작용하고 있기도 하다. 그러므로 이들 다당류에 대한 효율적인 당화공정의 개발은 식량, 에너지, 환경문제에 큰 도움이 될 것으로 판단된다. 따라서 오랫동안 셀룰로오스를 당화시키기 위한 연구가 이루어져 왔으며, 이중 특히 당화효소의 개발에 초점을 맞춰 많은 연구가 이루어져 왔다. 그 결과 현재에는 많은 당화효소의 용도가 다양하게 개발 되어 섬유, 세제, 사료산업 등에서 상업화가 이루어졌고 새로운 응용분야에 대한 연구도 활발하게 이루어지고 있다.

식물의 세포벽은 셀룰로오스(Cellulose), 헤미셀룰로스(Hemicellulose), 리그닌(Lignin)과 같은 중합체로 구성되어 있으며, 그 중 셀룰로오스가 가장 많이 존재하고 있다.

셀룰로오스는 포도당 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종 결합체로서 셀룰로오스를 완전 분해하기 위해서는 엔도 β-1,4-글루카나아제(endo β-1,4-glucanase), 엑소 β-1,4-글루카나아제(exo β-1,4-glucanase, cellobiohydrolase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase, cellobiase)의 세가지 효소가 필요하다. 엔도 β-1,4-글루카나아제는 안쪽에서 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고, 엑소 β-1,4-글루카나아제가 비환원성 말단에서 포도당 이당체인 셀로비오스(Cellobiose)로 절단해 나간다. 셀로비오스는 베타-글루코시다아제에 의해 포도당으로 최종 분해된다. 베타-글루코시다아제는 두 개의 글루코오스(Glucose) 혹은 글루코오스와 다른 치환된 분자 사이의 베타-1,4-글루코시딕 결합(beta-1,4-glucosidic bond)을 가수분해하여 글루코오스를 방출하는 효소로 다양한 베타 D-글루코사이드(Beta D-glucoside) 계열의 기질에 대한 특이성이 존재하는 일종의 엑소셀룰라아제(Exocellulase)이다. 일반적으로 베타-글루코시다아제는 약 글루코오스 1~4개 정도의 중합이 이루어진 셀로비오스, 셀로트리오스(Cellotriose), 셀로테트라오스(Cellotetraose) 등에 대한 가수분해 효과를 가지고 그 이상의 중합이 이루어진 셀로펜타오스(Cellopentaose) 등의 물질에 대해서는 효소 활성이 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 또한 글루코오스 두 개로 이루어진 셀로비오스의 가수분해에 대해 특이적인 활성을 가지는 셀로비아제(Cellobiase) 및 눈에서 박테리아 감염을 막기 위해 눈물로 분비되는 라이소자임(Lysozyme) 또한 베타-글루코시다아제의 범위에 속하기도 한다.

종래에 있어 이들 효소의 생산은 주로 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코델마(Trichoderma)에 의해 이루어져 왔다. 특히 셀룰라아제 생산균주로는 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei)가 대표적이다. 그러나 효소의 생산과 활성은 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못하다는 문제점과 유당(Lactose)과 같은 값비싼 물질을 탄소원으로 사용하고 있어 생산단가가 높은 문제점을 가지고 있다. 이것은 바이오매스로(biomass)로부터 에탄올을 생산하는 공정에서 비용이 가장 큰부분(약 60%)을 차지하게 하는 요인으로 작용하고 있다.

이에 본 발명자들은 생산성 높은 신규 효소의 선발과 대장균을 이용한 생산량의 극대화를 통해 경제적인 효소 생산 및 제공을 위해 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 소의 반추위 메타게놈에서 유래된 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자 및 상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소의 반추위 메타게놈 유래의 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자들의 염기서열과 아미노산 서열을 제공함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 신규의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 소의 루멘(rumen)으로부터 시료를 채취하는 단계, 채취한 시료에서 메타게놈(Metagenome)을 획득하는 단계, 획득한 효소의 유전자 결정 및 분석 단계, 효소의 활성 측정단계로 구성된다.

본 발명은 소의 반추위 메타게놈 라이브러리로부터 종래의 기술로 배양하기 힘든 반추위 유래 박테리아의 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자를 이용하여 재조합 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 대량 생산할 경우에 세제, 펄프 및 제지 산업, 가축의 사료와 식품, 바이오에너지 등의 다양한 분야에서 상업적인 용도로 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자의 구조를 도식적으로 함축하여 표현한 것이다.
도 2는 본 발명의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자와 기존의 알려진 프리보텔라(Prevotella), 박테로이드(Bacteroides)의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자와의 상동성 비교를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 최적 활성 부위를 찾기 위한 재조합 발현 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 도 3의 재조합 발현벡터에 의한 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 발현을 나타낸 것이다
도 5는 pMAL-c2 벡터에 클로닝 된 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 셀로비오스(Cellobiose, 검은색 막대그래프) 및 파라-니트로페닐 글루코시드(pNPG, 회색 막대그래프)에 대한 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 셀로비오스(Cellobiose), 알부틴(Arbutin), 살리신(Salicin), 파라-니트로페닐 글루코시드(pNPG)로부터 베타-글루코시다아제(회색 막대그래프)의 효소 반응에 의해 생성된 글루코오스의 양을 나타낸 것이다. 글루코오스 생성량의 비교를 위하여 대조군으로 공벡터(pET21a, 검정 막대그래프), 시토파가 존스니(Cytophaga jhonsonii) chu_2268(짙은 회색 막대그래프), chu_2273(엷은 회색 막대그래프)을 이용하였다.
도 8은 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 코딩 유전자인 rbgl을 포함하는 재조합 벡터 prbgl의 모식도이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

<실시예 1>

소 반추위 시료의 메타게놈 라이브러리의 구축

1-1. 반추위 시료의 확보 및 메타게놈의 추출

소의 반추위의 제1위인 루멘에서 자동시료추출장치 캐뉼라를 이용하여 반추위 시료를 획득한 후, 4℃에서 자연침전시켜 입자가 큰 불순물들을 우선 제거한 후, 1,000rpm 미만의 저속으로 원심분리시켜 균체외의 불순물들을 추가로 제거하였다. 상기의 반추위액으로부터 metagenomic DNA isolation kit(Metagenomic DNA isolation kit for water, Epicentre, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 DNA end-repair 효소 혼합액(Epicentre, USA)으로 추출된 DNA말단을 블런트 엔드(blunt end)로 수선하였다.

1-2. 반추위 메타게놈 라이브러리 구축

상기 1-1의 블런트 엔드(Blunt end)로 수선된 DNA는 0.4%의 아가로즈 겔로 전기영동하여 약 40kb 크기의 DNA만을 겔 추출키트(QIAEX II gel extraction kit, Qiagen, Germany)로 정제한 뒤 포스미드 라이브러리 제조 키트(Copy Control Fosmid Library Production Kit, Epicentre, USA)를 이용하여 포스미드 pCC1FOS 벡터에 연결한 후 λDNA 패키징 키트에 포장하여 대장균(E.coli) EPI300-T1에 형질도입하여 반추위 메타게놈 라이브러리를 확보하였다.

<실시예 2>

메타게놈의 염기서열 분석

상기 실시예 1의 제작된 메타게놈을 하이드로쉐어(hydroshear)장비를 이용하여 조각화(shearing)한 뒤 DNA말단을 블런트 엔드(blunt end)로 수선하였다. 수선된 DNA 조각들은 전기영동하여 2~5kb 위치에 해당하는 겔만을 도려낸 후, 겔 추출키트로 정제한 뒤, pC31A21벡터에 서브클로닝하여 샷건 라이브러리를 제작하였고, 염기 서열 분석은 자동염기서열분석기(ABI 3730 DNA analyzer)를 이용하여 수행하였다.

샷건 라이브러리의 염기서열 분석결과를 조합한 결과, 상기 메타게놈은 32,747bp로 이루어진 DNA 단편이 도입되어 있다는 것을 알 수 있었다. 상기 DNA 염기서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 ORF finder로 분석한 결과 셀룰라아제 중 하나인 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)로 추정되는 2,469bp의 전사해독프레임(open reading frame, ORF)을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이 전사해독프레임을 'rbgl'이라 명명하였다.

<실시예 3>

베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자 염기서열의 분석

상기 실시예 2에서 밝혀낸 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)로 추정되는 전사해독프레임 rbgl은 822개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 N-말단 부위에 세포막통과영역(Transmembrane domain)을 가지며, 하나의 글리코시드 하이드롤라아제(Glycoside hydrolase) 활성부위(catalytic domain)를 가지고 있었다(도 1). 글리코시드 하이드롤라아제는 2개 또는 그 이상의 탄수화물 사이에서 혹은 탄수화물과 비탄수화물 사이의 글리코시딕 결합(Glycosidic bond)을 가수분해 하는 효소로 각 효소간의 아미노산 상동성 및 구조적인 특성을 기초로 약 115개의 그룹으로 나뉘어져 있다. rbgl에 존재하는 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 3계열(Glycoside hydrolase family 3)은 일반적으로 베타-글루코시다아제(EC 3.2.1.21)에 널리 분포되어 있는 것으로 확인되었다. 또한 rbgl의 염기서열을 이용한 아미노산 상동성 분석 결과, 기존에 알려진 프리보텔라 브리안티(Prevotella bryantii), 프리보텔라 오리스(Prevotella oris)의 베타-글루코시다아제와 각각 61%, 62% 일치함을 확인할 수 있었다(도 2).

<실시예 4>

대장균에서 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 발현

4-1. 형질전환체의 제조

본 발명의 신규 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 발현시키기 위하여 상기 실시예 2의 rbg1(염기서열: 서열번호 1, 아미노산 서열: 서열번호 2)의 염기서열에서 신호서열(Signal sequence)의 존재 여부를 확인하기 위하여 rbg1의 N-말단에서 42개의 아미노산이 결실된 rbg1-42, N-말단에서 66개의 아미노산이 결실된 rbg1-66을 중합효소 증폭반응(PCR)을 통해 증폭하였고, 효소 활성을 가지는 최소한의 ORF를 결정하기 위하여 N-말단에서 267개의 아미노산이 결실된 rbg1-267, N-말단에서 391개의 아미노산이 결실된 rbg1-391, N-말단만을 포함하는 rbg1-n을 중합효소 증폭반응(PCR)을 통해 증폭하였다.

상기 증폭된 DNA 단편들을 제한효소 BamHI과 XhoI으로 절단 한 후, 동일한 효소로 절단된 pET21a(Novagen, USA)벡터에 삽입하고, 각각 prbgl-42, prbgl-66, prbg1-267, prbg1-391, prbg1-n으로 명명하였다(도 3).

또한, rbg1(염기서열: 서열번호 1, 아미노산 서열: 서열번호 2)의 염기서열을 중합효소 증폭반응을 통해 증폭시켜 제한효소 BamHI과 XhoI으로 절단 한 후, 동일한 효소로 절단된 pET21a(Novagen, USA)벡터에 삽입하고, prbg1이라 명명하였다(도 8참조).

상기 벡터들을 발현숙주로서 사용된 대장균 균주 E.coli HIT-21(RBC, USA)에 도입하여 형질전환시켰다. 이들을 각각 E.coli HIT-21/prbg1-42, E.coli HIT-21/prbg1-66, E.coli HIT-21/prbg1-267, E.coli HIT-21/prbg1-391, E.coli HIT-21/prbg1-n으로 명명하였다.

4-2. 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 발현

상기 형질전환체들을 액상의 LB배지에서 O.D.값이 0.4~0.6이 되도록 현탁배양한 후 배지에 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 30℃, 200rpm에서 4시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 상기의 배양액들은 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 균체만을 모은 뒤 Bugs Buster Master Mix 용액(Novagen, USA)을 가하여 세포를 파괴시킨 후 원심분리하여 불용성인 잔여물을 제거하였다. 여기서 얻은 세포추출액들을 효소활성을 확인하는데 사용하였다. 한편, 세포추출액들은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였는데, 형질전환체 E.coli HIT-21/prbg1-42, E.coli HIT-21/prbg1-66, E.coli HIT-21/prbg1-267, E.coli HIT-21/prbg1-391, E.coli HIT-21/prbg1-n에서 각각 약 85kDa, 82kDa, 61kDa, 46kDa, 42kDa 크기의 재조합 단백질들이 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 4).

상기 대부분의 단백질은 비가용성인 상태로 세포막(membrane) 부위에 존재하고 있음을 확인하였다. 낮은 배양온도(16℃) 및 숙주의 교체 등을 통한 발현 조건의 변화에도 같은 발현 양상이 유지되는 것을 확인 하였고, 이는 대장균내에서 발현이 불안정 하게 유지되는 것으로 판단되었다. 따라서 대장균내에서 발현을 안정적으로 유도하고 가용성을 높이기 위해 말토오스 결합단백질(Maltose binding protein)과 같은 융합표지(fusion tag)를 가진 rbgl/pMAL-c2 발현 벡터(expression vector)를 제작하였다. pMAL-c2의 BamHI과 SalI 부위를 제한효소를 이용하여 절단한 뒤, rbgl의 PCR product인 rbg1-42, rbg1-66, rbg1-267, rbg1-391, rbg1-n 절편을 BamHI과 XhoI으로 절단한 후, 이를 연결하여 rbgl/pMAL-c2 발현 벡터(expression vector)를 완성하였다. pMAL-c2 vector를 이용한 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 발현 시 단백질은 N-말단에 말토오스 결합단백질이 부착(tagging)된 형태로 세포질(Cytosol)에 존재하고 있음을 확인하였다(도 5).

베타-클루코시다아제(β-glucosidase)의 세포막 부착(Membrane attachment) 또는 세포막 삽입(Membrane insertion)에 관한 기작은 현재까지 알려진 바 없다. 또한 단백질의 소수성 분석(Hydrophobicity plot)결과 세포막 분포(Membrane localization)를 설명할 수 있는 특별한 소수성 부위(Hydrophobic region)는 나타나지 않았다. 그러나 일반적이지는 않지만 일부 소수의 막단백질(Membrane protein)에서 소수성(Hydrophobicity)이 없는 상황에서도 세포막 분포가 된다고 알려져 있다. Bacterial lipoprotein의 consensus signal sequence는 Leu-Leu-Ala-Gly-Cys-Ser-Asn-Ala로 알려져 있다. 지질단백질(Lipoprotein)의 glyceryl moiety는 시스테인(Cystein) 잔기에 번역 후 결합(posttranslationally attach)하여 지질단백질이 세균의 세포막(bacterial membrane)에 anchoring 할 수 있게 변형시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 추정 베타-글루코시다아제(putative β-glucosidase)를 지질단백질의 signal sequence data base를 이용한 분석 결과 consensus signal sequence를 가지고 있지 않은 것으로 나타났으나, N-말단 부위에 존재하는 Leu-Leu-Met-Pro-Ser-His-Asn-Glu-Met-Cys-Cys-Asn-Trp-Thr의 아미노산 서열이 bacterial consensus signal sequence와 유사함을 확인하였다. 더불어 일반적으로 알려진 대부분의 지질단백질의 신호서열(Signal sequence)의 hydrophobic core와 carboxy terminal의 길이는 14.7 아미노산으로 알려져 있으며, 본 발명의 추정 베타-글루코시다아제(putative β-glucosidase) 또한 유사한 길이를 가지고 있는 것으로 분석 되었다.

앞서 예측한 신호서열의 존재 여부를 확인하기 위하여 신호서열이 제거된 베타- 글루코시다제(β-glucosidase) 발현 벡터를 제작하였다. 제작된 발현벡터(prbgl-42, prbgl-66, prbgl-267)를 대장균에 형질전환하여 발현시킨 결과, 41 amino acid의 signal sequence(서열번호 3: 아미노산 서열)를 제거한 형질전환체 E.coli HIT-21/prRbg1-42, E.coli HIT-21/prbg1-66 발현된 단백질이 세포질에 존재하고 있음을 확인 하였다(도 4). 상세하게는 예측한 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 N-말단 부위 약 40 amino acid의 signal sequence가 단백질의 분포(Localization)를 담당하는 중요한 역할을 하고 있음을 확인 시켜주는 것으로 판단된다.

<실시예 5>

베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성 측정

베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성은 분리한 단백질을 40℃에서 2시간 동안 셀로비오스와 반응시킨 뒤 시그마사(USA)의 glucose assay kit을 이용하여 가수 분해된 글루코오스의 양으로 측정 하였으며, 이외에 p-nitrophenyl β-D-1,4-glucopyranoside(pNPG), β-naphthyl-β-D-glucopyranoside 등을 이용하여 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 특정 파장(400nm)에서의 흡광도를 측정하여 분석 하였다(도 6).

일반적으로 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 자연계에 존재하는 기질에 대한 높은 특이성을 나타낸다. 자연계에 존재하는 셀로덱스트린(Cellodextrin)은 화학적 특성에 따라 β-1,4-linked 수용성 cellodextrin(cellotriose, cellotetraose and cellopentaose)과 beta-linked aryl-glucoside(pNPG, arbutin and prunasin), β-1,6-linked glucoside(gentibiose, amygdalin)로 나뉘어진다. 본 발명의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 활성 측정 결과 셀로비오스에 대한 가수분해 활성 보다는 pNPG에 대한 활성이 더욱 높음을 나타내었다.

또한 상세하게는 5mM pNPG를 이용하여 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 경우 glucose 1.4 mg/㎖/hr을 생산하였고, 1% cellobiose, arbutin, salicin에서도 약 0.5mg/㎖/hr의 글루코오스를 생산하였다(도 7).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 단백질.
제2항에 있어서,
상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 단백질은 서열번호 3의 신호서열(Signal sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 베타- 글루코시다아제(β-glucosidase) 단백질.
서열번호 1의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 유전자를 포함하는 도 8에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 벡터.