JP6361868B2 - β−グルコシダーゼ - Google Patents
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Description
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有する、β−グルコシダーゼである。
[2]前記[1]のβ−グルコシダーゼは、pH5.5環境下よりもpH3.0環境下のほうが高いβ−グルコシダーゼ活性を示すことが好ましい。
[3]本発明の第二の態様は、β−グルコシダーゼ触媒ドメインをコードする領域を有し、前記領域が、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
からなり、前記ポリペプチドがpH5.5環境下よりもpH3.0環境下のほうが高いβ−グルコシダーゼ活性を示す、ポリヌクレオチドである。
[4]本発明の第三の態様は、前記[3]のポリヌクレオチドが組み込まれており、宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクターである。
[5]本発明の第四の態様は、前記[4]の発現ベクターが導入されている形質転換体である。
[6]前記[5]の形質転換体は、真核微生物であることが好ましい。
[7]前記[5]の形質転換体は、糸状菌であることが好ましい。
[8]本発明の第五の態様は、前記[5]〜[7]のいずれかの形質転換体内で、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを生産する、β−グルコシダーゼの製造方法である。
[9]本発明の第六の態様は、前記[1]又は[2]のβ−グルコシダーゼと、少なくとも1種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物である。
[10]本発明の第七の態様は、セルロースを含む材料を、前記[1]又は[2]のβ−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法である。
[11]前記[10]のセルロース分解物の製造方法において、前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも1種のその他のセルラーゼを接触させることが好ましい。
[12]前記[10]のセルロース分解物の製造方法においては、前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼとを接触させることが好ましい。
[13]前記[10]のセルロース分解物の製造方法においては、前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、少なくとも1種のヘミセルラーゼとを接触させることが好ましい。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクター、及び当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係るβ−グルコシダーゼの製造に好適に用いられる。
本発明者らは、アクレモニウム・セルロリティカスから回収したmRNAを鋳型として逆転写反応により合成されたcDNAから、新規なβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子を単離及び同定し、当該遺伝子をBGL遺伝子、当該遺伝子がコードするβ−グルコシダーゼをBGLとした。BGLのアミノ酸配列を配列番号1に、BGLをコードする塩基配列(BGL遺伝子のコード領域の塩基配列)を配列番号2に、それぞれ示す。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、本発明の第一の態様であるβ−グルコシダーゼをコードする。当該β−グルコシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
本発明の第三の態様である発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが組み込まれており、宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼを発現し得る状態で組み込まれた発現ベクターである。
本発明の第四の態様である形質転換体は、前記本発明の第三の態様の発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼを発現させ得る。本発明に係るβ−グルコシダーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、又は高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
本発明の第五の態様であるβ−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明の第四の態様の形質転換体内で、β−グルコシダーゼを生産する方法である。前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組み込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係るβ−グルコシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内にβ−グルコシダーゼを発現させる。
本発明の第六の態様であるセルラーゼ混合物は、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼ、又は前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼと、少なくとも1種のその他のセルラーゼを含む。前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係るβ−グルコシダーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、セルロース等のβ−1,4結合を含むグルカンをより効率よく分解させることができる。
本発明の第七の態様であるセルロース分解物の製造方法は、本発明に係るβ−グルコシダーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
(1) BGLの麹菌発現ベクターの構築
<アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムDNA抽出>
アクレモニウム・セルロリティカスH1株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターより入手可能。受託番号:FERM BP−11508、以下「H1株」と略記する。)を、PDB寒天培地(PDA培地(Difco PDA broth使用)に1.5%(質量/容量)アガロースを添加した平板培地)上に植菌して30℃で1週間培養した。得られた菌体を、直径5mmの寒天ごと切り出してPDA培地に植菌し、30℃、130rpmで浸透培養を行った。培養物を15000rpmで10分間の遠心分離処理することによって回収した菌体を、PDA培地による洗浄を2回繰り返すことによって、菌体サンプルを取得した。
当該菌体サンプルの入った2mL容プラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置(装置名:シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製)を用いて90秒間の破砕処理を3回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、Nucleon(AMersham社製)を使用してDNAを抽出した。
得られたゲノムDNAを鋳型とし、表1に記載の配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号5で表される塩基配列からなるプライマーとDNAポリメラーゼ(製品名:KOD−plus、東洋紡社製)を用いたPCRによって、BGLをコードする配列(配列番号3)を増幅した。PCRは、94℃、2分間を1サイクルした後、96℃、20秒間、次いで60℃、30秒間、さらに72℃、5分間を30サイクルすることにより行った。得られたPCR産物は、QIAquick PXR purification kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。
前記<アクレモニウム・セルロリティカスゲノムDNA抽出>に記載の方法で菌体を調製した。次いで、当該菌体サンプルの入った2mL容プラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置(装置名:シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製)を用いて90秒間の破砕処理を3回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、ISOGEN II(日本GENE社製)を使用してRNAを抽出した。抽出されたRNAから、cDNA合成キット(製品名:SMARTer(商標登録)RACE cDNA Amplification Kit、Clontech社製)を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをシーケンス解析し、得られた配列(配列番号2)とゲノムDNA配列(配列番号3)を比較し、イントロンを決定した。
麹菌アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae) RIB40株(独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手。NBRC番号:100959。以下「RIB40株」と略記する。)のゲノムDNAを鋳型とし、表1に記載の配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号7で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、BGLのcDNAの増幅と同様にしてPCRを行い、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子niaDのcDNAを増幅した。
得られたPCR増幅産物と大腸菌プラスミドpBR322(タカラバイオ社製)を制限酵素AvaI及びNdeIを用いて37℃で消化した後、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的バンドを切り出し、そのゲル片からQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて抽出・精製することによって、pBR322及びniaDのcDNAの制限酵素処理断片を得た。これらのDNA断片をDNA ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結し、大腸菌E.coli JM109株(以下「JM109株」と略記する。)に形質転換した。その結果、プラスミドpBR−niaD(pBR322の制限酵素AvaI及びNdeIの間にniaDのcDNA断片が挿入されたプラスミド)が導入された形質転換体を得た。
RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、表1に記載の配列番号8で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号9で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、BGLのcDNAの増幅と同様にしてPCRを行い、麹菌由来agdA遺伝子のターミネーター領域(以下、「agdAターミネーター」ということがある。)のcDNAを増幅した。
得られたPCR増幅産物とpBR−niaDを制限酵素SalI及びAvaIを用いて37℃で消化した後、前記pBR−niaDの調製と同様にして、得られた消化物からpBR−niaD及びagdAターミネーターのcDNAの制限酵素処理断片を得、これらのDNA断片を連結してJM109株に形質転換した。その結果、プラスミドpBR−agdAT−niaD(pBR322−niaDの制限酵素SalI及びAvaIの間にagdAターミネーターのcDNA断片が挿入されたプラスミド)が導入された形質転換体を得た。
RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、表1に記載の配列番号10で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号11で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、BGLのcDNAの増幅と同様にしてPCRを行い、麹菌由来enoA遺伝子のプロモーター領域(以下、「enoAプロモーター」ということがある。)のcDNAを増幅した。
得られたPCR増幅産物とpBR−agdAT−niaDを制限酵素NheI及びSalIを用いて37℃で消化した後、前記pBR−niaDの調製と同様にして、得られた消化物からpBR−agdAT−niaD及びenoAプロモーターのcDNAの制限酵素処理断片を得、これらのDNA断片を連結してJM109株に形質転換した。その結果、プラスミドpBR−enoAP−agdAT−niaD(pBR−agdAT−niaDの制限酵素NheI及びSalIの間にenoAプロモーターのcDNA断片が挿入されたプラスミド)が導入された形質転換体を得た。
まず、pBR−enoAP−agdAT−niaDを制限酵素SmaIを用いて30℃で消化した後、前記pBR−niaDの調製と同様にして、得られた消化物からpBR−enoAP−agdAT−niaDのSmaI処理断片を得た。
当該SmaI処理断片と前記で精製されたBGLをコードする配列とを、In−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結してプラスミドpBR−enoAP−BGL−agdAT−niaD(BGL麹菌発現用ベクター)を得、当該プラスミドをStellar Competent Cells(Clontech社製)に形質転換し、BGL大腸菌形質転換株を得た。得られた形質転換株を100μg/mLアンピシリン含有LB培地で37℃、180rpmで1晩培養し、培養物からQIAquick Miniprepキット(QIAGEN社製)を用いて、pBR−enoAP−BGL−agdAT−niaDを大量調製した。
定法であるPEG−カルシウム法(Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99〜104(1989年))により、上記プラスミドpBR−enoAP−BGL−agdAT−niaDを用いて、麹菌アスペルギルス・オリゼniaD300株(独立行政法人酒類総合研究所より入手。)を形質転換した。ツアペクドックス(Czapek−Dox)培地(3%(質量/容量)デキストリン、0.1%(質量/容量)リン酸2水素カリウム、0.2%(質量/容量)塩化カリウム、0.05%(質量/容量)硫酸マグネシウム、0.001%(質量/容量)硫酸鉄、0.3%(質量/容量)硝酸ナトリウム)で生育できる株を選択することにより、形質転換体(BGL麹菌形質転換株)を得た。
作製したBGL麹菌形質転換株を、ツアペクドックス培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。500mL容三角フラスコに入った100mLのPD液体培地(2%(質量/容量)デキストリン、1%(質量/容量)ポリペプトン、0.1%(質量/容量)カザミノ酸、0.5%(質量/容量)リン酸2水素カリウム、0.05%(質量/容量)硫酸マグネシウム、0.1%(質量/容量)硝酸ナトリウム)に最終胞子濃度1×104/mLとなるように植菌した。30℃で3日間の液体培養を行い、目的遺伝子産物(BGL)を培地中に分泌発現させた。培養後の当該培養液を酵素サンプルとした。
図1に、酵素サンプル(BGL)のSDS−PAGE解析結果を示す。レーン左がタンパク質分子量指標であり、レーン右が酵素サンプルである。この結果、酵素サンプルには、分子量約120kDaのBGLが含まれていることが確認できた。
酵素活性はUnit(U)にて示す。1Uは、1分間に基質から生成物を1μmol生産する酵素量であり、以下の式で定義される。
1U(μmol/min)=[生成糖(μmol/L)]×[反応液量(L)]/[反応時間(min)]
また、タンパク質1mg当たりの比活性は、下記式により算出される。
[比活性(U/mg)]=[Unit(U)]/[タンパク質量(mg)]
標準基質として、CMC(Sigma−Aldrich社製)を使用した。また、検量線は、10mM(mmol/L)グルコース溶液を200mM酢酸バッファー(pH5.5)で適宜希釈して調製した5点の希釈系列(0.5〜7.5mM)の測定値から作成した。
具体的には、まず、1.5mL容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに190μLの200mM酢酸バッファー(pH5.5)と200μLの1%(質量/容量)CMC溶液(溶媒:200mM酢酸バッファー(pH5.5))を加えて充分に混合した液を30℃に調整した。次いで、各チューブに対して、10μLの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から15分経過後に、400μLのDNSA(ジニトロサリチル酸)溶液を加えて混合して反応を停止させた後、100℃で5分間煮沸し、氷中で冷却させた。その後、各チューブから100μLの反応溶液を分取し、100μLの蒸留水で希釈した溶液の540nmの吸光度(A540)を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて20mM酢酸バッファー(pH5.5)を添加して同様に処理したサンプルを用いた。A540の測定値と検量線からグルコース濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
[比活性(U/mg)]=([グルコース濃度(mmol/L)]×15×0.400/0.010)/(15×[タンパク質量(mg)])
標準基質として、可溶性キシランを使用した。1gのカバノキ由来のキシラン(SIGMA社製)を100mLの水に混合した混合液を100℃で2時間加熱した後、固形分を除去して液体分のみを回収し、これを乾固させたものを、可溶性キシランとして使用した。また、検量線は、10mMキシロース溶液を200mM酢酸バッファー(pH5.5)で適宜希釈して調製した5点の希釈系列(0.5〜3.0mM)の測定値から作成した。
具体的には、まず、1.5mL容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに180μLの200mM酢酸バッファー(pH5.5)と200μLの1%(質量/容量)可溶性キシラン溶液(溶媒:200mM酢酸バッファー(pH5.5))を加えて充分に混合した液を30℃に調整した。次いで、各チューブに対して、20μLの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から15分経過後に、400μLのDNSA溶液を加えて混合して反応を停止させた後、100℃で5分間煮沸し、氷中で冷却させた。その後、各チューブから100μLの反応溶液を分取し、100μLの蒸留水で希釈した溶液の540nmの吸光度(A540)を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて20mM酢酸バッファー(pH5.5)を添加して同様に処理したサンプルを用いた。A540の測定値と検量線からキシロース濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
[比活性(U/mg)]=([キシロース濃度(mmol/L)]×15×0.400/0.020)/(15×[タンパク質量(mg)])
標準基質として、PNPG(Sigma−Aldrich社製)を使用した。PNPG分解活性は、主にβ−グルコシダーゼ活性の指標となる。また、検量線は、1000μmol/L PNP(p−ニトロフェノール)溶液を200mM酢酸バッファー(pH5.5)で適宜希釈して調製した5点の希釈系列(0〜200μM)の測定値から作成した。
具体的には、まず、1.5mL容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに615μLの200mM酢酸バッファー(pH5.5)と50μLのPNPG溶液(3.4mM、溶媒:超純水)を加えて充分に混合した液を30℃に調整した。次いで、各チューブに対して、10μLの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から15分経過後に、625μLの0.2M炭酸ナトリウム水溶液を加えて混合して反応を停止させた。その後、各チューブから200μLの反応溶液を分取し、420nmの吸光度(A420)を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて20mM酢酸バッファー(pH5.5)を添加して同様に処理したサンプルを用いた。A420の測定値と検量線からPNP濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
[比活性(U/mg)]=([PNP濃度(μmol/L)]×0.001×0.675/0.01)/(15×[タンパク質量(mg)])
測定に使用する酵素調製物は、前記(3)で調製した酵素サンプル(BGL)と、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、キシラナーゼ(Thermoascus aurantiacus由来endo−1,4−beta−xylanase A、GenBankのアクセッション番号:AAF24127)及びβ−キシロシダーゼ(Thermotoga maritima由来β−xylosidase、耐熱性酵素研究所製)とを含有させて調製した。
まず、リグノセルロース系バイオマスであるコーンストーバーを微粉砕したものに、25%(質量/質量)のアンモニア水を、質量比が1:2.5となるように混合して、コーンストーバー及びアンモニアを含む基質混合物を得た。次に、前記基質混合物を、80℃の温度で8時間保持して糖化前処理を行った後、アンモニアを分離し、pH4.5に調整した。次いで、コーンストーバーの含有量が20体積%となるように調整して、本実施例に用いる糖化前処理物を得た。この糖化前処理物に、BGLを含む酵素調製物を、コーンストーバー当たりの酵素終濃度が4.5mg/g(コーンストーバー)となるように添加し、50℃で3日間反応を行った。反応中は、160rpm浸透撹拌を加えた。また、比較例として、市販のアクレモニウム属菌由来の糖化酵素混合物(商品名:アクレモニウムセルラーゼ、Meiji Seikaファルマ社製)を用いて同様に反応を行った。
セパレーター:Waters 2695(Waters社製)、
RI検出器:Waters 2414(Waters社製)、
カラム:Bio−rad HPX−87P(Bio−Rad社製)。
糖濃度測定条件;
溶離液:超純水、
流速:0.6mL/min、
カラム温度:85℃、
検出器温度:40℃。
この結果、糖化物の糖濃度(グルコースとキシロースの合計濃度)は、市販の糖化酵素混合物を用いた場合には約2.92質量%であったのに対して、BGLを含む酵素調製物を用いた場合には約3.53質量%であり、1.2倍以上の糖が産生された。この結果から、BGLを他の糖化酵素と併用することによって、従来のアクレモニウム由来の糖化酵素混合物よりも糖化力の高い酵素混合物が得られることが明らかである。
<セロビオース分解活性の測定>
前記(3)で調製した酵素サンプルを用いて、セロビオース分解活性とキシロビオース分解活性を調べた。
具体的には、まず、2本の1.5mL容プラスチックチューブに、それぞれ、200μLの0.03M セロビオース水溶液と190μLの200mM 酢酸バッファー(pH5.5)を加えて充分に混合した後、30℃で5分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後の2本のチューブのうちの1本には、10μLの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させた。反応開始から90分経過後に、当該チューブ内の溶液を95℃、5分間加熱処理して酵素反応を停止させた(酵素反応時間:90分間)。残りの1本には、10μLの酵素サンプルを添加した直後にチューブ内の溶液を95℃、5分間加熱処理して酵素反応を停止させた(酵素反応時間:0分間)。
また、2本の1.5mL容プラスチックチューブに、200μLの0.014M キシロビオース水溶液と190μLの200mM 酢酸バッファー(pH5.5)を加えて充分に混合した後、30℃で5分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後の2本のチューブのうちの1本には、10μLの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させた。反応開始から90分経過後に、当該チューブ内の溶液を95℃、5分間加熱処理して酵素反応を停止させた(酵素反応時間:90分間)。残りの1本には、10μLの酵素サンプルを添加した直後にチューブ内の溶液を95℃、5分間加熱処理して酵素反応を停止させた(酵素反応時間:0分間)。
[比活性(U/mg)]=([グルコース濃度(μmol/L)]×0.4/0.01)/(90×[タンパク質量(mg)])
図3に示すように、セロビオースを基質とした場合には、酵素反応時間が0分間の糖化物(図中、「反応前」)と酵素反応時間が90分間の糖化物(図中、「反応後」)を比較すると、反応前の糖化物に比べて反応後の糖化物では、溶離時間11分付近にみられたセロビオースのピークが小さく、溶離時間13.3分付近にみられたグルコースのピークは大きくなっており、BGLによりセロビオースがグルコースへ分解されることが確認された。BGLのセロビオース分解活性の比活性は、0.21U/mgであった。
一方で、図4に示すように、キシロビオースを基質とした場合には、酵素反応時間が90分間の糖化物(図中、「反応後」)でも、酵素反応時間が0分間の糖化物(図中、「反応前」)と同様に溶離時間12.3分付近のキシロビオースのピークしか観察されず、BGLによるキシロビオースの分解は確認されなかった。
前記(3)で調製した酵素サンプルを用いて、BGLのPNPG分解活性の温度依存性を調べた。
具体的には、反応温度を30、45、60、75、又は90℃とした以外は、前記(4)の<PNPG分解活性の測定>と同様にして酵素反応を行った後、各チューブから200μLの反応溶液を分取し、420nmの吸光度(A420)を測定し、予め求めた検量線から酵素反応後の応溶液のPNP濃度を算出した。
前記(3)で調製した酵素サンプルを用いて、BGLのPNPG分解活性のpH依存性を調べた。
具体的には、PNPG溶液溶液に混合するバッファーとして、200mM HCl−KClバッファー(pH1.5)、クエン酸−リン酸バッファー(pH3.0)、200mM 酢酸バッファー(pH5.5)、又は200mM リン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)を用いた以外は、前記(4)の<PNPG分解活性の測定>と同様にして酵素反応を行った後、各チューブから200μLの反応溶液を分取し、420nmの吸光度(A420)を測定し、予め求めた検量線から酵素反応後の応溶液のPNP濃度を算出した。
Claims (13)
- (A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有する、β−グルコシダーゼ。 - pH5.5環境下よりもpH3.0環境下のほうが高いβ−グルコシダーゼ活性を示す、請求項1に記載のβ−グルコシダーゼ。
- β−グルコシダーゼ触媒ドメインをコードする領域を有し、前記領域が、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
からなり、前記ポリペプチドがpH5.5環境下よりもpH3.0環境下のほうが高いβ−グルコシダーゼ活性を示す、ポリヌクレオチド。 - 請求項3に記載のポリヌクレオチドが組み込まれており、
宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。 - 請求項4に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
- 真核微生物である、請求項5に記載の形質転換体。
- 糸状菌である、請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項5〜7のいずれか一項に記載の形質転換体内で、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを生産することを含む、β−グルコシダーゼの製造方法。
- 請求項1又は2に記載のβ−グルコシダーゼと、少なくとも1種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
- セルロースを含む材料を、請求項1又は2に記載のβ−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
- 前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも1種のその他のセルラーゼを接触させることを含む、請求項10に記載のセルロース分解物の製造方法。
- 前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼとを接触させることを含む、請求項10に記載のセルロース分解物の製造方法。
- 前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、少なくとも1種のヘミセルラーゼとを接触させることを含む、請求項10に記載のセルロース分解物の製造方法。
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