JP2015136324A - 糖化酵素組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】リグノセルロース系バイオマスに対する糖化効率の高い糖化酵素組成物、及び当該組成物を使用したリグノセルロース系バイオマスの糖化方法の提供。
【解決手段】 リグノセルロース系バイオマスを基質とし、β−グルコシダーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、キシナラーゼ又はキシロシダーゼと、アラビノフラノシダーゼとを含有し、前記β−グルコシダーゼが、アクレモニウム・セルロリティカス由来の新規β−グルコシターゼ酵素４種のうちのいずれかであることを特徴とする、糖化酵素組成物；さらに、セルロース結合ドメインを非含有であるエンドグルカナーゼを含有する、前記記載の糖化酵素組成物；リグノセルロース系バイオマスを、前記記載の糖化酵素組成物を用いて糖化処理することを特徴とする、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、リグノセルロース系バイオマスを糖化処理のための糖化酵素組成物に関する。より詳細には、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の新規β−グルコシターゼ酵素を含む、リグノセルロース系バイオマスに対する糖化効率の高い糖化酵素組成物に関する。

地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）など輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素は、セルロース、ヘミセルロース等の多糖類とリグニンである。例えば、多糖類は、セルラーゼ酵素と総称されるグルコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品原料として利用される。

複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、グルコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。リグノセルロースの加水分解には、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）や、他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。つまり、セルロース系バイオマスの酵素糖化処理を効率よく行うためには、これらの複数の糖化酵素を含む酵素組成物が必要である。

一方で、アクレモニウム・セルロリティカスは、糖化力の強いセルラーゼを生産する糸状菌であり、現在までに、２種類のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、３種のβ−グルコシターゼ遺伝子、及び７種のエンドグルカナーゼ遺伝子が単離されている（例えば、特許文献１参照。）。エンドグルカナーゼは、セルロース、ヘミセルロース等のリグノセルロースをランダムに切断して分解し、単糖を生成するプロセスに関わるグルコシド加水分解酵素の一つである。

アクレモニウム・セルロリティカスからはα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子も単離されている（例えば、特許文献２参照。）。α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、アラビナン等の多糖に含まれるα−１，５、１，３又は１，２−Ｌ−アラビノシド結合に作用し、Ｌ−アラビノフラノースを遊離させる反応を触媒する。アラビノフラノシダーゼは、その他のヘミセルラーゼとブレンドされた酵素組成物として、バイオマスの加水分解に用いられている（例えば、特許文献３参照。）。

特開２０１０−１４８４２７号公報 特許第４６８３５３１号公報 特表２０１１−５１５０８９号公報

複数の糖化酵素を含む従来の酵素組成物を用いたアルカリ処理バイオマス糖化反応では、反応終了後の糖化液中に単糖化されずにオリゴ糖が残存してしまい、糖化効率が充分ではない。糖化効率を向上させるためには、バイオマス中のヘミセルロース構造の加水分解に適した糖化酵素を組み合わせる必要がある。糖化液中に残存するオリゴ糖はヘミセルロース分解物ではないかと予想されるものの、その構成糖は明確ではなかった。さらに、ヘミセルロースの組成と構造は、セルロース等の他の多糖類よりも複雑であり、また、草本類バイオマスの種類ごとにその含有量や組成が様々に異なるという問題がある。

本発明は、リグノセルロース系バイオマスに対する糖化効率の高い糖化酵素組成物、及び当該組成物を使用したリグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供することを目的とする。

一般的に、コーンストーバーや稲藁等の草本系バイオマスには、キシラン主鎖に４−Ｏ−メチルグルクロン酸やアラビノースが側鎖として結合しているヘミセルロース構造が存在していることが知られており、このヘミセルロース構造を単糖化するための酵素の一つとして、アラビノフラノシダーゼが有効であることが知られている。しかしながら、アラビノフラノシダーゼは一般的にＧＨ３、ＧＨ４３、ＧＨ５１、ＧＨ５４、及びＧＨ６２に分類されており、いずれのアラビノフラノシダーゼが上記バイオマスのヘミセルロース構造の単糖化に有効かについては不明であった。

本発明者らは、活性の高い新規なセルラーゼ酵素を開発すべく鋭意研究した結果、アクレモニウム・セルロリティカスから新規なセルラーゼ遺伝子を４種単離し同定した。さらに、これらのβ−グルコシターゼ酵素と、アラビノフラノシダーゼを含む他の糖化酵素を組み合わせて用いることにより、リグノセルロース系バイオマスを従来になく効率よく単糖にまで糖化し得ることを見出し、本発明を完成させた。

［１］本発明の第一の態様は、リグノセルロース系バイオマスを基質とし、
β−グルコシダーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、キシナラーゼ又はキシロシダーゼと、アラビノフラノシダーゼとを含有し、
前記β−グルコシダーゼが、
（１Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（１Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（２Ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２Ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（２Ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（３Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３Ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（３Ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（４Ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（４Ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有することを特徴とする、糖化酵素組成物である。
［２］ 前記［１］の糖化酵素組成物においては、前記セロビオハイドラーゼが配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記アラビノフラノシダーゼがＧＨ５１又はＧＨ５４であることが好ましい。
［３］ 前記［１］又は［２］の糖化酵素組成物においては、前記βーグルコシダーゼと前記セロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）が、０．０２〜２．５：１の範囲内であることが好ましい。
［４］ 前記［１］〜［３］のいずれかの糖化酵素組成物においては、さらに、セルロース結合ドメインを非含有であるエンドグルカナーゼを含有することが好ましい。
［５］ 前記［４］の糖化酵素組成物においては、前記エンドグルカナーゼが配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
［６］ 前記［４］又は［５］の糖化酵素組成物においては、組成物全体に対する、前記β−グルコシダーゼ、前記エンドグルカナーゼ、及び前記セロビオハイドラーゼの合計含有量が、３０〜８０質量％であることが好ましい。
［７］ 前記［４］〜［６］のいずれかの糖化酵素組成物においては、前記β−グルコシダーゼ、前記エンドグルカナーゼ、及び前記セロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）が０．０２〜２．５：０．０２〜２．５：１の範囲内であることが好ましい。
［８］ 前記［１］〜［７］のいずれかの糖化酵素組成物においては、前記リグノセルロース系バイオマスが、稲わら、又はコーンストーバーであることが好ましい。
［９］ 本発明の第二の態様に係る基質・糖化酵素混合物は、前記［１］〜［８］のいずれかの糖化酵素組成物、及びリグノセルロース系バイオマスを含有することを特徴とする。
［１０］ 本発明の第三の態様に係るリグノセルロース系バイオマスの糖化方法は、リグノセルロース系バイオマスを、前記［１］〜［８］のいずれかの糖化酵素組成物を用いて糖化処理することを特徴とする。

本発明に係る糖化酵素組成物は、アクレモニウム・セルロリティカス由来の新規β−グルコシターゼ酵素を含有するため、非常に効率よくリグノセルロース系バイオマスを糖化処理することできる。特に当該糖化酵素組成物は、アラビノフラノシダーゼを含むため、糖化処理し難いリグノセルロース系バイオマスの糖化処理に対して用いた場合でも、従来よりも糖化処理後に残存する二糖類以上の多糖類の量をより少量にすることができる。

実施例１において、酵素サンプル（ＢＧＬ２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。 実施例１において、酵素サンプル（ＢＧＬ３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。 実施例１において、酵素サンプル（ＢＧＬ５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。 実施例１において、酵素サンプル（ＢＧＬ６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。 実施例１において、比較酵素調製物１を用いて得られた糖化処理物のＨＰＬＣにおける、溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示した図である。 実施例１において、比較酵素調製物１を用いて得られた糖化処理物の溶離時間７〜１０．５分の各画分のグルコース、キシロース、及びアラビノースの濃度（質量／容量％）の測定結果を示した図である。 実施例１において、比較酵素調製物１により得られた糖化物、酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）により得られた糖化物、及び酵素調製物（Ａｏａｂｆ２）により得られた糖化物における、ＨＰＬＣの溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示した図である。 実施例１において、コーンストーバーを基質とした場合における、酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）の含有量が異なる各酵素調製物の相対糖化効率を示した図である。 実施例１において、ＢＧＬ２を含有した酵素調製物（Ａｂｆなし、Ａｋａｂｆあり、Ａｏａｂｆあり）を用いた場合の溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示した図である。 実施例１において、ＢＧＬ３を含有した酵素調製物（Ａｂｆなし、Ａｋａｂｆあり、Ａｏａｂｆあり）を用いた場合の溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示した図である。 実施例１において、ＢＧＬ４を含有した酵素調製物（Ａｂｆなし、Ａｋａｂｆあり、Ａｏａｂｆあり）を用いた場合の溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示した図である。 実施例１において、ＢＧＬ６を含有した酵素調製物（Ａｂｆなし、Ａｋａｂｆあり、Ａｏａｂｆあり）を用いた場合の溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示した図である。

［β−グルコシターゼ］
本発明において用いられるβ−グルコシターゼは、アクレモニウム・セルロリティカス由来の新規な酵素である。本発明者らは、アクレモニウム・セルロリティカスから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから、新規なβ−グルコシターゼをコードする遺伝子を４種単離・同定した。以降において、この４種のβ−グルコシターゼ遺伝子を、それぞれ、ＢＧＬ２遺伝子、ＢＧＬ３遺伝子、ＢＧＬ５遺伝子、及びＢＧＬ６遺伝子という。

ＢＧＬ２遺伝子がコードするβ−グルコシターゼ（ＢＧＬ２）のアミノ酸配列を配列番号１に、ＢＧＬ２をコードする塩基配列（ＢＧＬ２遺伝子のコード領域の塩基配列）を配列番号２に、それぞれ示す。
ＢＧＬ３遺伝子がコードするβ−グルコシターゼ（ＢＧＬ３）のアミノ酸配列を配列番号４に、ＢＧＬ３をコードする塩基配列（ＢＧＬ３遺伝子のコード領域の塩基配列）を配列番号５に、それぞれ示す。
ＢＧＬ５遺伝子がコードするβ−グルコシターゼ（ＢＧＬ５）のアミノ酸配列を配列番号７に、ＢＧＬ５をコードする塩基配列（ＢＧＬ５遺伝子のコード領域の塩基配列）を配列番号８に、それぞれ示す。
ＢＧＬ６遺伝子がコードするβ−グルコシターゼ（ＢＧＬ６）のアミノ酸配列を配列番号１０に、ＢＧＬ５をコードする塩基配列（ＢＧＬ６遺伝子のコード領域の塩基配列）を配列番号１１に、それぞれ示す。

一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、各々のＢＧＬにおいても、β−グルコシターゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。

そこで、本発明において用いられるβ−グルコシターゼとしては、下記の（１Ａ）〜（１Ｃ）、（２Ａ）〜（２Ｃ）、（３Ａ）〜（３Ｃ）、（４Ａ）〜（４Ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有する、β−グルコシダーゼである。
（１Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢＧＬ２）、
（１Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（１Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（２Ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢＧＬ３）、
（２Ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（２Ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（３Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢＧＬ５）、
（３Ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（３Ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
（４Ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢＧＬ６）、
（４Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（４Ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。

前記（１Ｂ）、（２Ｂ）、（３Ｂ）、又は（４Ｂ）のポリペプチドにおいて、それぞれ配列番号１、４、７、又は１０で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。各アミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の位置は、欠失等されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、β−グルコシターゼ活性を有する限り、特に限定されるものではない。

前記（１Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９２％以上であれば特に限定されないが、９５％以上であることが好ましく、９８％以上であることがより好ましい。

前記（２Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。

前記（３Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号７で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９２％以上であれば特に限定されないが、９５％以上であることが好ましく、９８％以上であることがより好ましい。

前記（４Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１０で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９１％以上であれば特に限定されないが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。

なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ１１．０のＭａｘｉｍｕｍ ｍａｔｃｈｉｎｇ機能により得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

前記（１Ｂ）及び（１Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＢＧＬ２のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
前記（２Ｂ）及び（２Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＢＧＬ３のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
前記（３Ｂ）及び（３Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＢＧＬ５のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
前記（４Ｂ）及び（４Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＢＧＬ６のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、前記（１Ａ）〜（４Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインのみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のβ−グルコシダーゼが有する、β−グルコシダーゼ触媒ドメイン以外の領域が挙げられる。例えば、本発明において用いられるβ−グルコシダーゼには、公知のβ−グルコシダーゼに対し、β−グルコシダーゼ触媒ドメインを前記（１Ａ）〜（４Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、例えば、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。Ｎ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを付加することにより、形質転換体中で発現させたβ−グルコシダーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。

小胞体保留シグナルペプチドは、ポリペプチドを小胞体に保留させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知の小胞体保留シグナルペプチドを適宜用いることができる。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。

また、本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。

さらに、本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、前記（１Ａ）〜（４Ｃ）のポリペプチドに由来するβ−グルコシダーゼ活性を損なわない限り、その他の機能ドメインを有していてもよい。当該他の機能ドメインとしては、例えば、セルロース結合モジュールが挙げられる。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものが挙げられる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ触媒ドメイン以外の機能ドメインを有する場合、当該他の機能ドメインは、β−グルコシダーゼ触媒ドメインの上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、当該他の機能ドメインとβ−グルコシダーゼ触媒ドメインは、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、β−グルコシド結合を含むグルカンを基質とする。当該β−グルコシダーゼの基質としては、例えば、結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セロビオース等のβ−１，４結合から成るグルカン、β−１，３結合とβ−１，４結合から成るグルカン、ゲンチオビオース等のβ−１，６結合から成るグルカン等が挙げられる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、２０〜６０℃の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示す。当該β−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ活性を、２５〜５５℃の範囲内において示すものが好ましく、β−グルコシダーゼ活性の至適温度が２５〜５５℃の範囲内にあるものがよりさらに好ましい。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ４〜６の範囲内にある。当該β−グルコシダーゼとしては、少なくともｐＨ４．５〜５．５の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものが好ましい。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、セロビオハイドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性等が挙げられる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼは、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、タンパク質発現系によって生産してもよい。タンパク質発現系におけるβ−グルコシダーゼの生産は、各β−グルコシダーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて、常法により行うことができる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼとして、タンパク質発現系により合成されたものを用いる場合、当該タンパク質発現系としては、大腸菌等の原核細胞の発現系であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞の発現系であってもよく、無細胞発現系であってもよい。本発明において用いられるβ−グルコシダーゼとしては、糸状菌や酵母等の真核微生物発現系により生産したものが好ましい。ＢＧＬ２等は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスが元々有する酵素であるため、麹菌をはじめとする糸状菌等の真核微生物の発現系で発現させることによって、より天然型のβ−グルコシダーゼに近いβ−グルコシダーゼを合成することができる。

その他、前記（１Ｂ）及び（１Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
前記（２Ｂ）及び（２Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
前記（３Ｂ）及び（３Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
前記（４Ｂ）及び（４Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼを、当該β−グルコシダーゼをコードする発現ベクターを導入した形質転換体内で生産した場合、形質転換体からβ−グルコシダーゼを抽出・精製する方法は、β−グルコシダーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、β−グルコシダーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中のβ−グルコシダーゼは、塩析法、限外濾過法、クロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。

本発明において用いられるβ−グルコシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便にβ−グルコシダーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明において用いられるβ−グルコシダーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中のβ−グルコシダーゼを簡便に精製することができる。

［エンドグルカナーゼ］
本発明において用いられるエンドグルカナーゼは、セルロース結合ドメインを有しておらず、かつエンドグルカナーゼ触媒ドメインを有するポリペプチドである。本発明においては、セルロース結合ドメインを有していない公知のエンドグルカナーゼの中から適宜選択して用いることができる。また、セルロース結合ドメインを有している公知のエンドグルカナーゼのうち、エンドグルカナーゼ触媒ドメインをセルロース結合ドメインと切り離した部分タンパク質も、本発明においてエンドグルカナーゼとして用いることができる。本発明において用いられるエンドグルカナーゼとしては、具体的には、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。

本発明において用いられるエンドグルカナーゼとしては、エンドグルカナーゼ活性を、２０〜６０℃の範囲内において示すものが好ましく、２５〜５５℃の範囲内において示すものがより好ましく、エンドグルカナーゼ活性の至適温度が２５〜５５℃の範囲内にあるものがさらに好ましい。また、本発明において用いられるエンドグルカナーゼとしては、エンドグルカナーゼ活性をｐＨ４〜６の範囲内において示すものがより好ましく、少なくともｐＨ４．５〜５．５の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものがより好ましい。当該エンドグルカナーゼが酵素活性を示す温度範囲やｐＨ範囲が、前記β−グルコシダーゼとエンドグルカナーゼとで共通する場合には、本発明に係る酵素組成物を、この共通する温度条件・ｐＨ条件で基質と反応させることにより、一段階の反応で糖化処理を効率よく行うことができる。

本発明において用いられるエンドグルカナーゼとしては、耐熱性エンドグルカナーゼであってもよい。この場合には、本発明に係る酵素組成物を、まず、前記β−グルコシダーゼが酵素活性を示す温度条件で基質と反応させた後、耐熱性エンドグルカナーゼが酵素活性を示す高温条件で反応させる、いわゆる二段階の反応で糖化処理を効率行うことができる。

［セロビオハイドラーゼ］
本発明において用いられるセロビオハイドラーゼは、セルロース結合ドメインを有しており、かつセロビオハイドラーゼ触媒ドメインを有するポリペプチドである。本発明においては、セルロース結合ドメインを有している公知のセロビオハイドラーゼの中から適宜選択して用いることができる。また、セルロース結合ドメインを有しているない公知のセロビオハイドラーゼに、セルロース結合ドメインを付加した融合タンパク質も、本発明においてセロビオハイドラーゼとして用いることができる。本発明において用いられるセロビオハイドラーゼとしては、具体的には、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。

本発明において用いられるセロビオハイドラーゼにおいて、セルロース結合ドメインは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合ドメインとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明において用いられるセロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合ドメインが存在しているものが好ましく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合ドメインが存在しているものがより好ましい。

本発明において用いられるセロビオハイドロラーゼが含むセルロース結合ドメインは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合ドメインとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合ドメイン又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。

本発明において用いられるセロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ活性を、２０〜６０℃の範囲内において示すものが好ましく、２５〜５５℃の範囲内において示すものがより好ましく、セロビオハイドロラーゼ活性の至適温度が２５〜５５℃の範囲内にあるものがさらに好ましい。また、本発明において用いられるロビオハイドロラーゼとしては、ロビオハイドロラーゼ活性をｐＨ４〜６の範囲内において示すものがより好ましく、少なくともｐＨ４．５〜５．５の範囲内においてロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましい。本発明において用いられるセロビオハイドロラーゼとしては、耐熱性セロビオハイドロラーゼであってもよい。

［キシナラーゼ又はキシロシダーゼ］
本発明に係る糖化酵素組成物は、前記エンドグルカナーゼ等に加えて、キシナラーゼ又はキシロシダーゼを含む。本発明に係る糖化酵素組成物は、キシナラーゼのみを含むものであってもよく、キシロシダーゼのみを含むものであってもよく、キシナラーゼとキシロシダーゼの両方を含むものであってもよい。本発明において用いられるキシナラーゼとしては、キシナラーゼ活性を有する公知の酵素の中から適宜選択して用いることができる。同様に、本発明において用いられるキシロシダーゼとしては、キシロシダーゼ活性を有する公知の酵素の中から適宜選択して用いることができる。

［アラビノフラノシダーゼ］
本発明に係る糖化酵素組成物は、前記エンドグルカナーゼ等に加えて、アラビノフラノシダーゼを含む。本発明において用いられるアラビノフラノシダーゼとしては、アラビノフラノシダーゼ活性を有する公知の酵素の中から適宜選択して用いることができる。本発明において用いられるアラビノフラノシダーゼとしては、糸状菌等の真核微生物での発現が良好であることから、ＧＨ５１（配列番号１６）（１〜１７番目まではＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測シグナル配列である。）又はＧＨ５４（配列番号１４）がより好ましい。

［糖化酵素組成物］
本発明に係る糖化酵素組成物は、リグノセルロース系バイオマスを基質とする糖化酵素組成物であって、特定のβ−グルコシダーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、キシナラーゼ又はキシロシダーゼと、アラビノフラノシダーゼとを含有することを特徴とする。前記特定のβ−グルコシダーゼとアラビノフラノシダーゼとを含有するため、非常に効率よくリグノセルロース系バイオマスを単糖にまで糖化処理することできる。

本発明に係る糖化酵素組成物は、さらに、セルロース結合ドメインを非含有であるエンドグルカナーゼを含有することも好ましい。前記酵素群に加えてエンドグルカナーゼも含有することにより、より効率よくリグノセルロース系バイオマスを単糖にまで糖化処理することできる。

本発明に係る糖化酵素組成物が前記エンドグルカナーゼをも含有する場合、本発明に係る糖化酵素組成物全体に対する、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドラーゼの合計含有量は、３０〜８０質量％であることが好ましく、３５〜７５質量％がより好ましく、３８〜６５質量％がさらに好ましい。β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドラーゼを充分量含有することにより、リグノセルロース系バイオマスを基質とした場合の糖化効率がより高められる。

当該酵素組成物における、β−グルコシダーゼとセロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）は、０．０２〜２．５：１の範囲内であることが好ましい。本発明に係る糖化酵素組成物が前記エンドグルカナーゼをも含有する場合、当該酵素組成物におけるβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）は、０．０２〜２．５：０．０２〜２．５：１の範囲内であることが好ましい。これら３種ないしは２種類の酵素をバランスよく含有することにより、リグノセルロース系バイオマスを基質とした場合の糖化効率がより高められる。

なお、本発明に係る糖化酵素組成物は、β−グルコシダーゼ等による酵素活性を阻害しない範囲において、その他の酵素を含有していてもよい。

［糖化方法］
本発明に係る糖化酵素組成物は、他の糖化酵素や糖化酵素組成物と同様に、セルロースを含む材料に対する糖化処理に用いることができる。セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、古紙等が挙げられる。本発明に係る糖化酵素組成物は、特に、リグノセルロース系バイオマスの糖化処理に用いることがより好ましく、稲わら、又はコーンストーバーの糖化処理に用いることがさらに好ましい。

当該セルロースを含む材料は、本発明に係る糖化酵素組成物と接触させる前に、破砕・細断等の物理的処理、酸・アルカリ等の化学処理、適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。

［リグノセルロース系バイオマスの糖化方法］
本発明に係る糖化酵素組成物により、リグノセルロース系バイオマスを糖化処理する場合には、まず、前記糖化酵素組成物とリグノセルロース系バイオマスを混合して、両者を含有する基質・糖化酵素混合物を調製する。次いで、この基質・糖化酵素混合物を、当該糖化酵素組成物中の酵素が活性を示す温度及びｐＨでインキュベートすることにより、糖化反応が進行する。この基質・糖化酵素混合物には、必要に応じてバッファー等の溶媒も添加してもよい。

使用した糖化酵素組成物中の全酵素の酵素活性を示す温度やｐＨが共通する場合には、一段階で糖化反応を行うことができる。例えば、２０〜６０℃、ｐＨ４〜６で反応を行うことが好ましく、２５〜５５℃、ｐＨ４〜６で反応を行うことがより好ましい。反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１４４時間の反応時間で行うことができる。活性を示す温度範囲が個々の酵素で異なる場合には、低温から順次段階的に反応を行っていけばよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
（１） ＢＧＬの麹菌発現ベクターの構築
＜アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡ抽出＞
アクレモニウム・セルロリティカスＨ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターより入手可能。受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０８、以下「Ｈ１株」と略記する。）を、ＰＤＢ寒天培地（ＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ ＰＤＡ ｂｒｏｔｈ使用）に１．５％（質量／容量）アガロースを添加した平板培地）上に植菌して３０℃で１週間培養した。得られた菌体を、寒天ごと直径５ｍｍを切り出してＰＤＡ培地に植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで浸透培養を行った。培養物を１５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離処理することによって回収した菌体を、ＰＤＡ培地による洗浄を２回繰り返すことによって、菌体サンプルを取得した。
当該菌体サンプルの入った２ｍＬ容プラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置（装置名：シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製）を用いて９０秒間の破砕処理を３回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、Ｎｕｃｌｅｏｎ（ＡＭｅｒｓｈａｍ社製）を使用してＤＮＡを抽出した。

＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ２のゲノムＤＮＡ＞
得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（製品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡社製）を用いたＰＣＲによって、ＢＧＬ２をコードする配列（配列番号３）を増幅した。ＰＣＲは、９４℃、２分間を１サイクルした後、９６℃、２０秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに７２℃、５分間を３０サイクルすることにより行った。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＸＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。

＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ２のｃＤＮＡ配列の決定＞
前記＜アクレモニウム・セルロリティカスゲノムＤＮＡ抽出＞に記載の方法で菌体を調製した。次いで、当該菌体サンプルの入った２ｍＬ容プラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置（装置名：シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製）を用いて９０秒間の破砕処理を３回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、ＩＳＯＧＥＮ II（日本ＧＥＮＥ社製）を使用してＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（製品名：ＳＭＡＲＴｅｒ（商標登録）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをシーケンス解析し、得られた配列（配列番号２）とゲノムＤＮＡ配列（配列番号３）を比較し、イントロンを決定した。

＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ３のｃＤＮＡ配列の決定＞
表１に記載の配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬ２と同様にして、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＢＧＬ３をコードする配列（配列番号６）を増幅し、遺伝子導入した宿主株が発現したＲＮＡから得られたｃＤＮＡをシーケンス解析し、得られた配列（配列番号５）とゲノムＤＮＡ配列（配列番号６）を比較し、イントロンを決定した。

＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ５のｃＤＮＡ配列の決定＞
表１に記載の配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、
ＢＧＬ２と同様にして、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＢＧＬ５をコードする配列（配列番号９）を増幅し、遺伝子導入した宿主株が発現したＲＮＡから得られたｃＤＮＡをシーケンス解析し、得られた配列（配列番号８）とゲノムＤＮＡ配列（配列番号９）を比較し、イントロンを決定した。

＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ６のｃＤＮＡ配列の決定＞
前記＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ２のｃＤＮＡ配列の決定＞で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（製品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡社製）を用いたＰＣＲによって、ＢＧＬをコードする配列（配列番号２）を増幅した。ＰＣＲは、９４℃、２分間を１サイクルした後、９６℃、２０秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに７２℃、５分間を３０サイクルすることにより行った。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＸＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。

＜ｎｉａＤ遺伝子を含む大腸菌ベクターｐＢＲ−ｎｉａＤの調製＞
麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ） ＲＩＢ４０株（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手。ＮＢＲＣ番号：１００９５９。以下「ＲＩＢ４０株」と略記する。）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬ２等のｃＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行い、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤのｃＤＮＡを増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物と大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）を制限酵素ＡｖａI及びＮｄｅIを用いて３７℃で消化した後、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的バンドを切り出し、そのゲル片からＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出・精製することによって、ｐＢＲ３２２及びｎｉａＤのｃＤＮＡの制限酵素処理断片を得た。これらのＤＮＡ断片をＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（以下「ＪＭ１０９株」と略記する。）に形質転換した。その結果、プラスミドｐＢＲ−ｎｉａＤ（ｐＢＲ３２２の制限酵素ＡｖａI及びＮｄｅIの間にｎｉａＤのｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド）が導入された形質転換体を得た。

＜ａｇｄＡターミネーターのｐＢＲ−ｎｉａＤへの組み込み＞
ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬ２等のｃＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行い、麹菌由来ａｇｄＡ遺伝子のターミネーター領域（以下、「ａｇｄＡターミネーター」ということがある。）のｃＤＮＡを増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物とｐＢＲ−ｎｉａＤを制限酵素ＳａｌI及びＡｖａIを用いて３７℃で消化した後、前記ｐＢＲ−ｎｉａＤの調製と同様にして、得られた消化物からｐＢＲ−ｎｉａＤ及びａｇｄＡターミネーターのｃＤＮＡの制限酵素処理断片を得、これらのＤＮＡ断片を連結してＪＭ１０９株に形質転換した。その結果、プラスミドｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ｐＢＲ３２２−ｎｉａＤの制限酵素ＳａｌI及びＡｖａIの間にａｇｄＡターミネーターのｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド）が導入された形質転換体を得た。

＜ｅｎｏＡプロモーターのｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み＞
ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３１で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬ２等のｃＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行い、麹菌由来ｅｎｏＡ遺伝子のプロモーター領域（以下、「ｅｎｏＡプロモーター」ということがある。）のｃＤＮＡを増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物とｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを制限酵素ＮｈｅI及びＳａｌIを用いて３７℃で消化した後、前記ｐＢＲ−ｎｉａＤの調製と同様にして、得られた消化物からｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ及びｅｎｏＡプロモーターのｃＤＮＡの制限酵素処理断片を得、これらのＤＮＡ断片を連結してＪＭ１０９株に形質転換した。その結果、プラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤの制限酵素ＮｈｅI及びＳａｌIの間にｅｎｏＡプロモーターのｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド）が導入された形質転換体を得た。

＜ＢＧＬゲノムＤＮＡのｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み＞
まず、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを制限酵素ＳｍａＩを用いて３０℃で消化した後、前記ｐＢＲ−ｎｉａＤの調製と同様にして、得られた消化物からｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤのＳｍａＩ処理断片を得た。
当該ＳｍａＩ処理断片と前記で精製されたＢＧＬ２をコードする配列とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結してプラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ＢＧＬ麹菌発現用ベクター）を得、当該プラスミドをＳｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に形質転換し、ＢＧＬ２大腸菌形質転換株を得た。得られた形質転換株を１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地で３７℃、１８０ｒｐｍで１晩培養し、培養物からＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを大量調製した。
ＢＧＬ２をコードする配列に代えて、ＢＧＬ３をコードする配列、ＢＧＬ５をコードする配列、又はＢＧＬ６をコードする配列をそれぞれ用い、同様にして、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ３−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ５−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ、及びｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ６−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを大量調製した。

（２） ＢＧＬ麹菌発現用ベクターを導入した麹菌の形質転換体の作製
定法であるＰＥＧ−カルシウム法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．,ｖｏｌ．２１８，ｐ．９９〜１０４（１９８９年））により、上記プラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ等を用いて、麹菌アスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株（独立行政法人酒類総合研究所より入手。）を形質転換した。ツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（３％（質量／容量）デキストリン、０．１％（質量／容量）リン酸２水素カリウム、０．２％（質量／容量）塩化カリウム、０．０５％（質量／容量）硫酸マグネシウム、０．００１％（質量／容量）硫酸鉄、０．３％（質量／容量）硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、形質転換体（ＢＧＬ２麹菌形質転換株、ＢＧＬ３麹菌形質転換株、ＢＧＬ５麹菌形質転換株、及びＢＧＬ６麹菌形質転換株）を得た。

（３） ＢＧＬ麹菌形質転換株からのＢＧＬ調製
作製した各ＢＧＬ麹菌形質転換株を、ツアペクドックス培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。５００ｍＬ容三角フラスコに入った１００ｍＬのＰＤ液体培地（２％（質量／容量）デキストリン、１％（質量／容量）ポリペプトン、０．１％（質量／容量）カザミノ酸、０．５％（質量／容量）リン酸２水素カリウム、０．０５％（質量／容量）硫酸マグネシウム、０．１％（質量／容量）硝酸ナトリウム）に最終胞子濃度１×１０^４／ｍＬとなるように植菌した。３０℃で３日間の液体培養を行い、目的遺伝子産物（ＢＧＬ）を培地中に分泌発現させた。培養後の当該培養液を酵素サンプルとした。

当該酵素サンプル中の各ＢＧＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。酵素サンプルのＳＤＳ電気泳動は、１０−２０％のミニグラジェントゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いて行った。酵素サンプルとＴｒｉｓ−ＳＤＳβＭＥサンプル処理液（ＡＴＴＯ社製）を１：１で混合した後に１００℃で５分間処理し、当該混合液２０μＬを泳動させた。泳動終了後、固定化したゲルをＥｚＳｔａｉｎＡＱｕａ（ＡＴＴＯ社製）で染色し、タンパク質のバンドを可視化した。その後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｐｌｕｓシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、当該ゲルの画像を取得した。取得画像をＩｍａｇｅ Ｌａｂ ２．０ソフトウェアにより解析し、タンパク質定量を行った。
図１に、酵素サンプル（ＢＧＬ２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（レーン左：タンパク質分子量指標、レーン右：酵素サンプル）を、図２に、酵素サンプル（ＢＧＬ３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（レーン右：タンパク質分子量指標、レーン左：酵素サンプル）を、図３に、酵素サンプル（ＢＧＬ５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（レーン右：タンパク質分子量指標、レーン左：酵素サンプル）を、図４に、酵素サンプル（ＢＧＬ６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（レーン右：タンパク質分子量指標、レーン左：酵素サンプル）を、それぞれ示す。この結果、酵素サンプル（ＢＧＬ２）には、分子量約１２０ｋＤａのＢＧＬが含まれており、酵素サンプル（ＢＧＬ３）には、分子量約１３０ｋＤａのＢＧＬが含まれており、酵素サンプル（ＢＧＬ５）には、分子量約１４０ｋＤａのＢＧＬが含まれており、酵素サンプル（ＢＧＬ６）には、分子量約８０ｋＤａのＢＧＬが含まれていることが確認できた。

（４） 麹菌により発現させたアラビノフラノシダーゼ（Ａｒａｆ）の製造
＜Ａｋａｂｆ２（ＧＨ５４）のｃＤＮＡ及びＡｏａｂｆ２（ＧＨ５１）のｃＤＮＡのｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み＞
Ａｋａｂｆ２（ＧＨ５４）をコードする塩基配列（ｃＤＮＡ、配列番号１５）からなるＤＮＡ断片（人工合成品、株式会社タカラバイオ製）を鋳型として、表１に記載の配列番号３２で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３３で表される塩基配列からなるプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（製品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡社製）を用いたＰＣＲによって、Ａｋａｂｆ２をコードする配列を増幅した。ＰＣＲは、９４℃、２分間を１サイクルした後、９６℃、２０秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに７２℃、５分間を３０サイクルすることにより行った。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＸＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
Ａｏａｂｆ２（ＧＨ５１）をコードする塩基配列（ｃＤＮＡ、配列番号１７）からなるＤＮＡ断片（人工合成品、株式会社タカラバイオ製）を鋳型とし、表１に記載の配列番号３４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３５で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は同様にしてＰＣＲを行い、Ａｏａｂｆ２をコードする配列を増幅して精製した。

ＢＧＬ２をコードする配列に代えて、前記で精製したＡｋａｂｆ２をコードする配列又はＡｏａｂｆ２をコードする配列をそれぞれ用いた以外は、＜ＢＧＬゲノムＤＮＡのｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み＞と同様にして、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−Ａｋａｂｆ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ、及びｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−Ａｏａｂｆ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを大量調製した。

＜Ａｒａｆ麹菌発現用ベクターを導入した麹菌の形質転換体の作製＞
ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−Ａｋａｂｆ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ、及びｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−Ａｏａｂｆ２−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを用いた以外は、ＢＧＬ麹菌発現用ベクターを導入した麹菌の形質転換体と同様にして、形質転換体（Ａｋａｂｆ２麹菌形質転換株、及びＡｏａｂｆ２麹菌形質転換株）を得た。

＜Ａｒａｆ麹菌形質転換株からのＡｒａｆ調製＞
ＢＧＬ麹菌形質転換株と同様にして、作製したＡｋａｂｆ２麹菌形質転換株及びＡｏａｂｆ２麹菌形質転換株を胞子形成させ、回収した胞子を培養し、培養後の当該培養液を酵素サンプルとした。
当該酵素サンプル中の各Ａｒａｆは、ＢＧＬの酵素サンプルと同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析し、タンパク質定量を行った。

（５）ＢＧＬの酵素活性の測定
酵素活性はＵｎｉｔ（Ｕ）にて示す。１Ｕは、１分間に基質から生成物を１μｍｏｌ生産する酵素量であり、以下の式で定義される。
１Ｕ（μｍｏｌ／ｍｉｎ）＝［生成糖（μｍｏｌ／Ｌ）］×［反応液量（Ｌ）］／［反応時間（ｍｉｎ）］
また、タンパク質１ｍｇ当たりの比活性は、下記式により算出される。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝［Ｕｎｉｔ（Ｕ）］／［タンパク質量（ｍｇ）］

＜ＣＭＣ分解活性の測定＞
標準基質として、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。また、検量線は、１０ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）グルコース溶液を２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で適宜希釈して調製した５点の希釈系列（０．５〜７．５ｍＭ）の測定値から作成した。
具体的には、まず、１．５ｍＬ容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに１９０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファーと２００μＬの１％（質量／容量）ＣＭＣ溶液（溶媒：２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５））を加えて充分に混合した液を３０℃に調整した。次いで、各チューブに対して、１０μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から１５分経過後に、４００μＬのＤＮＳＡ（ジニトロサリチル酸）溶液を加えて混合して反応を停止させた後、１００℃で５分間煮沸し、氷中で冷却させた。その後、各チューブから１００μＬの反応溶液を分取し、１００μＬの蒸留水で希釈した溶液の５４０ｎｍの吸光度（Ａ５４０）を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて２０ｍＭ酢酸バッファーを添加して同様に処理したサンプルを用いた。Ａ５４０の測定値と検量線からグルコース濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝（［グルコース濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）］×１５×０．４００／０．０１０）／（１５×［タンパク質量（ｍｇ）］）

＜キシラン分解活性の測定＞
標準基質として、可溶性キシランを使用した。１ｇのカバノキ由来のキシラン（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｍＬの水に混合した混合液を１００℃で２時間加熱した後、固形分を除去して液体分のみを回収し、これを乾固させたものを、可溶性キシランとして使用した。また、検量線は、１０ｍＭキシロース溶液を２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で適宜希釈して調製した５点の希釈系列（０．５〜３．０ｍＭ）の測定値から作成した。
具体的には、まず、１．５ｍＬ容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに１８０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファーと２００μＬの１％（質量／容量）可溶性キシラン溶液（溶媒：２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５））を加えて充分に混合した液を３０℃に調整した。次いで、各チューブに対して、２０μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から１５分経過後に、４００μＬのＤＮＳＡ溶液を加えて混合して反応を停止させた後、１００℃で５分間煮沸し、氷中で冷却させた。その後、各チューブから１００μＬの反応溶液を分取し、１００μＬの蒸留水で希釈した溶液の５４０ｎｍの吸光度（Ａ５４０）を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて２０ｍＭ酢酸バッファーを添加して同様に処理したサンプルを用いた。Ａ５４０の測定値と検量線からキシロース濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝（［キシロース濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）］×１５×０．４００／０．０２０）／（１５×［タンパク質量（ｍｇ）］）

＜ＰＮＰＧ分解活性の測定＞
標準基質として、ＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニルグルコシド）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。ＰＮＰＧ分解活性は、主にβ−グルコシダーゼ活性の指標となる。また、検量線は、１０００μｍｏｌ／Ｌ ＰＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）溶液を２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で適宜希釈して調製した５点の希釈系列（０〜２００μＭ）の測定値から作成した。
具体的には、まず、１．５ｍＬ容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに６１５μＬの２００ｍＭ酢酸バッファーと５０μＬのＰＮＰＧ溶液（３．４ｍＭ、溶媒：超純水）を加えて充分に混合した液を３０℃に調整した。次いで、各チューブに対して、１０μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から１５分経過後に、６２５μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を加えて混合して反応を停止させた。その後、各チューブから２００μＬの反応溶液を分取し、４２０ｎｍの吸光度（Ａ４２０）を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて２０ｍＭ酢酸バッファーを添加して同様に処理したサンプルを用いた。Ａ４２０の測定値と検量線からＰＮＰ濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝（［ＰＮＰ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）］×０．００１×０．６７５／０．０１）／（１５×［タンパク質量（ｍｇ）］）

＜ＢＧＬの酵素活性測定結果＞
ＢＧＬ２麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ２について、ＣＭＣ分解活性、キシラン分解活性及びＰＮＰＧ分解活性を測定したところ、ＣＭＣ分解活性は０．７６Ｕ／ｍｇ、キシラン分解活性は０．７６Ｕ／ｍｇ、ＰＮＰＧ分解活性は３．０８Ｕ／ｍｇであった。つまり、ＢＧＬ２は、ＰＮＰＧ活性とキシラン分解活性とＣＭＣ分解活性を有しており、ＰＮＰＧ活性のほうが、キシラン分解活性とＣＭＣ分解活性よりも比活性で４倍以上高かった。これらの結果から、ＢＧＬ２が、β−グルコシダーゼ活性を有していることが確認された。

ＢＧＬ３麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ３について、ＰＮＰＧ分解活性（比活性）を測定した。この際、比較例として、市販のアクレモニウム属菌由来の糖化酵素混合物（商品名：アクレモニウムセルラーゼ、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ社製）から精製したＢＧＬ（以下、「市販ＢＧＬ」ということがある。）を用いた。この結果、ＰＮＰＧ分解活性（比活性）は、比較例とした市販ＢＧＬは２０．３Ｕ／ｍｇであったのに対して、ＢＧＬ３では３２．１Ｕ／ｍｇであった。すなわち、ＢＧＬ３麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ３は、市販ＢＧＬよりもＰＮＰＧ分解活性が１．５倍以上も高く、優れたβ−グルコシダーゼ活性を有していることが確認された。

ＢＧＬ５麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ５、及びＢＧＬ６麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ６についても、それぞれＰＮＰＧ分解活性（比活性）を測定した。この結果、ＢＧＬ５麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ５のＰＮＰＧ分解活性（比活性）は１３．２Ｕ／ｍｇであり、ＢＧＬ６麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ６のＰＮＰＧ分解活性（比活性）は１５．９Ｕ／ｍｇであった。すなわち、ＢＧＬ５麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ５、及びＢＧＬ６麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬ６は、いずれもＰＮＰＧ分解活性を有していることが確認された。

（６） Ａｋａｂｆ２及びＡｏａｂｆ２の糖化活性の測定
＜ＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａｆ活性＞
標準基質として、ｐ−ニトロフェニルアラビノフラノシド（ＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｆｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）（ＰＮＰ−α−Ａｒａｆ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。
具体的には、まず、１．５ｍＬ容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに１００μＬのＭａｃｌｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ４．０）と１２５μＬのＰＮＰ−α−Ａｒａｆ溶液（２ｍＭ、溶媒：超純水）を加えて充分に混合した液を、４５℃で５分間プレ加熱した。次いで、各チューブに対して、２５μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から１５分経過後に、２５０μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を加えて混合して反応を停止させた。その後、各チューブから２００μＬの反応溶液を分取し、４０５ｎｍの吸光度（Ａ４０５）を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて２０ｍＭ酢酸バッファーを添加して同様に処理したサンプルを用いた。Ａ４０５の測定値と検量線（ＰＮＰ標準液を用い、０〜２００μＭの５点で作成）からＰＮＰ濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝（［ＰＮＰ濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）］×０．００１×０．２５０／０．０２５）／（１５×［タンパク質量（ｍｇ）］）

配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるセルビオハイドラーゼと、キシラナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ｅｎｄｏ−１，４−ｂｅｔａ−ｘｙｌａｎａｓｅ Ａ、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ２４１２７）と、β−キシロシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来β−ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ、耐熱性酵素研究所製）と、配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるＢＧＬとを、ＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）が０．２〜０．５：０．３：１で混合した酵素調製物を比較酵素調製物１として調製した。また、この比較調製物１の０．１６ｍｇに、前記（４）で調製した酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）又は酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）を酵素活性が０．３５Ｕとなるように混合した酵素調製物を調製した。酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）を混合した酵素調製物を酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）、酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）を混合した酵素調製物を酵素調製物（Ａｏａｂｆ２）とした。酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）又は酵素調製物（Ａｏａｂｆ２）と比較調製物１との活性の差が、酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）又は酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）の活性である。

比較調製物１、酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）、及び酵素調製物（Ａｏａｂｆ２）をそれぞれ用いて、ＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａｆ活性を調べた。比較調製物１を用いた場合の活性と、酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）又は酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）を用いた場合の活性との差から、酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）及び酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）のＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａｆ活性を求めた。この結果、Ａｋａｂｆ２のＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａｆ活性は７４．８０Ｕ／ｍｇであり、Ａｏａｂｆ２のＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａｆ活性は１６．５２Ｕ／ｍｇであった。

＜へミセルロース分解物の単糖化率＞
まず、基質としてリグノセルロース系バイオマスであるコーンストーバーを微粉砕したものに、２５％（質量／質量）のアンモニア水を、質量比が１：２．５となるように混合して、コーンストーバー及びアンモニアを含む基質混合物を得た。次に、前記基質混合物を、８０℃の温度で８時間保持して糖化前処理を行った後、アンモニアを分離し、ｐＨ４．５に調整した。次いで、コーンストーバーの含有量が２０体積％となるように調整して、糖化前処理物を得た。この糖化前処理物に、前記で調製した各酵素調製物をそれぞれ、基質（コーンストーバー）当たりの酵素終濃度が２〜３ｍｇ／ｇ（コーンストーバー）となるように添加し、５０℃で３日間反応を行った。反応中は、１６０ｒｐｍ浸透撹拌を加えた。

反応終了後に得られた糖化物をサンプリングチューブに分注し、１５，７６０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離処理を行った。得られた上清を新しい１．５ｍＬ容プラスチックチューブに移し、９５℃で５分間熱処理した後、１５，７６０×ｇ、４℃で５分間遠心分離処理を行った。得られた上清は、新しい１．５ｍＬ容プラスチックチューブに移した後、０．２μｍ（１３ｍｍディスク)フィルターでろ過した。０．２ｍＬのろ液をバイアルに移し、下記の条件でＨＰＬＣ測定を行って糖を検出し、糖濃度を評価した。ＨＰＬＣの糖標準としては、グルコース、キシロース、及びアラビノース（各和光純薬社製）を用いた。

糖濃度測定装置；
セパレーター：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社製）、
ＲＩ検出器：Ｗａｔｅｒｓ ２４１４（Ｗａｔｅｒｓ社製）、
カラム：Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−ｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）。
糖濃度測定条件；
溶離液：超純水、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：８５℃、
検出器温度：４０℃。

また、０．２μｍ（１３ｍｍディスク)フィルターでろ過した後の糖化物を、前記と同じ条件でＨＰＬＣカラムに供し、溶離液を０．２５分間隔で分取し、溶離時間０〜１５分間の溶離液を取得した。各溶離液サンプルに、終濃度４％になるように硫酸を添加し、１２１℃で６０分間オートクレーブ処理を行った。処理後の各サンプルは、炭酸ナトリウムで中和した後、同条件でＨＰＬＣカラムに供し、構成糖の分析を行った。

図５に、比較酵素調製物１により得られた糖化物の、ＨＰＬＣにおいてＲＩ検出器で検出されたクロマトグラムのうち二糖以上の糖類が溶離されていると思われる溶離時間７〜１１分の画分を示す。また、図６に、同じく比較酵素調製物１により得られた糖化物の溶離時間７〜１０．５分の画分のグルコース、キシロース、及びアラビノースの濃度（質量／容量％）の測定結果を示す。溶離時間７〜１０．５分の画分を図５及び６に示すようにＡ〜Ｄの４つに分けたところ、キシロース−アラビノースで構成されたオリゴ糖が含まれており、Ｄの部分には、バイオマスの糖構成から、アラビノキシランが含まれていると考えられた。

図７に、比較酵素調製物１により得られた糖化物、酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）により得られた糖化物、及び酵素調製物（Ａｏａｂｆ２）により得られた糖化物における、ＨＰＬＣの溶離時間７〜１０．５分のクロマトグラムを示す。この結果、酵素調製物（Ａｋａｂｆ２）により得られた糖化物及び酵素調製物（Ａｏａｂｆ２）により得られた糖化物では、比較酵素調製物１により得られた糖化物よりも、溶離時間７〜１０．５分の各画分中のオリゴ糖量が低下していることがわかった。バイオマスとしてコーンストーバーに代えて稲わらを用いた場合にも、同様の結果が得られた。

表２に、ヘミセルロース分解物の単糖化率を示す。この結果、コーンストーバーと稲わらのどちらにおいても、ヘミセルロース分解物の単糖化を、Ａｋａｂｆ２（ＧＨ５４）に対してＡｏａｂｆ２（ＧＨ５１）は２０％も促進できた。４〜５糖程度のオリゴ糖の糖化には、Ａｋａｂｆ２（ＧＨ５４）よりもＡｏａｂｆ２（ＧＨ５１）がより好ましいことがわかった。

また、コーンストーバーを基質とした場合における、Ａｋａｂｆ２（ＧＨ５４）とＡｏａｂｆ２（ＧＨ５１）によって分解されたオリゴ糖量の割合（分解率）を、比較酵素調製物１による糖化物の糖量を１００％として算出した。表３に、Ａ部分とＢ部分における分解率と、Ｃ部分とＤ部分における分解率とを示す。

さらに、前記の比較調製物１の０．１６ｍｇに、前記（４）で調製した酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）を０．００１、０．０１、０．１、１、又は１０Ｕとなるように混合した酵素調製物を用いて、前記と同様にコーンストーバーを基質として糖化処理をし、ヘミセルロース分解物の単糖化率（糖化効率、％）を調べ、比較した。酵素調製物中の酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）の酵素活性が１Ｕの場合の単糖化率を１００％とした相対単糖化率（相対糖化効率）を図８に示す。

（７） ＢＧＬ２等含有酵素調製物の糖化活性の測定
測定に使用する酵素調製物は、前記（３）で調製した酵素サンプル（ＢＧＬ）と、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるセルビオハイドラーゼと、キシラナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ｅｎｄｏ−１，４−ｂｅｔａ−ｘｙｌａｎａｓｅ Ａ、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ２４１２７）と、β−キシロシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来β−ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ、耐熱性酵素研究所製）と、前記（４）で調製した酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）又は酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）とを含有させて調製した。

前記（６）と同様にしてコーンストーバーから調製した糖化前処理物に、前記で調製した酵素調製物を、基質（コーンストーバー）当たりの酵素終濃度が２ｍｇ／ｇ（コーンストーバー）となるように添加し、５０℃で３日間反応を行った。反応中は、１６０ｒｐｍ浸透撹拌を加えた。また、比較例として、前記（４）で調製した酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）又は酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）のみを含有させなかった酵素調製物（比較酵素調製物２）を用いて同様に反応を行った。

反応終了後に得られた糖化物について、前記（６）と同様にしてＨＰＬＣ測定を行った。図９〜１２に、それぞれ、ＢＧＬ２、３、５、又は６を含有させた酵素調製物による糖化物の溶離時間５〜１９分のクロマトグラムを示した。図９〜１２中、「Ａｂｆなし」は比較酵素調製物２を用いた場合の結果を、「Ａｋａｂｆ２」は比較酵素調製物２に酵素サンプル（Ａｋａｂｆ２）を添加した酵素調製物を用いた場合の結果を、「Ａｏａｂｆ２」は比較酵素調製物２に酵素サンプル（Ａｏａｂｆ２）を添加した酵素調製物を用いた場合の結果を、それぞれ示す。この結果、いずれのＢＧＬを用いた場合でも、オリゴ糖のピーク（溶離時間７〜１１分のピーク）は、「ａｂｆなし」よりも、「Ａｋａｂｆ２」と「Ａｏａｂｆ２」は明らかに低くなっており、単糖のピーク（溶離時間１１分以降のピーク）は、「ａｂｆなし」よりも、「Ａｋａｂｆ２」と「Ａｏａｂｆ２」は明らかに高くなっていたことから、Ａｋａｂｆ２又はＡｏａｂｆ２を含んだ酵素調製物を用いることにより、単糖化効率が向上したことが確認された。

本発明に係るβ−グルコシダーゼ、及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース系バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０８

Claims (10)

1. リグノセルロース系バイオマスを基質とし、
   β−グルコシダーゼと、セルロース結合ドメインを含有するセロビオハイドラーゼと、キシナラーゼ又はキシロシダーゼと、アラビノフラノシダーゼとを含有し、
   前記β−グルコシダーゼが、
   （１Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （１Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   （１Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   （２Ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （２Ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   （２Ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   （３Ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （３Ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   （３Ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   （４Ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （４Ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は
   （４Ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
   からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有することを特徴とする、糖化酵素組成物。
2. 前記セロビオハイドラーゼが配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記アラビノフラノシダーゼがＧＨ５１又はＧＨ５４である、請求項１に記載の糖化酵素組成物。
3. 前記β−グルコシダーゼと前記セロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）が、０．０２〜２．５：１の範囲内である、請求項１又は２に記載の糖化酵素組成物。
4. さらに、セルロース結合ドメインを非含有であるエンドグルカナーゼを含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物。
5. 前記エンドグルカナーゼが配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４に記載の糖化酵素組成物。
6. 組成物全体に対する、前記β−グルコシダーゼ、前記エンドグルカナーゼ、及び前記セロビオハイドラーゼの合計含有量が、３０〜８０質量％である、請求項４又は５に記載の糖化酵素組成物。
7. 前記β−グルコシダーゼ、前記エンドグルカナーゼ、及び前記セロビオハイドラーゼの含有量比（質量比）が０．０２〜２．５：０．０２〜２．５：１の範囲内である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物。
8. 前記リグノセルロース系バイオマスが、稲わら、又はコーンストーバーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物、及びリグノセルロース系バイオマスを含有することを特徴とする、基質・糖化酵素混合物。
10. リグノセルロース系バイオマスを、請求項１〜８のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物を用いて糖化処理することを特徴とする、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法。