WO2016080805A1 - 베타 만난아제 함유 반추동물용 사료효소제 - Google Patents

베타 만난아제 함유 반추동물용 사료효소제 Download PDF

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WO2016080805A1
WO2016080805A1 PCT/KR2015/012548 KR2015012548W WO2016080805A1 WO 2016080805 A1 WO2016080805 A1 WO 2016080805A1 KR 2015012548 W KR2015012548 W KR 2015012548W WO 2016080805 A1 WO2016080805 A1 WO 2016080805A1
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feed
beta
ruminant
ruminants
mannanase
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PCT/KR2015/012548
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이재환
이정진
오화균
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주식회사 씨티씨바이오
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    • A23K10/40—Mineral licks, e.g. salt blocks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S426/00—Food or edible material: processes, compositions, and products
    • Y10S426/807—Poultry or ruminant feed

Definitions

  • the present invention is to provide a feed enzyme for ruminant livestock containing beta-met kinase.
  • livestock provide livestock products such as meat, milk, and eggs, forming an inseparable relationship.
  • livestock have a deeper meaning in terms of supplying protein sources to us by eating low-quality vegetable feed.
  • attempts to increase livestock productivity have been made steadily and are making rapid strides through advanced technology.
  • Feeds containing large amounts of mannan contribute to the reduction of feed cost along with agri-food by-products and as a protein source for ruminants.
  • mannan Unlike ruminants, fibrolytic bacteria present in the rumen can degrade beta-mannan.
  • feed intake is reduced (Singhania, 2008).
  • the enzyme field is one of the most prominent fields in the last two decades, and the main purpose of the enzyme use is to improve the digestibility of low-quality feed using enzymes and to remove the anti-nutritive factor (ANF).
  • ANF anti-nutritive factor
  • the grafting of these enzymes in livestock is very helpful in eliminating antinutrients in feed and improving digestibility, as can be seen in the most commonly used phytase, xylanase and ⁇ -glucanase.
  • An object of the present invention is to provide a technique using beta-mannanase as a feed enzyme that can increase the growth rate and feed efficiency of ruminants.
  • Ruminant feed enzyme is a composition containing a beta-nananase ( ⁇ -mannanase) that is blended or directly administered to ruminant livestock feed for ruminant livestock developed at least 12 weeks old .
  • ⁇ -mannanase beta-nananase
  • the beta-met kinase may be an endo-beta-mannase (endo- ⁇ -mannanase).
  • the beta-met kinase can be obtained from a microorganism producing the mannase or a transformant transduced with the mannase gene.
  • the beta-met kinase is a) met kinase deposited with the accession number KCTC 0800BP; b) mannanase deposited with accession number KCTC 10279BP; c) mannanase produced by expression of E. coli transformed by introducing a mannase gene of Bacillus licheniformis WL-12 strain; And d) mannanases deposited with accession number KCTC 11105BP; e) mannanase deposited with accession number KCTC 11302BP; And f) a mixture of mannanases selected from a) to e) above.
  • the beta-met kinase may be used in the form of a soluble and soluble soluble mannase composition by dissolving KCl, NaCl or a mixture thereof.
  • the met kinase may be a concentrated mannase concentrate after removing the cells from the Bacillus strain culture medium.
  • the composition may further comprise a bacteriophage.
  • the bacteriophage is Salmonella tie blood bunch Titanium (Salmonella thyphimurium), Entebbe S. utility disk (S. enteritidis), two S. Dublin (S. dublin), S. Derby (S. derby), Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ), E. coli k99 and f41, and Clostridium perfringens (Clstridium perfringens ) may be targeted to the selected bacteria.
  • the ruminant may be a native goat or Korean cattle breeding cattle as a livestock.
  • the feed may be an excellent economic feed containing 10% by weight or more of the raw material selected from palm bak, palm bak, soybean hull, soybean meal, copra bak, beet pulp, and mixtures thereof having a high content of mannan.
  • the addition of beta-met kinase improves the growth rate, feed efficiency, and nitrogen utilization rate in ruminants, thereby improving feed efficiency and raw material availability in ruminant growth, and using low-cost raw materials such as soybean meal, palm leaf, palm leaf, and brew Therefore, the economics can be improved.
  • the addition of 400 U / kg of beta-mannanase is sufficient to induce such improvement when applied to Korean native goats.
  • the addition of beta-mannase increased the daily gain and decreased the feed rate, regardless of the type of feed. It was confirmed that the addition of beta-met kinase in the mixed feed in the uncultivated cattle increased the growth rate and feed efficiency regardless of the type of feed.
  • Figure 1 is a graph showing the weight change of each animal during the experimental period (three months total) of specification of Hanwoo uncultivated cattle in Experimental Example 3 ( P ⁇ 0.05).
  • ruminant or “ruminants” is meant to include cows, sheep, goats, camels, buffaloes, deer, reindeer, caribou (caribou) and elk with a complex and many roomy stomach.
  • Neuron fiber refers to a portion of a feed that is insoluble in neutral detergent and resembles a cell wall component except pectin.
  • ADF Acid Cleansing Fiber
  • Cellulose is a hydrocarbon consisting of glucose units linked by 1,4 bonds.
  • Hemicellulose refers to polysaccharides bound to cellulose and lignin of the cell wall of a plant and includes glucan (ex addition to starch), mannan, xylan, arabinan or polyglucuronic acid or polygalacturonic acid. This is determined by the difference between NDF and ADF.
  • Mannosidase is an enzyme for digesting and glycosylating mannan.
  • Three kinds of enzymes are commonly used, namely endo- ⁇ -mannanase, exo- ⁇ -mannanase, and mannosidase ( ⁇ - mannosidase) is known to work together.
  • endomannanase randomly hydrolyzes ⁇ -D-1,4-mannopyranosyl bonds of met polysaccharides having a degree of polymerization of at least 4 mannose tetraosine. It catalyzes the reaction and plays a major role in hydrolyzing mannan.
  • the present invention focused on “endomananase” of these enzymes, after which the enzyme is referred to as “mannanase” or “beta mannanase” for convenience.
  • Met kinase is Pseudomonas (Aeromonas) difficulties, including Bacillus subtilis, Enterococcus (Enterococcus), Pseudomonas (Pseudomonas), as well as bacteria belonging to the genus Streptomyces (Streptomyces) is produced from a microorganism of mold, yeast or the like.
  • the microorganisms used in the production of the metase mainly include Trichoderma and Aspergillus fungal strains, and the fungal metase has the maximum activity under acidic conditions.
  • the present invention relates to a feed enzyme that can be added to ruminant feed or directly administered to ruminant, wherein the ruminant has four stomachs, and anaerobic microorganisms (bacteria, fungi, protozoa) live on the rumen, It is an animal with rumen, a special digestive system, through which the effective digestion of plant fiber occurs through its activity.
  • a feed enzyme that can be added to ruminant feed or directly administered to ruminant, wherein the ruminant has four stomachs, and anaerobic microorganisms (bacteria, fungi, protozoa) live on the rumen, It is an animal with rumen, a special digestive system, through which the effective digestion of plant fiber occurs through its activity.
  • the calf is composed of four stomachs, such as the congratulations, but until two weeks of birth, the digestive organs are not developed, so the first to third stomachs are inactive, and the fourth position is almost the same as that of the unit animal. Therefore, in the present invention, the ruminant is preferably a 12-week-old sexual axis in which the rumen occupies 2/3 or more of the stomach, and the calf before the rumen is formed is excluded from the scope of the present invention.
  • Beta mannanase ( ⁇ -mannanase) in the feed enzyme of the present invention lowers the viscosity in the digestive tract, improves the digestibility of various nutrients, causes energy loss through immune system stimulation shown by anti-nutritive mannan, and secretes insulin and igf-1 Surfaces such as obstructions can be eliminated.
  • the beta-met kinase can be obtained from a microorganism producing the mannase or a transformant transduced with the mannase gene.
  • the kinase met ruminant beta that can indicate the effects even on without decomposition of animals are preferred, but are ssitissi Bio Inc.
  • CTCZYME ® product may be used, and the like.
  • the building digestibility increased significantly as the amount of beta-met kinase (CTCZYME ® ) added to the ruminant feed.
  • Total VFA production, acetic acid, propionic acid, butyric acid and the ratio of acet: propionic acid were all significantly affected by the use of enzymes.
  • Daily gain in goats Daily gain increased significantly, and ⁇ -mannanase supplementation showed positive results that could reduce feed cost by improving productivity in young ruminants.
  • the beta-met kinase can be obtained from a microorganism producing mannase or a transformant transduced with a mannase gene as endo- ⁇ -mannanase.
  • the beta-met kinase may be a water-soluble mannase composition lyophilized by dissolving KCl, NaCl or a mixture thereof.
  • the beta-met kinase may be added in the form of a concentrated mannase concentrate after removing the cells from the Bacillus strain culture.
  • the meetnase concentrate is removed from the culture medium incubated with Bacillus strain producing a metase by the method disclosed in US Patent No. 6,984,406 for about 24 to 30 hours to the maximum production of metnase with 0.45 ⁇ m membrane, It may mean a concentrate concentrated about 20 times through an ultrafilter, but the present invention is not limited to such a concentrate.
  • metnanase concentrate was prepared using the metnanase production strain and culture method disclosed in US Pat. No. 6,984,406 for Bacillus sp. WL-1 strain deposited with accession number KCTC 0800BP. Can be prepared.
  • the ruminant feed enzyme may further include a bacteriophage.
  • the bacteriophage is a virus containing bacteria as a host cell, and has a characteristic of specifically infecting a specific microorganism and inducing growth inhibition or killing of the microorganism.
  • the bacteriophage is Salmonella tie blood bunch Titanium (Salmonella thyphimurium), Entebbe S. utility disk (S. enteritidis), two S. Dublin (S. dublin), S. Derby (S. derby), Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ), E. coli k99 and f41, and Clostridium perfringens type A and C. Bacteriophage C TM (CTCBIO, Inc.).
  • beta-met kinase of the present invention can be added to ruminant feed in various formulations to enhance fibrosis and be administered to ruminants.
  • beta mannanase may be formulated as a solid, liquid, suspending agent, feed additive, mixture, or feed composition.
  • Solid-Beta-Mannase can be formulated in solid form, such as mineral blocks, salts, granules, pills, pellets or powders. In the form of a powder, beta-met kinase can be dispersed in feed bunks or mixed in proportions.
  • Liquids and Suspending Agents-Beta mannanases can be incorporated into a liquid by adding lyophilized or powdered beta mannanase to a suitable liquid, and can be formulated into a liquid or suspension.
  • Beta mannanase may be mixed with animal drinking water or provided in other liquid forms for consumption.
  • Feed Additives-Beta mannanase can be added in the form of a feed additive comprising a formulation of lyophilized microorganisms to which the beta metase is added.
  • Feed additives may be included in the diet of the animal.
  • Feed additives may include at least one feed-grade beta mannase comprising 100 to 500,000 units of beta mannase per mL or g in combination with one or more inactive or active ingredients.
  • Beta mannanases include other active ingredients known in the art, such as, but not limited to, other enzymes including cellulase, xylanase, glucanase, amylase, esterase; Antibiotics; It can be mixed with prebiotics and probiotics.
  • the active ingredient including beta mannanase alone or in combination with other active ingredients, is mixed with nutrients to provide a premixed supplement.
  • Nutrients include both micronutrients and macronutrients such as vitamins and minerals. The premix can then be added to the feed material.
  • Feed Compositions-Beta mannanase may be provided in the form of a feed composition comprising forage or grain feed treated with beta mannanase.
  • Beta mannanase can be mixed with forage or grain feed in dried form, for example as a powder or as a liquid used for example by dipping or spraying.
  • agents can be stabilized through the addition of other proteins or chemical agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers, diluents, and excipients may also be incorporated into this formulation.
  • flavoring agents can be added to provide the beta-metnanase in a palatable form to the animal.
  • the feed enzyme for ruminant containing the beta-met kinase of the present invention can be administered by various methods, oral administration to the feed of the animal is preferred.
  • the amount of beta-mannase added depends on many factors well known to those skilled in the art, for example the type, age and weight of the animal. Beta mannanase may be administered to the animal on a daily basis.
  • the feed enzyme of the present invention is applicable to feed containing 10% by weight or more of raw materials selected from palm bak, palm bak, soybean hull, soybean meal, copra bak, beet pulp, and mixtures having high content of mannan.
  • Manna is contained 30 ⁇ 35% in palm, 25 ⁇ 30% in palm gourd and can be expected to increase the availability of the met through the beta mannase of the present invention as a feed source that is not digested by the digestive enzymes of the animal.
  • the present invention also provides a method of growing a ruminant to which the above-described feed enzyme is applied.
  • feeding a mannan-high feed comprising a raw material selected from palm bak, palm bak, soybean bak, coprabak, and mixtures thereof, which are suitable for ruminants, and the mann-high content It may include the step of applying the enzyme enzyme feed for ruminants.
  • Body weight was measured before the weekly morning salary. Feed and remaining feeds Each step The sample was collected and stored at minus 20 degrees Celsius for analysis. Manure samples were taken during the last 5 days of each trial phase after 16 days of adaptation. The total amount of manure was also collected from the animals before breakfast Measured. Urine 2.8% HCl 200 ml It was collected in a glass container and stored at minus 20 degrees Celsius ( AOAC 2007). Harvested minutes, feed, Remaining feed 96 hours at 60 degrees Celsius Dried After cyclone mill ( Foss , Hiller , Denmark) and then passed through less than 1mm to use for chemical component analysis.
  • Vitamin mix Vitamin C; 10,000 IU / kg, Vitamin B; 30,000 IU / kg.
  • control, treatment 1, and treatment 2 contained 0%, 0.1%, and 0.3% of metnanase in the rich feed, respectively.
  • the compounding ratio was prepared so that the content of beta-met kinase in the rich feed was 114g / kg based on the building standard. This metase content is relatively high compared to the met content in the normal feed.
  • Control , Treatment tool 1 , Treatment 2 Contained in rich feed Met Content is 0%, 0.1% and 0.3% respectively
  • test animals were thought to have enhanced the intestinal health by adding mannanases to produce mannan-oligosaccharides (MOS).
  • MOS mannan-oligosaccharides
  • Nitrogen utilization rate Treatment Zone * SEM P- value Control Treatment tool 1 Treatment 2 Average Linear Nitrogen uptake, g / d 11.2 11.3 12.5 0.63 0.12 ⁇ 0.05 Nitrogen in minutes, g / d 3.7 3.9 4.2 0.22 0.19 0.07 Urine nitrogen, g / d 2.8 2.9 2.7 0.20 0.70 0.65 Nitrogen emissions, g / d 6.5 6.8 6.9 0.35 0.65 0.42 Nitrogen accumulation rate, g ** 4.7 4.5 5.6 0.39 ⁇ 0.05 ⁇ 0.05 Biological value *** 61.4 61.0 67.4 2.44 0.15 ⁇ 0.10
  • Nitrogen accumulation rate Nitrogen intake (nitrogen in minutes + nitrogen in urine)
  • the treatment group was CTCZYME no addition group or 0.1% addition group for grain-soybean meal-based feed (Grain-Soy), CTCZYME no addition group or 0.1% addition group for HMCF-based compound feed (HMCF).
  • the combined TMR was fed twice daily (08:00, 17:00) to free vegetarian diet.
  • Initiation weight, end weight, weight gain per day, daily dry matter intake, and feed conversion rate for each treatment are shown in Table 5 below. Referring to Table 5, there was no significant interaction between the type of feed (grain-soybean meal or HMCF-based feed) and the addition of CTCZYME, and there was no significant difference in daily dry matter intake between treatments. Three months of dietary trials showed that the daily diet gain was significantly higher ( P ⁇ 0.05) in the grain-soybean meal-based diet (943 g / day) than in the HMCF-based diet (854 g / day) (+89 g / day). ).

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Abstract

본 발명은 12 주령 이상의 반추위가 발달한 반추동물 성축용 사료에 배합되거나 반추동물 성축에 직접 투여되고, 베타 만난아제(-mannanase)를 포함하는 반추동물용 사료효소제를 제공한다. 이를 이용하면 만난 함량이 높은 저가 사료의 이용율이 증대되어 경제성을 제고할 수 있고, 반추동물에서 성장율, 사료효율, 질소이용율을 향상시키는 장점이 있다.

Description

베타 만난아제 함유 반추동물용 사료효소제
본 발명은 베타 만난아제를 함유하는 반추동물 성축용 사료효소제를 제공하는 것이다.
인류의 역사를 통해 가축은 고기, 우유, 계란 등의 축산물을 제공하며 불가분의 관계를 형성하고 있다. 특히 가축들은 저질의 식물성 사료원료를 섭취하여 우리에게 단백질원을 공급해 주고 있다는 측면에서 볼 때 그 의미가 더 깊다고 볼 수 있다. 따라서 가축의 생산성을 높이려는 시도는 꾸준히 이루어져 왔고 첨단 기술을 통해서 비약적인 발전을 보이고 있다.
농림축산식품부 (2013)에 의하면 축산물 생산 비용의 50% 이상이 사료비에 기인한다고 한다. 따라서 사료비 절감이 축산경영에서 큰 과제임은 말할 나위가 없다. 만난이 다량 함유된 사료 (팜박, 코프라박, 대두피 등)의 경우 농식품 부산물과 더불어 사료비를 절감하고 반추동물에서 단백질 원료로서 큰 기여를 하고 있다. 단위동물과는 다르게 반추동물에서는 반추위에 존재하는 섬유소 분해 박테리아들이 베타-만난을 분해 할 수 있다. 그러나 만난함량이 높은 사료들의 항영양인자, 즉 낮은 소화율, 낮은 에너지함량, 기호성 문제 등으로 인하여 사료섭취량이 저하되어 그 사용량에 한계가 있다(Singhania, 2008).
한편, 효소분야는 그 중에 최근 20여 년간 가장 각광 받는 분야 중에 하나라 할 수 있으며 효소를 이용한 저질 사료의 소화율개선 및 항영양인자(ANF)의 제거가 효소제 사용의 주 목적이라 할 수 있다. 이러한 효소제의 축산에서의 접목은 현재 가장 많이 사용되고 있는 phytase, xylanase, β-glucanase 에서 알 수 있듯이 사료내 항영양인자를 제거하고 소화율을 개선하는데 큰 도움을 주고 있다.
하지만 반추동물의 경우 반추위내 미생물들이 대부분의 효소를 생산하기 때문에 사료내 효소제 첨가는 별 주목을 받지 못하고 있는 실정이다. 현재 미미하나마 반추동물에서 이용되고 있는 효소들은 거의가 섬유소분해를 도울 목적으로 만들어진 것이다. 하지만 반추위 특성상 그 안에서 이루어지는 미생물간의 상호작용, 공생작용, 분비물에 의한 연쇄반응 등등으로 인해 외부 효소제의 첨가는 사실상 많은 한계에 봉착해 있다고 해도 과언이 아니다.
본 발명의 목적은 반추동물의 성장률 및 사료의 효율을 높이일 수 있는 사료효소제로서 베타 만난아제를 이용하는 기술을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 베타 만난아제를 함유한 사료효소제를 이용하여 반추동물을 생육하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 반추동물용 사료효소제는 12 주령 이상의 반추위가 발달한 반추동물 성축용 사료에 배합되거나 반추동물 성축에 직접 투여되고, 베타 만난아제(β-mannanase)를 포함하는 조성물이다.
일 예에서, 상기 베타 만난아제는 엔도 베타 만난아제(endo-β-mannanase)일 수 있다.
일 예에서, 상기 베타 만난아제는 만난아제를 생산하는 미생물 또는 만난아제 유전자가 형질도입된 형질전환체로부터 얻을 수 있다.
구체적인 예에서, 상기 베타 만난아제는 a) 기탁번호 KCTC 0800BP로 기탁된 만난아제; b) 기탁번호 KCTC 10279BP 로 기탁된 만난아제; c) 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제 유전자를 도입하여 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산된 만난아제; 및 d) 기탁번호 KCTC 11105BP 로 기탁된 만난아제; e) 기탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 만난아제; 및 f) 상기 a) 내지 e) 중 선택된 만난아제의 혼합물 중에서 선택가능하다.
일 예에서, 상기 베타 만난아제는 KCl, NaCl 또는 이들의 혼합물을 용해시켜 동결건조한 수용성 만난아제 조성물 형태로 이용될 수 있다. 여기서, 상기 만난아제는 바실러스균주 배양액에서 균체를 제거한 후 농축한 만난아제 농축액일 수 있다.
일 예에서, 상기 조성물은 박테리오파지를 더욱 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 박테리오파지는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium), S. 엔테리티디스(S. enteritidis), S. 두블린(S. dublin), S. 더비(S. derby), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli) k99 및 f41, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) type A and C 중 선택된 균을 타깃으로 하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 반추동물은 성축으로서 한국재래산양 또는 한우 미경산 육성우일 수 있다.
일 예에서, 상기 사료는 만난의 함량이 높은 팜박, 야자박, 대두피, 대두박, 코프라박, 비트펄프, 및 이들의 혼합물 중 선택된 원료를 10 중량% 이상 포함하는 경제성이 우수한 사료일 수 있다.
본 발명에 따르면 베타 만난아제의 첨가가 반추동물에서 성장율, 사료효율, 질소이용율을 향상시킴으로써 반추동물 생육시 사료 효율과 원료 이용성을 개선시키고 대두박, 팜박, 야자박, 주정박 등 저가 원료를 사용할 수 있으므로 경제성을 향상시킬 수 있다. 특히, 한국재래산양에 적용시 400 U/kg 수준의 베타만난아제 첨가 만으로도 이러한 향상을 유도하는데 충분한 수준임을 확인하였다. 또한, 한우 미경산 육성우에 대한 실험에서 사료의 종류(곡류-대두박 또는 만난고함량 사료)와 관계 없이 베타 만난아제의 첨가는 일당증체량을 높이고, 사료요구율을 감소시키는 경향이 관측되었으며, 결론적으로 한우 미경산 육성우에서 배합사료 내 베타 만난아제의 첨가는 사료의 종류와 상관없이 성장률과 사료효율을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.
도 1은 실험예 3에서 한우 미경산 육성우의 사양 실험 기간(총 3개월간) 동안 동물 별 체중변화를 나타낸 그래프이다(P < 0.05).
이하, 발명의 구현 예들에 따른 사료효소제에 대해 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
"반추동물" 또는 "반추동물들"은 복잡하고 많은 방을 갖는 위를 가지는 소, 양, 염소, 낙타, 물소, 사슴, 순록, 카리부(북미산 순록; caribou) 및 엘크를 포함하는 것을 의미한다.
"NDF"로 약칭되는 "중성 세정(detergent) 섬유"는 중성 세정제에 불용성이고, 펙틴을 제외한 세포벽 구성분과 유사한 사료의 부분을 의미한다.
"ADF"로 약칭되는 "산 세정 섬유"는 산 세정제로 사료 물질의 추출에 따른 불용성 잔사, 또는 헤미셀룰로스를 뺀 세포벽구성성분을 의미한다.
"셀룰로스"는 1,4 결합으로 연결된 글루코스 단위로 구성된 탄화수소이다.
"헤미셀룰로스"는 식물의 세포벽의 셀룰로스 및 리그닌과 결합된 다당류를 의미하고 글루칸(전분 외), 만난, 자일란, 아라비난 또는 폴리글루쿠론 산 또는 폴리갈락튜론 산을 포함한다. 이것은 NDF와 ADF 사이의 차이로 결정된다.
"만난아제"는 만난을 분해하여 당화하기 위한 효소로서 일반적으로 3 종류의 효소, 즉 엔도만난아제(endo-β-mannanase), 엑소만난아제 (exo-β-mannanase) 및 만노시다제 (β-mannosidase)가 함께 작용해야 한다고 알려져 있다. 이들 중 엔도만난아제는 만노즈 중합도가 4개인 만노테트라오즈 이상의 중합도를 갖는 만난 다당류의 β-D-1,4-만노피라노실(β-D-1,4-mannopyranosyl) 결합을 무작위로 가수분해하는 반응을 촉매하며 만난을 가수분해하는데 있어 주된 역할을 한다. 한편, 본 발명에서는 이들 효소 중 "엔도만난아제"에 중점을 두었으며 이후 이 효소를 편의상 "만난아제" 또는 "베타 만난아제"로 칭하였다. 만난아제는 고초균을 비롯하여 애로모나스(Aeromonas), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 세균을 비롯하여 곰팡이, 효모 등의 미생물로부터 생산된다. 또한, 고등식물과 동물 중에도 만난아제를 생산하는 것이 있다. 실제로 만난아제의 생산에 사용되는 미생물로는 주로 트리코더마(Trichoderma), 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 곰팡이 균주들이 있으며 곰팡이 유래의 만난아제는 산성 조건에서 최대 활성을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 반추동물용 사료에 첨가되거나 반추동물에 직접 투여될 수 있는 사료용 효소제에 관한 것으로서, 반추동물은 4개의 위를 가지며, 반추위에는 혐기성 미생물(박테리아, 곰팡이, 원생동물)이 살고 있어, 이들의 활성을 통해 식물 섬유의 효과적 소화가 일어나는 특별한 소화기관인 유위(rumen)를 가지는 동물이다.
한편, 송아지는 성축과 같이 4개의 위로 구성되지만, 갓 태어나서 2주까지는 소화기관이 발달되지 않아 제1 내지 제3의 위는 활동성이 없고, 제4위는 단위동물의 위와 거의 같다. 따라서, 본 발명에서 반추동물은 반추위가 위의 2/3이상을 차지하게 되는 12주령 이상의 성축이 바람직하고, 반추위가 형성되기 전의 송아지 등은 본 발명의 범위에서 제외된다.
본 발명의 사료효소제에서 베타 만난아제(β-mannanase)는 소화기관내 점도를 낮추어 각종 영양소의 소화율이 증진되고, 항영양인자인 만난이 보여주는 면역체계자극을 통한 에너지소실을 일으키고, 인슐린 및 igf-1 분비 방해 등의 부면이 제거될 수 있다.
상기 베타 만난아제는 만난아제를 생산하는 미생물 또는 만난아제 유전자가 형질도입된 형질전환체로부터 얻을 수 있다. 일 예에서, 반추동물의 위에서도 분해되지 않고 효과를 나타낼 수 있는 베타 만난아제가 바람직하고, 씨티씨바이오사의 CTCZYME® 제품이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명자들의 연구에 의하면, 반추동물용 사료에 베타 만난아제 (CTCZYME®)의 첨가량이 증가할수록 건물 소화율이 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다. 총 VFA 생산량, 아세트산, 프로피온산, 뷰티릭산 및 아세트:프로피온산의 비율 모두 유의적으로 효소제 사용으로 인해서 영향을 받았다. 산양에 있어서 일당증체율 일당 증체량이 현저하게 증가하였고 β-mannanase 첨가가 어린 반추동물에 있어서 생산성 향상을 통한 사료비절감을 기대할 수 있는 긍정적인 결과를 얻었다.
상기 베타 만난아제는 엔도 베타 만난아제(endo-β-mannanase)로서 만난아제를 생산하는 미생물 또는 만난아제 유전자가 형질도입된 형질전환체로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, a) 한국 등록특허 제10-0390565호에 공개되고, 기탁번호 KCTC 0800BP로 기탁된 바실러스 속 WL-1 (Bacillus sp. WL-1) 균주로부터 생산된 만난아제; b) 한국 등록특허 제10-0477456호에 공개되고, 기탁번호 KCTC 10279BP 로 기탁된 바실러스 속 WL-7 (Bacillus sp. WL-7) 균주로부터 생산된 만난아제; c) 한국 등록특허 제10-0560375호에 공개되고, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제 유전자를 도입하여 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산된 만난아제; 및 d) 한국 등록특허 제10-1073987호에 공개되고, 기탁번호 KCTC 11105BP 로 기탁된 아스퍼질러스 오리재로부터 생산된 만난아제; e) 한국 등록특허 제10-1403489호에 공개되고, 기탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산된 만난아제; 및 f) 상기 a) 내지 e) 중 선택된 만난아제의 혼합물 중에서 선택될 수 있다. 상기 각각의 베타 만난아제가 개시된 한국 등록특허의 내용은 그 전체가 참조로서 본 발명의 내용에 합체된다.
일 예에서, 상기 베타 만난아제는 KCl, NaCl 또는 이들의 혼합물을 용해시켜 동결건조한 수용성 만난아제 조성물일 수 있다. 여기서, 베타 만난아제는 바실러스균주 배양액에서 균체를 제거한 후 농축한 만난아제 농축액의 형태로 첨가될 수 있다. 상기 만난아제 농축액은 미국 등록특허 제6,984,406호에 개시된 방법으로 만난아제를 생산하는 바실러스 균주를 약 24~30시간 동안 만난아제가 최대한 생산될 때까지 배양한 배양액에서 0.45㎛ 막으로 균체를 제거하고, 한외여과기를 거쳐 약 20배 농축한 농축액을 의미할 수 있으나, 본 발명은 이러한 농축액에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이러한 만난아제 농축액은 기탁번호 KCTC 0800BP로 기탁된 바실러스 속 WL-1(Bacillus sp. WL-1) 균주에 대한 미국 등록특허 제6,984,406호에 개시된 만난아제 생산 균주 및 배양 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 5 g/L을 함유하는 LB 배지에 밀기울 1-3 중량% 또는 유당 0.5-3 중량%을 가한 후 상기 바실러스 속 WL-1 균주를 접종하고 일정 시간 동안 배양한 후, 이 배양액에서 진동막 여과장치를 사용하여 균체를 제거하고 여액을 다시 한외여과를 통해 분자량크기에 따라 정제하여 만난아제 농축액을 제조할 수 있으나, 본 발명은 이러한 만난아제 농축액의 제조 방법에 한정되는 것은 아니다. 상기 미국 등록특허 제6,984,406호는 본 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
또 하나의 예에서, 상기 반추동물용 사료효소제에는 박테리오파지가 더욱 포함될 수 있다. 상기 박테리오파지는 박테리아를 숙주세포로 하는 바이러스로써 특정 미생물을 특이적으로 감염시키고 미생물의 성장 억제 또는 사멸을 유도하는 특성을 가지고 있다. 바람직한 예에서, 상기 박테리오파지는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium), S. 엔테리티디스(S. enteritidis), S. 두블린(S. dublin), S. 더비(S. derby), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli) k99 및 f41, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) type A and C 중 선택된 균을 타깃으로 하는 박테리오파지 CTM (CTCBIO, Inc.)일 수 있다.
이 외에도 본 발명의 베타 만난아제는 섬유소화를 증진하기 위해 다양한 제형으로 반추동물용 사료에 첨가되어 반추동물에 투여될 수 있다. 예를 들어, 베타 만난아제는 고형, 액체, 현탁제, 사료 부가제, 혼합물, 또는 사료 조성물로 제제화 될 수 있다.
i) 고형 - 베타 만난아제는 미네랄 블럭, 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말과 같이 고형으로 제형화 될 수 있다. 분말의 형태에 있어서, 베타 만난아제는 피드 번크(feed bunks)에 흩뿌려지거나 일정비율로 혼합될 수 있다.
ii) 액체 및 현탁제 - 베타 만난아제는 적절한 액체에 동결건조된 또는 분말화된 베타 만난아제를 부가함에 의해 액체에 합체될 수 있어, 액체 또는 현탁액으로 제제화 될 수 있다. 베타 만난아제는 동물의 식수와 혼합될 수 있거나 또는 소비용 다른 액체형태로 제공될 수 있다.
iii) 사료 부가제 - 베타 만난아제는 베타 만난아제가 부가된 동결건조된 미생물의 제제를 포함하는 사료 부가제의 형태로 부가될 수 있다. 사료 부가제는 동물의 규정식으로 포함될 수 있다. 사료 부가제는 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 조합하여 mL 또는 g 당 100 내지 500,000 단위의 베타 만난아제를 포함하는 적어도 하나 이상의 사료-등급 베타 만난아제를 포함할 수 있다.
iv) 혼합제 - 사료물질에 활성 성분의 합체는 일반적으로 활성 성분의 프리믹스를 제조하고, 이 프리믹스를 비타민 및 광물과 혼합하고, 그런 다음 사료에 프리믹스 또는 사료 부가제를 부가함에 의해 달성된다. 베타 만난아제는 이 분야에서 알려진 다른 활성 성분, 예를 들어 여기에 한정되는 것은 아니지만, 셀룰라제, 자일란나제, 글루카나제, 아밀라제, 에스테라제를 포함하는 다른 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics) 및 프로바이오틱(probiotics)과 혼합될 수 있다. 베타 만난아제 단독 또는 다른 활성 성분과의 조합하여 포함하는 활성성분은 영양소와 혼합되어 미리 혼합된 보충물을 제공한다. 영양소는 비타민, 광물과 같은 미세영양소와 거대영양소 양자를 포함한다. 프리믹스는 그런 다음 사료물질에 부가될 수 있다.
v) 사료 조성물 - 베타 만난아제는 베타 만난아제로 처리된 마초 또는 낱알 사료를 포함하는 사료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 베타 만난아제는 건조된 형태로, 예를 들어 분말로 또는 예를 들어 침적 또는 스프레이와 같이 사용되는 액체로 마초 또는 낱알 사료와 혼합될 수 있다.
이들 제제는 다른 단백질이나 화학적인 제제의 부가를 통해 안정화될 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제, 및 부형제가 또한 이 제형에 합체될 수 있다. 동물이 충분한 양을 소비하는 것을 확실히 하기 위해, 동물에 입맛에 맞는 형태로 베타 만난아제를 제공하기 위해 풍미제가 부가될 수 있다.
본 발명의 베타 만난아제를 함유한 반추동물용 사료효소제는 다양한 방법으로 투여될 수 있으나, 동물의 사료로 경구투여가 바람직하다. 베타 만난아제의 첨가량은 이 기술 분야에서 당업자에게 잘 알려진 많은 요인, 예를 들어 동물의 타입, 연령 및 중량에 의존한다. 베타 만난아제는 동물에 일일 기준으로 투여될 수 있다.
본 발명의 사료효소제는 만난의 함량이 높은 팜박, 야자박, 대두피, 대두박, 코프라박, 비트펄프, 및 이들의 혼합물 중 선택된 원료를 10 중량% 이상 포함하는 사료에 적용가능하다. 만난은 팜박에 30~35%, 야자박에 25~30% 정도가 함유되어 있으며 동물의 소화 효소로 분해되지 않는 사료원으로써 본 발명의 베타 만난아제를 통해 만난의 이용성 증대를 기대할 수 있다.
본 발명은 또한, 상술한 사료효소제를 적용한 반추동물의 생육방법을 제공한다. 일 예에서 반추동물에 적합하고, 만난의 함량이 높은 팜박, 야자박, 대두박, 코프라박, 및 이들의 혼합물 중 선택된 원료를 포함하는 만난-고함량의 사료를 공급하는 단계 및 상기 만난-고함량의 사료에 상기 반추동물용 사료효소제를 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<한국재래산양에 대한 동물실험의 재료 및 방법>
1-1. 공시동물 및 급여사료
실험은 충남대학교 축산학과 연구센터에서 진행되었고 여기에 사용된 공시동물과 연구방법은 충남대 동물윤리위원회의 검토 후 승인되었다 (CNU-00179).
라틴스퀘어 방식의 3X3 반복 방법이 사용되었고 각 처리구는 3주간 실시되었다. 총 12마리의 한국재래 산양이 이용되었고 ( capra hircus coreanae , 12.77 ± 1.9kg) 충남대학교 연구소에서 무작위로 세그룹으로 나뉘어 대사틀에 넣어졌다. 처리구는 다음과 같고 효소는 농후사료에 미리 혼합되어 급여되었다. 1 ) 대조구 ; β-mannanase 무첨가, 2) 처리구 1; 0.1% β- mannanase 첨가, 3) 처리구 2; 0.3% β-mannanase 첨가. 만난아제는 상업용으로 판매되는 씨티씨자임 ( 씨티씨바이오 , 서울), β- mannanase (800,000 units/kg)을 사용하였다. 급여된 사료는 40% 톨페스큐와 NRC 사양표준 ( 2007)에 근거한 60%의 농후사료로 구성되었다 (표 1). 사료는 하루에 두 번 아침 8시와 오후 5시에 급여하였고 전급여에서 10%의 잔량이 남아 있을 정도로 그 양을 맞추었다. 음수량은 전 시험 기간을 통틀어 제한하지 않고 자유 음수 시켰다. 사료섭취량은 사료급여량 및 잔량을 측정함으로써 산출되었다.
1.2. 샘플채취 및 화학적 분석
체중은 매주 아침급여 전에 측정하였다. 급여 사료 및 잔량 사료들은 각 단계별로 채취되어 섭씨 영하 20도에 보관하여 분석용으로 이용되었다. 분뇨 샘플은 적응 기간인 16일이 지난 후 각 시험 단계별 마지막 5일 동안 채취되었다. 총 분뇨량도 공시동물로부터 아침 급여 전 각각 채취된 후 중량을 측정하였다. 소변은 2.8% HCl이 200ml담긴 유리용기에 채취된 후 섭씨 영하 20도에 보관하였다 ( AOAC 2007). 채취된 분, 사료, 잔량사료는 섭씨 60도에서 96시간 동안 건조시킨 후 cyclone mill ( Foss , Hiller , Denmark)로 분쇄한 후 1mm 채에 통과시켜 화학적 성분 분석에 이용하였다. 사료, 분, 잔량내 건물 (DM;#7.007), 조단백질 (CP;#7.015), 조지방 ( EE ;#7.061), 조회분 (#7.009) 성분 분석은 AOAC (2007) 방법에 근거하여 실시하였다. 중성세제불용성섬유소는 Van Soest 등 ( 1991)에 의한 방법을 이용하여 열에 안정한 전분분해효소를 이용하여 측정하였고 잔류 회분을 포함하였다.
1.3. 통계분석
분석되어 나온 수치들은 SAS사의 PROC MIXED를 (SAS Institute Inc., Carey, NC, U.S.A .) 이용하여 통계처리 되었고 공시동물들에게는 무작위 효과를 주었다 . LSM (Least Square Means)의 Pair-wise 비교법이 PDIFF를 옵션으로 하여 수행되었고 Tukey -Kramer 보정 과정을 거치었다. 유의성은 P < 0.05, 그리고 경향은 0.05 P < 0.1 구간에서 적용하였다. 표 1은 시험 사료의 원료 및 성분 조성 (g/kg, 건물기준)을 나타낸다.
항목 건물 g/kg
톨훼스큐 400
옥수수 144
대두박 30
팜박 180
대두피 143
옥수수글루텐박 90
석회석 11
광물질 1
비타민 믹스* 1
성분 조성
처리구** 대조구 처리구1 처리구2
건물 915.0 912.6 911.5
조단백질 118.7 120.5 123.0
조지방 22.0 20.0 21.0
중성세제불용성섬유소 586.0 600.0 610.0
회분 53.0 54.0 53.0
* 비타민 믹스: Vitamin C; 10,000 IU/kg, Vitamin B; 30,000 IU/kg.
** 대조구, 처리구1, 처리구2는 농후사료에 포함된 만난아제 함량이 각각 0%, 0.1%, 0.3% 임
[실험예 1] 씨티씨자임의 처리가 산양에 있어서 성장률 및 소화율에 미치는 영향
농후사료내 베타 만난아제 함량이 건물기준으로 kg당 114g이 되도록 배합비를 작성하였다. 이 만난아제 함량은 통상적으로 급여하는 사료내 만난 함량에 비해서 상대적으로 높은 함량이다.
실험 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이 사료내 베타 만난아제 함량의 차이가 건물섭취량에 영향을 주지는 못하였다. 그러나 만난아제를 처리한 구에서 대조구에 비해서 일당증체량 (ADG)이 유의적으로 증가하였고 사료효율 (FCR)도 낮게 나타났다 (P<0.05, 표 2). 일당증체량은 만난아제를 첨가한 구에서 첨가량이 높아질수록 증가하는 경향 (P<0.10)을 보였다. 그러나 건물소화율은 처리구보다 대조구인 효소 무첨가구에서 더 높게 (P<0.05) 나타났다. 처리구간에 중성세제불용성섬유소 및 조단백질의 소화율간에는 차이가 없었다.
이 연구결과에 의하면 한국재래산양에서 만난함량이 높은 사료를 급여할 경우 만난아제의 첨가가 사료섭취량에는 영향을 주지 않으면서 일당증체량을 증가시키는 결과를 보여주었고 이는 사료효율이 향상되었음을 시사해 준다. 건물소화율에 있어서 대조구가 유의적인(P<0.05) 높은 수치를 나타냈지만 증체량에서는 만난아제를 첨가한 구에 오히려 뒤지는 것은 증체량을 높이는데 있어서 영양소 소화율이 아무런 영향을 미치지 못하였음을 나타낸다.
처리구* SEM P-값
대조구 처리구1 처리구2 평균 Linear
건물섭취량 g/d 557.8 555.6 602.9 30.93 0.25 0.12
일당증체량 g/d 82.3 116.8 114.6 11.61 <0.05 <0.10
사료효율** 7.8 5.5 5.7 0.69 <0.05 0.11
소화율, %
건물 67.7 66.2 66.5 0.54 <0.05 0.11
조단백 66.3 65.9 66.5 0.82 0.86 0.75
조지방 86.9 84.8 86.0 0.95 0.08 0.65
회분 42.8 40.3 39.8 1.11 0.07 <0.05
중성섬유 59.5 60.7 60.8 1.11 0.60 0.41
* 대조구 , 처리구1 , 처리구2는 농후사료에 포함된 만난아제 함량이 각각 0%, 0.1%, 0.3% 임
** 사료효율 : 공시동물이 1kg 증체하는데 필요한 사료의 양(kg)
만난아제의 첨가량이 처리구1과 처리구2에서 각각 건물 kg당 400 과 1200 U/kg이었다. 실험결과를 놓고 볼 때 만난아제의 첨가량이 처리구1인 400 U/kg이 소형 반추동물의 증체율과 사료효율을 증진시키는데 충분한 수준인 것을 알 수 있다. 단위동물에 있어서도 만난아제를 첨가한 여러 사양시험의 결과를 놓고 볼 때도 성장율, 영양소 소화율/이용율에 있어서 400U/kg의 첨가량이 무첨가나 낮은 에너지사료에 있어서 향상되는 것을 알 수 있다 (Yoon 등, 2010; Kim 등, 2013).
작용기전은 Jackson 등 (1999)에 의하면 인슐린 분비량이 증가하여 에너지와 단백질 대사가 증가되어 나타나는 것으로 추측하였다. 베타-갈락토만난 함량이 증가할수록 돼지에 있어서 인슐린의 분비가 저해됨을 보고한 연구도 있고 (Leeds 등, 1980), 글루코스 흡수와 insulintrophic polypeptide, IGF-1 (Insulin like Growth Factor) 분비량도 사료내 베타만난의 함량이 증가할수록 감소하는 결과를 나타냈다 (Nunes and Malmlof, 1992). 이러한 베타만난의 부정적인 영향은 만난아제를 첨가함으로서 예방할 수 있다. Yoon 등 (2010)에 의하면 만난아제의 첨가가 육성-비육돈에 있어서 무첨가구에 비해 혈중 글루코스농도를 증가시킴을 보고하였다. 육성돈의 경우 Kim등 (2013)이 보고한 연구에 의하면 저에너지 또는 만난아제 무첨가구에 비해서 만난아제 첨가구가 혈중 글루코스 농도를 고에너지사료와 (만난아제 무첨가) 비슷하게 상승시킨 것으로 나타났다.
Pettey 등 (2002)은 돼지에 있어서 IGF-1 의 농도가 만난아제를 첨가한 구에서 더 증가함을 보고하였다. 또한 육성-비육돈에 있어서는 영양소 소화율이 처리구간 차이가 없었으나 만난아제를 급여한 구에서 일당증체량 및 사료효율이 무첨가구에 비해서 향상됨을 보고함으로써 향상된 증체량이 영양소 소화율과는 무관함을 나타내었다.
본 실험에서 얻어진 소화율과 일당증체량 결과도 Pettey 등이 보고한 바와 일맥 상통한다. 만난아제 첨가구(처리구 1, 2)에서 현격하게 증가된 일당증체량과 사료효율이 무첨가구(대조구)와 비교할 때 건물섭취량과 건물소화율이 크게 다르지 않았음에도 그 증가폭이 뛰어났던 것은 흡수된 영양소들의 효율성이 높아져서 가축생산성과 관련된 지표들이 향상되었다는 것을 의미한다. 또한 인슐린, IGF-1 등의 분비량이 늘어남과 동시에 장내 건강 증진을 통하여 면역체계 가동에 필요한 에너지/단백질 및 중요 영양소들이 효율적으로 절약됨으로써 이러한 생산성의 향상이 이루어질 수 있었다고 해석할 수 있다.
또 하나의 중요한 이점의 하나로는 만난아제가 장내 소화물의 점도를 낮추어 Dale 등(1997)이 보고한 바처럼 장내 점막세포에 존재하는 수용체가 원활히 작용을 해서 영양소의 체내 흡수율이 증가한다는 것이다. 더욱이 Ikegami emdc(1990)에 의하면 베타만난이 장내 점도를 증가시켜 소화기관의 비대증을 유발하고 췌장액 분비를 촉진시킨다는 연구 결과도 발표하였다. Lee 등 (2003)에 의하면 Guar를 첨가한 사료에 만난아제를 사용할 경우 장내 점도가 낮아져서 일당증체량 및 사료효율이 증가됨을 보고하였다.
본 연구에 있어서 공시동물들은 만난아제를 첨가한 경우 mannan-oligosaccharides (MOS)를 생성함으로써 여러 단위동물 시험에서 나타났듯이 장내 건강이 증진되는 효과도 있었을 것으로 추측된다. 하지만 위에 열거한 추측되는 작용기전이 대부분 단위동물 실험에 근거한 것이라서 만난아제 관련된 연구가 전무한 반추동물에서도 유사하리라고 현재 상황에서 단언할 수는 없다.
[실험예 2] 씨티씨자임의 처리가 산양에 있어서 질소이용율에 미치는 영향
질소섭취량과 축적율은 표 3에서와 같이 만난아제의 첨가량이 증가할수록 향상되었다 (P<0.05). 분내 질소량과 생물학적값 또한 사료내 만난아제의 함량이 증가할수록 향상되는 경향을 보였다 (P <0.10). 만난아제를 첨가한 구에서 질소섭취량이 증가한 관계로 분내 질소배출량이 정비례로 증가하는 경향을(P = 0.07) 보였다. Castillot 등은 (2000) 90개의 학회지에 발표된 논문들을 바탕으로 양적분석한 결과 질소섭취량이 증가할수록 분내 질소 배출량이 증가하는 상관 관계가 있음을 밝힌 바 있다. 그러나 처리구간에는 질소배출량에 차이가 없었다. 이러한 결과와 더불어 생물학적값이 증가하는 경향은 만난아제의 첨가가 재래종산양에 있어서 흡수된 질소의 이용율을 증가시킨다는 것을 시사해 준다.
질소이용율 처리구* SEM P-값
대조구 처리구1 처리구2 평균 Linear
질소섭취량, g/d 11.2 11.3 12.5 0.63 0.12 <0.05
분내질소량, g/d 3.7 3.9 4.2 0.22 0.19 0.07
소변내질소량, g/d 2.8 2.9 2.7 0.20 0.70 0.65
질소배출량, g/d 6.5 6.8 6.9 0.35 0.65 0.42
질소축적율, g** 4.7 4.5 5.6 0.39 <0.05 <0.05
생물학적값*** 61.4 61.0 67.4 2.44 0.15 <0.10
* 대조구 , 처리구1 , 처리구2는 각각 만난아제가 0%, 0.1%, 0.3% 농후사료에 각각 첨가됨
**질소축적율 : 질소섭취량 (분내질소량 + 소변내질소량)
***생물학적값 : 질소축적율 / (질소섭취량 분내질소량) * 100
<한우 미경산 육성우에 대한 동물실험의 재료 및 방법>
1-1. 실험방법
한우 미경산 육성우(체중: 236.2 kg ± 1.1kg, 11개월령) 40두를 공시하였다. 공시 동물은 적응기를 통해 안정된 상태로 실험을 개시하였고, 4개의 실험구(2×2 요소 실험; 요소 1: 곡류-대두박 위주 또는 HMCF 위주 배합사료, 요소 2: CTCZYME 무첨가 또는 배합사료 내 0.1% 첨가)에 40두의 공시동물을 임의로 배치하여 총 3달간 사양 실험을 실시하였다. CNU_CNM (Chungnam National University Cattle Nutrition Model)에 따라 에너지와 단백질 함량이 동일한 TMR(라이그라스 25%, 배합사료 75%)을 일당증체량이 850 g이 되도록 배합하였다. 처리구는 곡류-대두박 위주 배합사료(Grain-Soy)에 대해 CTCZYME 무첨가군 또는 0.1% 첨가군, HMCF 위주 배합사료(HMCF)에 대해 CTCZYME 무첨가군 또는 0.1% 첨가군으로 하였다. 배합된 TMR을 1일 2회(08:00, 17:00) 급여하여 자유 채식시켰다.
1-2. 분석방법
각 공시동물의 일일 사료 섭취량을 측정하고, 실험 개시 1일 전부터 시작하여 4주 간격을 두고 체중을 측정하고, 이를 토대로 건물섭취량, 성장률, 사료요구율을 조사하였다. 사료의 영양소 분석은 AOAC(2011)에 따라 건물(934.01), 조회분(942.05), 조지방(920.39), 조단백(2001.11)을 분석하고, Van Soest 등(1991)에 따라 NDF(aNDF)와 ADF를 분석하였다. 각 처리구 별 배합비 및 영양소 성분은 하기 표 4에 나타나 있다. 통계분석은 SAS package (SAS Institute, Cary, NC)의 PROC MIXED를 이용하여 항목별 처리간 평균을 분산분석하고, Contrast를 이용하여 요소간 차이 및 상호작용의 유의성을 평가하였고, 성장률 분석은 Repeated measure option을 이용하여 월령에 따른 처리간 체중 변화의 차이를 비교하였다. 표 4는 배합사료의 배합비 및 영양 성분를 나타낸다.
성분 (% DM) Grain-Soy 만난고함량사료(HMCF)
대조군 1 실험군 1 (CTCZYME 0.1) 대조군 2 실험군 2 (CTCZYME 0.1)
독보리(Rye grass) 25.0 25.0 25.0 25.0
옥수수 27.6 27.6 15.0 14.9
밀 9.7 9.7 3.7 3.7
밀가루(Wheat mill) 3.7 3.7 3.7 3.7
쌀겨 2.3 2.3 4.5 4.5
콩가루 2.5 2.5 - -
대두창(Soy hulls) 2.5 2.5 11.0 11.0
옥수수글루텐피드 11.7 11.7 11.6 11.6
평지씨박 2.3 2.3 1.3 1.3
팜유 - - 1.7 1.7
파암핵유 2.4 2.4 7.8 7.8
CMS - - 0.3 0.3
야자박 2.3 2.3 7.6 7.6
주정박 2.3 2.3 0.6 0.6
석회석 2.9 2.9 2.9 2.9
미네랄믹스 0.1 0.1 0.1 0.1
비타민믹스 0.1 0.1 0.1 0.1
염화암모늄(NH4Cl) 0.4 0.4 0.4 0.4
소금 0.7 0.7 0.8 0.8
당밀 1.6 1.6 2.0 2.0
CTCZyme - 0.1 - 0.1
화학조성, % DM or as stated
DM, % as fed 88.9 88.9 89.5 89.5
CP 14.0 14.0 13.8 13.8
EE 3.0 3.0 5.3 5.3
Ash 8.4 8.3 9.4 9.4
NDF 33.2 33.2 42.4 42.4
Lignin, % NDF 5.8 5.8 5.4 5.4
ME, Mcal/kg DM 2.7 2.7 2.6 2.6
NEM, Mcal/kg DM 1.8 1.8 1.7 1.7
NEg, Mcal/kg DM 1.2 1.2 1.1 1.1
[실험예 3] 한우 미경산 육성우의 CTCZYME 처리구별 효과
처리구별 개시체중, 종료체중, 일당증체량, 일일 건물섭취량, 사료요구율 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 표 5를 참조하면, 사료의 종류(곡류-대두박 또는 HMCF 위주 사료)와 CTCZYME의 첨가 간의 유의적 상호작용은 보이지 않았고, 처리구간 일일 건물섭취량에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 3개월간의 사양 실험 결과 일당증체량에서 곡류-대두박 위주 사료의 급여(943 g/일)가 HMCF 위주 사료이 급여(854 g/일)에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다(+89 g/일).
일당증체량에서 배합사료 내 0.1%의 CTCZYME 첨가에 의해 곡류-대두박 위주 사료(실험군 1)에서는 111 g/일, HMCF 위주 사료에서(실험군 2)는 80 g/일의 추가 증체를 보여 배합사료 내 CTCZYME의 0.1% 첨가는 한우 미경산 육성우의 일당증체량을 평균 95 g 높이는 것으로 나타났다. 또한 사료요구율에 있어 사료 종류에 따른 유의적 차이는 없었으나 CTCZYME의 첨가가 사료요구율을 평균 1.3 감소시키는 경향을 보였다(P=0.06).
특히 HMCF 위주 사료에서 CTCZYME의 첨가는 사료요구율을 1.8 감소시킨 것으로 나타났다. 즉 HMCF 위주 사료에서 CTCZYME의 첨가가 1kg의 증체에 필요한 사료 건물의 양을 1.8 kg 감소시켰다. 사양 실험 기간(총 3개월간)의 동물 별 체중변화는 도 1에 나타나 바와 같다. 즉, 처리구간 월별 체중 변화에서 유의적인 차이를 보였으며(P<0.05), 특히 곡류-대두박 위주 사료에 CTCZYME을 첨가한 처리구(실험군 1)는 HMCF 위주 사료에 CTCZYME을 첨가하지 않은 처리구(대조군 2)에 비해 월 평균 6 kg의 높은 증체율을 보였다.
항목 Grain-Soy 만난고함량사료 SEM P-value
대조군1 실험군 1 대조군 2 실험군 2 Feed CTCZYME Feed CTCZYME
Initial BW (kg) 237 239 236 233 10.3 0.61 0.98 0.75
Final BW (kg) 314 326 307 308 11.2 0.12 0.37 0.51
ADG (g/day) 888 998 814 894 60.5 0.05 0.03 0.72
DMI (kg/day) 7.0 7.5 7.2 6.8 0.42 0.37 0.93 0.12
FCR** 9.1 8.2 9.9 8.1 0.96 0.61 0.06 0.50
* Supplementation of 0.1% CTCZyme in concentrate mix
** Feed conversion ratio: DMI (kg) / ADG (kg)
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (10)

12 주령 이상의 반추위가 발달한 반추동물 성축용 사료에 배합되거나 반추동물 성축에 직접 투여되고, 베타 만난아제(β-mannanase)를 포함하는 조성물인, 반추동물용 사료효소제.
제1항에 있어서,
상기 베타 만난아제는 엔도 베타 만난아제(endo--mannanase)인 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제1항에 있어서,
상기 베타 만난아제는 만난아제를 생산하는 미생물 또는 만난아제 유전자가 형질도입된 형질전환체로부터 얻는 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제3항에 있어서,
상기 베타 만난아제는 하기 a) 내지 f) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제:
a) 기탁번호 KCTC 0800BP로 기탁된 바실러스 속 WL-1 (Bacillus sp. WL-1) 균주로부터 생산된 만난아제;
b) 기탁번호 KCTC 10279BP 로 기탁된 바실러스 속 WL-7 (Bacillus sp. WL-7) 균주로부터 생산된 만난아제;
c) 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제 유전자를 도입하여 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산된 만난아제; 및
d) 기탁번호 KCTC 11105BP 로 기탁된 아스퍼질러스 오리재로부터 생산된 만난아제;
e) 기탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산된 만난아제;
f) 상기 a) 내지 e) 중 선택된 만난아제의 혼합물.
제4항에 있어서,
상기 베타 만난아제는 KCl, NaCl 또는 이들의 혼합물을 용해시켜 동결건조한 수용성 만난아제 조성물인 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제5항에 있어서,
상기 만난아제는 바실러스균주 배양액에서 균체를 제거한 후 농축한 만난아제 농축액인 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제1항 또는 제4항에 있어서,
박테리오파지를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제7항에 있어서,
상기 박테리오파지는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium), S. 엔테리티디스(S. enteritidis), S. 두블린(S. dublin), S. 더비(S. derby), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli) k99 및 f41, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) type A and C 중 선택된 균을 타깃으로 하는 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제1항에 있어서,
상기 반추동물은 성축으로서 한국재래산양 또는 한우 미경산 육성우인 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
제1항에 있어서,
상기 사료는 만난의 함량이 높은 팜박, 야자박, 대두피, 대두박, 코프라박, 비트펄프, 및 이들의 혼합물 중 선택된 원료를 10 중량% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 반추동물용 사료효소제.
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