KR20110115905A - 신규한 베타-아가라제 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한천분해능을 갖는 사카로파구스 속(Saccharophgus sp) 균주 유래 베타-아가라제 및 상기 베타-아가라제 유전자를 이용하여 제조한 재조합 생촉매에 관한 것으로서, 본 발명은 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 분해하여 네오아가로비오스를 생성할 수 있는 신규한 베타-아가라제 또는 상기 베타-아가라제 유전자를 제공함으로써 베타-아가라제가 응용되는 다양한 산업분야 특히, 네오아가로비오스가 이용되는 화장품, 의약, 생명공학 및 기능성 식품과 관련된 산업분야에 널리 이용될 수 있다.

Description

신규한 베타-아가라제 및 그 용도{A BETA-AGARASE AND A USE OF THE SAME}

본 발명은 베타-아가라제 및 상기 베타-아가라제를 이용하여 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

한천(agar)은 홍조류의 세포벽 구성성분인 점질성의 난소화성 복합다당류로서, 일종의 식이섬유원이다. 보다 상세하게는, 한천은 갈락토스(galactose)와 갈락토피라노스(galactopyranose)로 구성된 중합체로, 알파-1,3 결합과 베타-1,4 결합으로 이루어진 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaroection)으로 구성된 복합다당류(complex polylsaccharide)이다. 상기 아가로스와 아가로펙틴의 구성비와 관련하여, 한천은 주로 아가로스 70%와 아가로펙틴 30%으로 구성되어 있는 것으로 보고되고 있다.

한천은 소화 효소에 의해 분해되기 어려운 다당류이므로 일반적으로 영양원으로 제공되지는 아니하였으나, 오래 전부터 젤리 등의 원료 등 식품산업에 사용되었고, 건강에 대한 관심의 고조와 함께 다이어트 식품으로도 이용되고 있다. 또한, 한천은 미생물 고체 배지와 실험실 시약 등 분자생물학 실험의 중요 재료로 이용되고 있으며, 제육가공에서는 안정제로, 화장품이나 음식물에서는 겔화제로 사용되며, 치과인상(dental impression) 재료, 사진에멀젼의 콜로이드 방지제로 이용되고, 제약분야에서도 사용되는 등 매우 다양한 산업 분야에서 사용되고 있다.

한편, 한천은 산이나 효소, 구체적으로 알파-아가라제(a-agarase)와 베타-아가라제(b-agarase)에 의해 가수분해될 수 있다. 상기 산 또는 효소에 의해 가수분해되는 한천 가수분해물 중, 베타-아가라제(b-agarase)에 의해 가수분해된 가수분해물인 네오한천올리고당 즉, 네오아가로올리고사카라이드(neoagarooligosaccharides)는 생체에 다양한 기능성을 나타낼 수 있는 것으로 확인되어, 기능성 식품 또는 의약 분야에서 네오한천올리고당에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다. 일 예로, 상기 네오한천올리고당은 전분의 분해를 지연시키고 박테리아의 성장을 억제시키며, 미백효과를 유도할 수 있는 것으로 보고되어 있다.

상기 베타-아가라제는 아가로스의 갈락토스 중합체 중 베타-1,4 결합을 절단할 수 있으며, 상기 베타-1,4 결합에 의해 분해되서 생성된 분해산물을 네오아가로올리고사카라이드(neoagarooligosaccharide)라고 한다. 상기한 바와 같이, 네오아가로올리고사카라이드는 항균작용 및 항산화작용 등의 다양한 생리 활성을 갖지고 있으며, 특히 2당인 네오아가로비오스(neoagarobiose)는 피부미백에 뛰어난 효과를 가진다고 보고되어 있다. 따라서, 네오아가로비오스는 화장품, 제약, 기능성 식품 등 다양한 산업에 적용이 가능하다.

상기 베타-아가라제는 크게 두 가지로 구분되는데, 4당인 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 주로 생성하는 베타-아가라제 I(β-agarase I)과 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 분해하여 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 주로 생성하는 베타-아가라제 II(β-agarase II)가 있다.

통상적으로 베타-아가라제의 경우 주로 한천을 네오아가로테트라오스 또는 네아아가로헥사오스로 분해하는 베타-아가라제 I에 해당된다. 따라서, 네오아가로올리고사카라이드 중에서도 기능성이 우수한 것으로 보고된 네오아가로비오스를 생성할 수 있는 베타-아가라제 II에 해당하는 효소에 대한 개발의 요구가 증대되고 있는 실정이다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 네오아가로비오스를 생성할 수 있는 베타-아가라제 II에 해당하는 베타-아가라제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 베타-아가라제 활성을 가지고, 특히 한천을 분해하여 네오아가로비오스를 생성할 수 있는 베타-아가라제를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 베타-아가라제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 네오아가로비오스를 생성할 수 있는 효소를 찾기 위해, 제주 연안 해수로부터 분리된 미생물의 유전자를 탐색하던 중, 본 발명의 발명자들이 제주 연안 해수로부터 분리된 Saccharophagus sp 균주로부터 탐색된 베타-아가라제가 네오아가로비오스를 생성할 수 있는 베타-아가라제 II에 해당한다는 것으로 확인하였고, 상기 확인된 Saccharophagus sp 균주로부터 탐색된 베타-아가라제의 유전자를 탐색하여 재조합 베타-아가라제를 제조하고, 이를 이용하여 피부 미백 활성을 나타내는 네오아가로비오스를 생성함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 한천이란 홍조류의 세포벽 구성성분인 점질성의 난소화성 복합다당류로서, 일종의 식이섬유원이다. 한천은 주로 미생물 고체 배지로 사용되며, 제과, 제육가공에서는 안정제로, 화장품이나 음식물에서는 겔화제로, 건강식품, 제약, 치과인상(dental impression)재료, 실험실 시약과 사진에멀젼의 콜로이드 방지제로 사용되고 있다. 상기 한천은 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되며, 주로 약 70%의 아가로스와 약 30%의 아가로펙틴으로 구성되어 있다.

본 발명에 있어서, 아가라제(agarase)란 아가로즈를 분해하는 효소를 의미한다. 상기 아가라제는 아가라제의 분해 패턴에 따라 두 그룹 즉, 아가로스의 알파-1,4 결합을 분해하는 알파-아가라제와 아가로스의 베타-1,4 결합을 분해하는 베타-아가라제(beta-agarase)로 나눌 수 있다. 상기 베타-아가라제는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 주로 생성하는 베타-아가라제 I(β-agarase I)과 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 주로 생성하는 베타-아가라제 II(β-agarase II)가 있다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 세포, 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp), 더더욱 바람직하게는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) AG21 균주 유래 아가라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양배지를 의미하며, 상기 배양배지는 배양된 미생물을 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서, 무세포(cell-free) 배양액이란 세포 또는 미생물을 배양한 배양배지에서 배양된 미생물을 제거한 것을 의미한다. 상기 배양배지는 동물세포나 식물세포 또는 세균 등을 포함하는 미생물을 배양하는데 필요한 영양소가 포함되어 있는 고체 조성물 또는 액체 조성물을 의미하며, 바람직하게는 액체 조성물일 수 있다. 본 발명에 있어서 농축액이란, 상기 배양물 또는 무세포 배양액을 농축한 것을 의미한다.

상기 베타-아가라제는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) AG21 균주에서 PCR 기법을 이용하여 클로닝된 것이고, 상기 클로닝된 베타-아가라제는 총 2265 bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 754개의 아미노산으로 번역되며, 약 130kDa의 크기를 갖는다.

또한, 상기 베타-아가라제는 한천 분해 활성을 통하여 한천을 네오아가로비오스가 주산물인 네오아가로올리고사카라이드를 생산할 수 있다.

본 발명의 효소인 상기 베타-아가라제는 피부 미백 효과 등의 생리활성이 우수한 것으로 알려진 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 주성분으로 하는 네오아가로올리고사카라이드를 생산할 수 있으므로, 값싼 한천으로부터 고가의 네오아가로올리고사카라이드를 생산할 수 있어, 그 경제적 효과가 매우 크다 할 것이다.

본 발명의 한천분해효소는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제이다. 상기 베타-아가라제는 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제 유래 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클로오타이드는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다.

또한, 본 발명은 한천분해 활성을 갖는 생촉매에 관한 것이다. 상기 생촉매는 상기 각각의 뉴클레오타이드 서열, 구체적으로 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 각각의 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 각각의 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 각각의 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매일 수 있다.

상기 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 신호서열을 더욱 포함하는 서열이다.

상기 베타-아가라제는 서열번호 2 또는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 아미노산을 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드를 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 효소 생촉매 개발을 위한 분리 및 정제 과정에 의한 비용의 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 상기 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 베타-아가라제 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 상기 벡터의 제조 및 형질전환체의 제조는 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조된다.

상기 발현벡터는 사용하는 숙주에 따라 적절히 선택할 수 있고, 형질전환체에서 단백질을 발현시킬 수 있는 통상의 발현벡터가 모두 적용 가능하며, 일 예로 상기 형질전환체에 의해 발현된 단백질을 정제할 수 있는 융합 파트너(fusion-tag)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터일 수 있다. 구체적으로는, 대장균의 경우에는 도입된 외래 유전자를 형질전환체에서 수용성 형태로 고효율로 발현시킬 수 있는 pMAL-c2x, pET 11a, pET 16b, pET 21a(Novagen Co., Germany), pGEX 4T-1(GE Healthcare, USA) 또는 pHCE 19(BioLeaders Co., 대한민국)일 수 있고, 바람직하게는 pMAL-c2x, pET 11a 또는 pET 16b 일 수 있으며, 효모의 경우에는 갈락토스를 암호화하는 유전자인 GAL1의 프로모터를 외래 유전자의 발현에 이용할 수 있는 pYES2(Invitrogen Co., USA) 등을 사용할 수 있다.

상기 형질전환체는 상기 발현벡터를 이용하여 제조한 것으로 상기 형질전환체의 제조에 사용되는 숙주는 대장균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주와 같은 원핵세포 또는 효모, 곰팡이 등의 진핵세포 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 발현벡터는 pMAL-c2x 벡터에 서열번호 2의 베타-아가라제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 삽입시킨 것이고, 상기 숙주는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 일 예로 E. coli DH5α 또는 E. coli BL21(DE3) 일 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 베타-아가라제를 생산하는 방법은 상기 형질전환체를 배양배지를 이용하여 배양하고, 상기 배양배지에 포함된 베타-아가라제 또는 상기 형질전환체 내에 존재하는 베타-아가라제를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 배양배지, 배양조건 및 배양방법은 형질전환체의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 서열번호 4의 베타-아가라제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 pMAL-c2x에 삽입시켜 제조한 재조합 벡터를 E.coli DH5α 에 도입시켜 제조한 형질전환체를 배양배지에서 배양하여 제조한 재조합 벡터를 E. coli DH5α 도입시켜 제조한 형질전환체를 배양배지에서 배양한 후에, IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가하고 배양하여 제조할 수 있다. 상기 형질전환체에 의해 발현되는 방법으로 제조된 재조합 베타-아가라제는 종래 알려진 통상의 방법으로 정제할 수 있지만, 정제하지 않고 전세포 또는 이의 배양물이나 이의 무세포 배양액 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제에 관한 발명이다.

상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균일 수 있고, 일 예로 E. coli BL21(DE3) 또는 E. coli DE5α일 수 있다. 상기 발현벡터는 pMAL-c2x, pET 11a 벡터 또는 pET 16b 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 네오아가로비오스 생성능 또는 한천 분해능을 갖는 생촉매에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 베타-아가라제, 상기 재조합 베타-아가라제 및 상기 생촉매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 함유하는 네오아가로비오스 생성용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 네오아가로올리고사카라이드 또는 한천에 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제, 상기 재조합 베타-아가라제, 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 반응시키는 단계를 포함하는 네오아가로올리고사카라이드 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의해서 생성된 네오아가로올리고사카라이드 특히, 네오아가로비오스를 주로 포함하는 네오아가로올리고사카라이드 또는 네오아가로비오스는 항균활성 및 미백효과 등 다양한 기능성을 가지고 있는 고부가가치 재료이며 의약품 및 기능성 식품과 같은 관련 산업 분야에 신소재로서 널리 활용될 수 있다.

본 발명의 베타-아가라제는 한천을 분해할 수 있을 뿐만 아니라, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 분해하여 기능성이 뛰어난 네오아가로비스를 제조할 수 있으므로, 한천을 원료로 하여 고부가가치 상품인 다양한 한천올리고당을 제조할 수 있어, 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업에 크게 기여할 것으로 예상되어, 그 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 아가라제의 핵산 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 아가라제의 핵산 염기서열 및 이에 대응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 윗줄이 염기서열이고, 아래줄이 아미노산 서열이며, 밑줄 친 부분이 신호서열이고, 오랜지색 상자에 포함된 부분이 Glycoside hydolase 42 family domain에 해당된다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효소를 발현시킨 결과물로, M은 단백질 Marker를 의미하고, 1은 정제된 재조합 베타-아가라제를 의미하며, 2는 10 Mm IPTG를 이용한 발현 유도 후 세포 분해 산물을 의미하고, 3은 발현유도하기 전의 세포 분해 산물을 의미한다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효소를 이용하여 한천을 분해시킨 분해산물의 전기영동 사진으로, D-gal은 D-갈락토스를 의미하고, NA2는 네오아가로비오스를 의미하고, NA4는 네오아가로테트라오스를 의미하며, NA6는 네오아가로헥사오스를 의미하고, 1 내지 3은 D-갈락토스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 전기영동한 결과이고, 4 내지 8은 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 구성된 네오아가로올리고사카라이드와 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 재조합 효소를 반응시킨 결과로, 4는 10분 동안 반응시킨 결과이고, 5는 20분 동안 반응시킨 결과이며, 6은 30분 동안 반응시킨 결과이고, 7은 60분 동안 반응시킨 결과이며, 8은 120분간 반응시킨 결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 한천분해효소 생산 미생물 탐색 및 분리

본 발명의 새로운 베타-아가라제를 클로닝하기 위하여, 제주연안의 해조류 지역을 중심으로 해조류, 해수 및 무척추 동물들을 채집하여 멸균 해수에 희석하는 방법으로 시료를 준비하였고, 그 원액을 100 ㎕씩 1차 선택배지(seawater agar 배지, SWA, 1.5% 한천/멸균해수)에 도말하여고, 30℃에서 4일간 배양하여 1차 스크리닝을 수행하여, 약 50종의 균주를 분리하였다. 상기 1차 스크리닝에서 한천분해활성을 나타내는 균주들을 다시 2차 선택배지(Marine agar, MA, Difco)에 도말하여 30℃에서 4일간 배양하였으며, 한천 분해 양상이 뛰어난 것으로 확인된 균주를 선별하였다.

< 실시예 2> 한천 분해 미생물의 유전학적 동정

한천분해능을 나타내는 상기 균주의 동정은 유전학적 동정법으로 수행하였다. 한천분해능을 나타내는 상기 균주로부터 genomic DNA를 추출하였으며, 하기 표 1의 프라이머쌍을 이용하여, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 16s rRNA 염기서열을 증폭하였고, 증폭된 산물을 PCR purification kit(bioneer, 대한민국)을 이용하여 정제하였으며, ㈜솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 상기 염기서열 분석결과 총 염기서열을 1384bp의 염기서열이 확인되었다. 상기 염기서열에 대해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Blast N program과 DNassist program을 이용하여 유사 염기서열을 분석한 결과, Saccharophagus degradans 2-40의 16s rRNA 서열과 99%(1376/1384)의 유사성을 나타내어 사카로파구스 속(Saccharophagus sp)으로 동정되었으며, 상기 균주를 사카로파구스 속 AG21로 명명하였다.

Primers	서열 (5′→3′)	서열번호
27F	AGAGTTTGATCCTGG CTCAG	5
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT	6

< 실시예 3> 사카로파구스 속 AG21 의 아가레이즈의 유전자 서열 분석

상기 사카로파구스 속 AG21 균주의 아가레이즈 부분 염기서열의 증폭을 위해, 상기 사카로파구스 속 AG21 균주와 가장 높은 유사도를 보인 Saccharophagus degradans 2-40의 아가라제 서열(NCBI Genbank accession No : CP000282) 서열을 이용하여, 하기 표 2의 프라이머를 제작하였으며, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하였다.

Primers	서열 (5′→3′)	서열번호
Agar-F	CGA TAA GCA GTT GGA TGT TAG	7
Agar-R	TTA CTC GCC AAA ACG TN	8

보다 상세하게는, 10X Ex Taq polymerase buffer 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, 서열번호 7의 정방향 프라이머 1 ㎕ 및 서열번호 8의 역방향 프라이머 1 ㎕, 상기 균주인 AG21의 genomic DNA 0.5㎍, Ex Taq DNA polymerase 0.25 ㎕를 혼합하고, nuclease free water를 첨가하여, 전체 반응액 50 ㎕를 제조하였으며, 반응조건은 94℃ 에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 4분 30초간 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 정제 후 pGEM easy T vector로 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 상기 분석결과를 도 1 및 서열번호 1에 기재하였다.

상기 분석결과를 바탕으로, 아가라제를 암호화하는 유전자의 5'말단의 서열을 확인하기 위하여, long and accurate(LA) PCR을 수행하였다.

보다 상세하게는, genomic DNA 5㎍에 10X BamH I buffer 5 ㎕ 및 각각의 제한 효소 EcoR I의 3 ㎕를 첨가하고 증류수로 전체 부피를 50 ㎕를 맞춘 후, 37℃에서 3시간 반응시켜 각각 절단하였다. 각각의 반응 산물에 3 M sodium acetate(pH 5.2) 5 ㎕를 첨가 후, 137.5 ㎕의 4℃ 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 60분 동안 방치한 후, 4℃ 및 13,000rpm의 조건에서 10분간 원심 분리한 후, 70% 에탄올을 처리하고 원심분리한 후 건조시킨 후에, 20%의 증류수로 희석시켰다. 상기 제한효소로 처리된 AG21의 genomic DNA에 EcoR I cassette(LA PCR kit, Takara)을 부착하기 위하여 절단된 genomic DNA 7.5 ㎕와 상기 EcoR I cassette 및 ligation mixture를 첨가하여 반응시켰다.

primer	sequence	서열번호
GPS1	TCG TAG CGG CGA ACT TAT ATG CCT	9
GPS2	GCC ATC AAG AGG TGT TGT TCG CAA	10
C1 primer	GTA CAT ATT GTC GTT AGA ACG CGT AAT ACG ACT TCA	11
C2 primer	CGT TAG AAC GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA	12

상기 cassete이 결합된 DNA를 이용하여 LA PCR을 수행하였다. 상기 LA PCR의 수행은 첫 번째 LA PCR과 두 번째 LA PCR로 수행하였다.

상기 LA PCR의 수행은 첫 번째 LA PCR과 두 번째 LA PCR로 수행하였다.

보다 상세하게는, 첫 번째 LA PCR은 각각의 cassette이 ligation된 DNA 1 ㎕를 증류수 33.5 ㎕에 희석하여 DNA solution을 만들어 이를 94℃에서 10분간 denaturation 시켰다. DNA solution에 10X LA buffer II (Mg^{2 +}plus)5㎕, dNT Pmixture (2.5mM) 8㎕, 상기 표 3의 primer C1 1㎕, 상기 표 3의 GSP1 1㎕와 LA taq DNA polymerase(Takara, 일본) 0.5 ㎕를 첨가하였다. 반응 조건은 94℃에서 1분 반응 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 4분 30초의 반응을 30회 반복하였고, 마지막으로 72°C에서 5 분간 반응을 수행하였다. PCR 반응 후 PCR product는 1 % agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.

두 번째 LA PCR은 첫 번째 LA PCR의 결과물을 10배 희석하고, 이를 주형으로 하여, 상기 표 3의 C2 primer 및 상기 표 3의 GSP2 primer를 첨가하여 LA PCR kit의 protocol에 따라 nested PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응 후, PCR product는 1 % agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.

상기 확인된 아가라제를 암호화하는 PCR 수행결과는 gel purification kit(Bioneet, Korea)을 이용하여 정제 하였다. 정제된 PCR product 3 ㎕, pGEM-T easy vector(Promega, USA) 1 ㎕에 ligation mix(Takara, 일본)을 첨가하여 4℃에서 12시간 반응 시켜 ligation하였고, ligation 산물 10 ㎕와 E. coli DH5α competent cell 100 ㎕와 혼합하여 얼음에 30분 방치하고 42℃에서 1분 30초간 heat shock을 주어 형질 전환을 하였고, 1 ml의 LB broth에서 배양 후 배양액 70 ㎕를 Selection plate (IPTG, X-gal, ampicillin첨가)에 도말하고, white colony를 선별하였다. 선별된 white colony를 ampicillin이 첨가된 LB broth에 innoculation하고 37℃에서 12시간 배양 후 plasmid mini extract kit(bioneer, 대한민국)를 이용하여 정제하고 염기서열 분석을 의뢰하였다.

염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 754개의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 2의 2265 bp의 아가레이즈 코딩서열을 확보하였다. 상기 염기서열은 도 1 및 도 2에 나타내었다.

상기 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 베타-아가라제는 pseudoalteromona atlantica T6c의 agarase와 61%의 상동성을 나타내었고, N말단에 23번 ala아미노산과 24번 ala사이에 신호서열 절단부위가 존재하였으며, Glycoside hydrolase 42 domain(490-657)을 포함하고 있었다.

< 실시예 4> 아가레이즈 유전자 클로닝 및 대장균에서의 단백질 발현 분석

Saccharophagus sp AG52 균주의 agarase 서열을 바탕으로 신호서열을 포함하지 않는 mature 아미노산 서열을 PCR증폭하였다. BamH I 제한효소 절단 부위 서열을 포함하는 표 4의 정방향 프라이머 08-283과 Xba I 제한 효소 절단 부위를 포함하는 역방향 프라이머 08-284를 제작하였다.

primer	sequence	서열번호
08-283	GAG AGA GGA TCC GAT AAA GAC GAG CCG CAA GCG ATA	13
08-284	GAG AGA TCT AGA TTA TTG CTC GCC AAA ACG TCG AC	14

500 ng의 genomic DNA를 주형으로 하여 20 pmole/㎕ 농도의 상기 표 4의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 각각 1 ㎕씩 첨가하고 2.5 mM의 dNTP 6 ㎕와 10X Ex Taq Buffer 5㎕, 0.25 ㎕ 의 Ex Taq DNA polymerase 3 Unit을 혼합하고 증류수를 이용하여 전체 반응액 50 ㎕를 제조하였으며, PCR은 94℃ 에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 72℃에서 2분간 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다.

상기 PCR을 통하여 증폭된 산물은 정제 후, pMAL-c2x 벡터와 함께 제한효소 BamH I과 Xba I으로 절단하였고, pMAL-c2x 벡터는 CIP(calf intestine phosphatase)를 처리하여, 5'의 인산기를 제거하였다. 각각 절단된 PCR산물과 pMAL-c2x벡터는 DNA ligation kit(Takara, Japan)를 사용하여 ligation하였고 이를 E. coli DH5α에 형질전환 하였다. 상기 아가레즈 유전자를 포함하는 pMAL-c2x벡터를 plasmid extraction kit을 이용하여 정제 한 후, 다시 발현세포인 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 세포를 ampicillin과 0.2 %의 glucose가 첨가된 5ml의 LB broth에 접종하고 37℃에서 진탕배양 후, 이를 100 ml의 동일한 배지에서 OD₆₀₀=0.6까지 배양 후에 IPTG를 최종농도 0.1 mM이 되도록 첨가하여 10℃에서 24시간 동안 발현을 유도하였다. 발현 단백질의 확인을 위해 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄 후 세포 내 단백질을 수집하여 SDS-PAGE로 단백질 발현을 확인하였으며, maltose binding protein과 fusion된 재조합 agarase는 pMAL Protein Fusion and Purification System (NEB, England)을 이용하여 정제하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 분석결과 형질전환 후에 특이적 밴드가 강하게 발현된 것을 확인 할 수 있었고, 정제 후에 강하게 발현된 특이적 단백질 밴드로부터 형질전환 여부를 확인할 수 있었다. 또한, 아미노산 서열 분석에 의하여 밝혀진 상기 아가레이즈의 분자량은 130 KDa의 단백질이 발현된 것을 확인 할 수 있었다.

< 실시예 5> 재조합 아가레이즈의 한천 분해 패턴 확인

상기 정제된 제조합 단백질의 한천 분해 패턴을 위하여 thin layer chromatography(TLC)를 수행하였다.

1%의 agarose를 10 mM Tris Cl buffer (pH 6.5)에서 녹이고, 기존에 보고된 베타-아가라제 I type의 아가라제(Microbulbifer sp.)를 이용하여 네오아가로테트라오스(4당) 및 네오아가로헥사오스(6당)으로 절단한 뒤, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스의 혼합 용액을 상기 실시예 3의 재조합 아가라제와 반응시켜 시간에 따른 분해 양상을 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 TLC의 용매는 n-buthanol, acetic acid 및 증류수를 2:1:1(n-buthanol : acetic acid : water)로 혼합한 혼합액을 사용하였고, 반응 산물은 2 ㎕씩 로딩(loading)하였다. 상기 플레이트는 Silica gel 60 plate를 사용하여 전개시켰고, 전개 시킨 후에 plate를 건조하였으며 10% 황산 용액을 분사 후, 이를 가열하여 당 분해 패턴을 확인 하였다.

상기 반응 후, 처음 10분에는 네오아가로테트라오스이 가장 진한 밴드를 나타내었지만 시간이 지날수록 네오아가로테트라오스 밴드는 옅어지고, 네오아가로비오스를 나타내는 밴드가 점차 진해지는 것을 확인 할 수 있었다. 그 결과 최종적으로 반응 후 120분 후에는 네오아가로테트라오스를 나타내는 밴드는 매우 희미해져 잘 보이지 않았고, 네오아가로비오스를 나타내는 밴드는 매우 진하게 나타남을 확인 하였다. 상기 결과에 의해 본 발명의 베타-아가라제는 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 분해하여 네오아가로비오스를 형성하는 베타-아가라제 II 타입의 베타 아가라제인 것을 확인 할 수 있었다.

<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A BETA-AGARASE AND A USE OF THE SAME <130> KP20100124 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2265 <212> DNA <213> b-agarase mature <220> <221> CDS <222> (1)..(2262) <400> 1 gat aaa gac gag ccg caa gcg ata gct tcc cag tct agt gcc gaa gag 48 Asp Lys Asp Glu Pro Gln Ala Ile Ala Ser Gln Ser Ser Ala Glu Glu 1 5 10 15 ggc gcc ctc gac aat gtg gta tta gca aac atg ttg tgg gat ttt gat 96 Gly Ala Leu Asp Asn Val Val Leu Ala Asn Met Leu Trp Asp Phe Asp 20 25 30 tcg ggt gac gtt acg cct gca atc caa acc gaa aat acg act gtg aag 144 Ser Gly Asp Val Thr Pro Ala Ile Gln Thr Glu Asn Thr Thr Val Lys 35 40 45 ttc gtg ccc aat tct tcc ggg cgg gct ttg gag gta gag cta caa act 192 Phe Val Pro Asn Ser Ser Gly Arg Ala Leu Glu Val Glu Leu Gln Thr 50 55 60 caa tcg cat tac tct gcc aac tta acc ttt gcc gcc gat gcg cct tgg 240 Gln Ser His Tyr Ser Ala Asn Leu Thr Phe Ala Ala Asp Ala Pro Trp 65 70 75 80 gac tgg agc ggg cta ggg aat ttt gca ttc gct ttg gat att gct aac 288 Asp Trp Ser Gly Leu Gly Asn Phe Ala Phe Ala Leu Asp Ile Ala Asn 85 90 95 ccc aag cca aca tct gtt tat ttg cat gtg gtt gct aca gac agc cat 336 Pro Lys Pro Thr Ser Val Tyr Leu His Val Val Ala Thr Asp Ser His 100 105 110 ggc aaa gag cgt aaa cgt gcc att gca ata cca ggt aat tcc agt ggt 384 Gly Lys Glu Arg Lys Arg Ala Ile Ala Ile Pro Gly Asn Ser Ser Gly 115 120 125 aca tat tat tat gag cta aag ggg cct gac gac ggt gtt gaa acc ggt 432 Thr Tyr Tyr Tyr Glu Leu Lys Gly Pro Asp Asp Gly Val Glu Thr Gly 130 135 140 att cgc tct aac ccg cca agt tgg aac agt gac tat cag agt atg att 480 Ile Arg Ser Asn Pro Pro Ser Trp Asn Ser Asp Tyr Gln Ser Met Ile 145 150 155 160 tat cgc tgg ggc gat aag cag ttg gat gtt agc tca cta aaa agc att 528 Tyr Arg Trp Gly Asp Lys Gln Leu Asp Val Ser Ser Leu Lys Ser Ile 165 170 175 gct ttt aca gta acc ggc gta ctt gaa aat aaa aca ctt att ctc gat 576 Ala Phe Thr Val Thr Gly Val Leu Glu Asn Lys Thr Leu Ile Leu Asp 180 185 190 aac gta cgt tta att cag cct aaa tct ata gat gaa aac tac ctt aaa 624 Asn Val Arg Leu Ile Gln Pro Lys Ser Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Lys 195 200 205 ggg ctg gtg gat gag ttc ggt caa aac gat aaa tta gaa ttt gtt aac 672 Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Asn Asp Lys Leu Glu Phe Val Asn 210 215 220 aag gtt caa tct gtt gag caa ttg cgt aag tta tcg gaa gaa gag caa 720 Lys Val Gln Ser Val Glu Gln Leu Arg Lys Leu Ser Glu Glu Glu Gln 225 230 235 240 gcg cag ttg cga aca aca cct ctt gat ggc cgc tcc aaa ttt ggt gga 768 Ala Gln Leu Arg Thr Thr Pro Leu Asp Gly Arg Ser Lys Phe Gly Gly 245 250 255 tgg gca gag ggg ccg aag ctt gaa gcg aca ggg tat ttt cgt acg caa 816 Trp Ala Glu Gly Pro Lys Leu Glu Ala Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Gln 260 265 270 aaa gtt aac ggc aaa tgg gcg ttg gtt gac ccg agt ggt tat tta ttt 864 Lys Val Asn Gly Lys Trp Ala Leu Val Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Phe 275 280 285 ttc tct acc ggt att gct aac gtt cgc tta gca aac act tct act ata 912 Phe Ser Thr Gly Ile Ala Asn Val Arg Leu Ala Asn Thr Ser Thr Ile 290 295 300 act ggc tac gat ttc gat cag tct aaa atc cct cag cgt caa cct ggt 960 Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Gln Ser Lys Ile Pro Gln Arg Gln Pro Gly 305 310 315 320 gat tta aca cct gaa gat tct cta ggg ctt aac cgt gcg ccg gat gca 1008 Asp Leu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Gly Leu Asn Arg Ala Pro Asp Ala 325 330 335 gcc cta ccc aca agg cat ata agt tcg ccg cta cga gct gaa atg ttc 1056 Ala Leu Pro Thr Arg His Ile Ser Ser Pro Leu Arg Ala Glu Met Phe 340 345 350 act tgg tta cct aaa tat gat gag ccg cta gga ctt aac ttt ggc tac 1104 Thr Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Glu Pro Leu Gly Leu Asn Phe Gly Tyr 355 360 365 cga cgc gaa gtg cat aca ggg gcc att gaa cgg ggg gag acg ttc agc 1152 Arg Arg Glu Val His Thr Gly Ala Ile Glu Arg Gly Glu Thr Phe Ser 370 375 380 ttt tat cgt gca aac cta cag cga aaa tac ggc ata agt gac gaa gcg 1200 Phe Tyr Arg Ala Asn Leu Gln Arg Lys Tyr Gly Ile Ser Asp Glu Ala 385 390 395 400 gca ttg atg gaa aaa tgg cga gaa acc act gtg aat cgt atg ctt tct 1248 Ala Leu Met Glu Lys Trp Arg Glu Thr Thr Val Asn Arg Met Leu Ser 405 410 415 tgg ggg ttc acc tca ttt ggt aat tgg att gac ccc gcc tat tat caa 1296 Trp Gly Phe Thr Ser Phe Gly Asn Trp Ile Asp Pro Ala Tyr Tyr Gln 420 425 430 atg gac cgt att cca tac ttt gcg aat ggt tgg att att gga aac ttt 1344 Met Asp Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Asn Gly Trp Ile Ile Gly Asn Phe 435 440 445 aaa aca gta agc agt ggc aat gat tat tgg agc ccg ttg cca gat cca 1392 Lys Thr Val Ser Ser Gly Asn Asp Tyr Trp Ser Pro Leu Pro Asp Pro 450 455 460 ttc gac ccg cta ttt aaa gag cgc gcg tat att act gca gag caa att 1440 Phe Asp Pro Leu Phe Lys Glu Arg Ala Tyr Ile Thr Ala Glu Gln Ile 465 470 475 480 ggc cgt gag gtt aaa aat aac cct tgg tgt gtg ggt gtt ttt atc gat 1488 Gly Arg Glu Val Lys Asn Asn Pro Trp Cys Val Gly Val Phe Ile Asp 485 490 495 aac gaa aaa agt tgg ggg caa gaa ggg gct gta caa acg cag tac gga 1536 Asn Glu Lys Ser Trp Gly Gln Glu Gly Ala Val Gln Thr Gln Tyr Gly 500 505 510 att gtg att aac act ctt agc cac gca gct gaa gat agc cca acc aaa 1584 Ile Val Ile Asn Thr Leu Ser His Ala Ala Glu Asp Ser Pro Thr Lys 515 520 525 gcg caa ttt gta atg ctt atg cag caa aaa tat ggg gat att acc gaa 1632 Ala Gln Phe Val Met Leu Met Gln Gln Lys Tyr Gly Asp Ile Thr Glu 530 535 540 cta aat cgc gct tgg aat att gag cta aac agt tgg caa gaa ttt gct 1680 Leu Asn Arg Ala Trp Asn Ile Glu Leu Asn Ser Trp Gln Glu Phe Ala 545 550 555 560 aat ggt gtt gct cta acc caa ttt agc gat gtc gtg gtt gcc gac ctc 1728 Asn Gly Val Ala Leu Thr Gln Phe Ser Asp Val Val Val Ala Asp Leu 565 570 575 tct att atg ttg gag cac tac gcc ggc caa tat ttt aaa att gta cgc 1776 Ser Ile Met Leu Glu His Tyr Ala Gly Gln Tyr Phe Lys Ile Val Arg 580 585 590 gaa gca gtt aaa cat tat tta cca aac cat atg tac ctt ggc gct cgc 1824 Glu Ala Val Lys His Tyr Leu Pro Asn His Met Tyr Leu Gly Ala Arg 595 600 605 ttt gca gat tgg ggg atg aca ccg gaa ata cgt cgt tcg gct gca aaa 1872 Phe Ala Asp Trp Gly Met Thr Pro Glu Ile Arg Arg Ser Ala Ala Lys 610 615 620 tat gcc gat gtt gta agt tac aac tat tac aaa gaa ggc gtt agt aat 1920 Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn Tyr Tyr Lys Glu Gly Val Ser Asn 625 630 635 640 aaa ttc tgg cac ttc tta gag gag tta gat aag ccc agc att ata gga 1968 Lys Phe Trp His Phe Leu Glu Glu Leu Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly 645 650 655 gaa ttc cat aac ggt gcg ttg gat tct ggt ttg cta aac ccc ggt gta 2016 Glu Phe His Asn Gly Ala Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Pro Gly Val 660 665 670 gta cac gca agc tcg caa gct gat cgc ggt aaa aaa tat gct gag tat 2064 Val His Ala Ser Ser Gln Ala Asp Arg Gly Lys Lys Tyr Ala Glu Tyr 675 680 685 atg aat agc gtg ata gat aac ccg tat ttt gtt gga gcc cat tgg ttt 2112 Met Asn Ser Val Ile Asp Asn Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe 690 695 700 cag tat att gat tcg cca ctt acc ggt cgt gct tac gat ggt gaa aac 2160 Gln Tyr Ile Asp Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn 705 710 715 720 tat aat att ggt ttt gtg agt att gcg gat atc cct tac acc ccg ctt 2208 Tyr Asn Ile Gly Phe Val Ser Ile Ala Asp Ile Pro Tyr Thr Pro Leu 725 730 735 gta gag gct gcg cga gaa gta aat aaa gca cta tat agt cga cgt ttt 2256 Val Glu Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Ala Leu Tyr Ser Arg Arg Phe 740 745 750 ggc gag taa 2265 Gly Glu <210> 2 <211> 754 <212> PRT <213> b-agarase mature <400> 2 Asp Lys Asp Glu Pro Gln Ala Ile Ala Ser Gln Ser Ser Ala Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Asp Asn Val Val Leu Ala Asn Met Leu Trp Asp Phe Asp 20 25 30 Ser Gly Asp Val Thr Pro Ala Ile Gln Thr Glu Asn Thr Thr Val Lys 35 40 45 Phe Val Pro Asn Ser Ser Gly Arg Ala Leu Glu Val Glu Leu Gln Thr 50 55 60 Gln Ser His Tyr Ser Ala Asn Leu Thr Phe Ala Ala Asp Ala Pro Trp 65 70 75 80 Asp Trp Ser Gly Leu Gly Asn Phe Ala Phe Ala Leu Asp Ile Ala Asn 85 90 95 Pro Lys Pro Thr Ser Val Tyr Leu His Val Val Ala Thr Asp Ser His 100 105 110 Gly Lys Glu Arg Lys Arg Ala Ile Ala Ile Pro Gly Asn Ser Ser Gly 115 120 125 Thr Tyr Tyr Tyr Glu Leu Lys Gly Pro Asp Asp Gly Val Glu Thr Gly 130 135 140 Ile Arg Ser Asn Pro Pro Ser Trp Asn Ser Asp Tyr Gln Ser Met Ile 145 150 155 160 Tyr Arg Trp Gly Asp Lys Gln Leu Asp Val Ser Ser Leu Lys Ser Ile 165 170 175 Ala Phe Thr Val Thr Gly Val Leu Glu Asn Lys Thr Leu Ile Leu Asp 180 185 190 Asn Val Arg Leu Ile Gln Pro Lys Ser Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Lys 195 200 205 Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Asn Asp Lys Leu Glu Phe Val Asn 210 215 220 Lys Val Gln Ser Val Glu Gln Leu Arg Lys Leu Ser Glu Glu Glu Gln 225 230 235 240 Ala Gln Leu Arg Thr Thr Pro Leu Asp Gly Arg Ser Lys Phe Gly Gly 245 250 255 Trp Ala Glu Gly Pro Lys Leu Glu Ala Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Gln 260 265 270 Lys Val Asn Gly Lys Trp Ala Leu Val Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Phe 275 280 285 Phe Ser Thr Gly Ile Ala Asn Val Arg Leu Ala Asn Thr Ser Thr Ile 290 295 300 Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Gln Ser Lys Ile Pro Gln Arg Gln Pro Gly 305 310 315 320 Asp Leu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Gly Leu Asn Arg Ala Pro Asp Ala 325 330 335 Ala Leu Pro Thr Arg His Ile Ser Ser Pro Leu Arg Ala Glu Met Phe 340 345 350 Thr Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Glu Pro Leu Gly Leu Asn Phe Gly Tyr 355 360 365 Arg Arg Glu Val His Thr Gly Ala Ile Glu Arg Gly Glu Thr Phe Ser 370 375 380 Phe Tyr Arg Ala Asn Leu Gln Arg Lys Tyr Gly Ile Ser Asp Glu Ala 385 390 395 400 Ala Leu Met Glu Lys Trp Arg Glu Thr Thr Val Asn Arg Met Leu Ser 405 410 415 Trp Gly Phe Thr Ser Phe Gly Asn Trp Ile Asp Pro Ala Tyr Tyr Gln 420 425 430 Met Asp Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Asn Gly Trp Ile Ile Gly Asn Phe 435 440 445 Lys Thr Val Ser Ser Gly Asn Asp Tyr Trp Ser Pro Leu Pro Asp Pro 450 455 460 Phe Asp Pro Leu Phe Lys Glu Arg Ala Tyr Ile Thr Ala Glu Gln Ile 465 470 475 480 Gly Arg Glu Val Lys Asn Asn Pro Trp Cys Val Gly Val Phe Ile Asp 485 490 495 Asn Glu Lys Ser Trp Gly Gln Glu Gly Ala Val Gln Thr Gln Tyr Gly 500 505 510 Ile Val Ile Asn Thr Leu Ser His Ala Ala Glu Asp Ser Pro Thr Lys 515 520 525 Ala Gln Phe Val Met Leu Met Gln Gln Lys Tyr Gly Asp Ile Thr Glu 530 535 540 Leu Asn Arg Ala Trp Asn Ile Glu Leu Asn Ser Trp Gln Glu Phe Ala 545 550 555 560 Asn Gly Val Ala Leu Thr Gln Phe Ser Asp Val Val Val Ala Asp Leu 565 570 575 Ser Ile Met Leu Glu His Tyr Ala Gly Gln Tyr Phe Lys Ile Val Arg 580 585 590 Glu Ala Val Lys His Tyr Leu Pro Asn His Met Tyr Leu Gly Ala Arg 595 600 605 Phe Ala Asp Trp Gly Met Thr Pro Glu Ile Arg Arg Ser Ala Ala Lys 610 615 620 Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn Tyr Tyr Lys Glu Gly Val Ser Asn 625 630 635 640 Lys Phe Trp His Phe Leu Glu Glu Leu Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly 645 650 655 Glu Phe His Asn Gly Ala Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Pro Gly Val 660 665 670 Val His Ala Ser Ser Gln Ala Asp Arg Gly Lys Lys Tyr Ala Glu Tyr 675 680 685 Met Asn Ser Val Ile Asp Asn Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe 690 695 700 Gln Tyr Ile Asp Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn 705 710 715 720 Tyr Asn Ile Gly Phe Val Ser Ile Ala Asp Ile Pro Tyr Thr Pro Leu 725 730 735 Val Glu Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Ala Leu Tyr Ser Arg Arg Phe 740 745 750 Gly Glu <210> 3 <211> 2334 <212> DNA <213> b-agarase <220> <221> CDS <222> (1)..(2331) <400> 3 atg aca aaa ttc tca att aag aaa ata ctg gcc tgt gtt tgt atc gcc 48 Met Thr Lys Phe Ser Ile Lys Lys Ile Leu Ala Cys Val Cys Ile Ala 1 5 10 15 act tta att aat gct tgt gcg gat aaa gac gag ccg caa gcg ata gct 96 Thr Leu Ile Asn Ala Cys Ala Asp Lys Asp Glu Pro Gln Ala Ile Ala 20 25 30 tcc cag tct agt gcc gaa gag ggc gcc ctc gac aat gtg gta tta gca 144 Ser Gln Ser Ser Ala Glu Glu Gly Ala Leu Asp Asn Val Val Leu Ala 35 40 45 aac atg ttg tgg gat ttt gat tcg ggt gac gtt acg cct gca atc caa 192 Asn Met Leu Trp Asp Phe Asp Ser Gly Asp Val Thr Pro Ala Ile Gln 50 55 60 acc gaa aat acg act gtg aag ttc gtg ccc aat tct tcc ggg cgg gct 240 Thr Glu Asn Thr Thr Val Lys Phe Val Pro Asn Ser Ser Gly Arg Ala 65 70 75 80 ttg gag gta gag cta caa act caa tcg cat tac tct gcc aac tta acc 288 Leu Glu Val Glu Leu Gln Thr Gln Ser His Tyr Ser Ala Asn Leu Thr 85 90 95 ttt gcc gcc gat gcg cct tgg gac tgg agc ggg cta ggg aat ttt gca 336 Phe Ala Ala Asp Ala Pro Trp Asp Trp Ser Gly Leu Gly Asn Phe Ala 100 105 110 ttc gct ttg gat att gct aac ccc aag cca aca tct gtt tat ttg cat 384 Phe Ala Leu Asp Ile Ala Asn Pro Lys Pro Thr Ser Val Tyr Leu His 115 120 125 gtg gtt gct aca gac agc cat ggc aaa gag cgt aaa cgt gcc att gca 432 Val Val Ala Thr Asp Ser His Gly Lys Glu Arg Lys Arg Ala Ile Ala 130 135 140 ata cca ggt aat tcc agt ggt aca tat tat tat gag cta aag ggg cct 480 Ile Pro Gly Asn Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Glu Leu Lys Gly Pro 145 150 155 160 gac gac ggt gtt gaa acc ggt att cgc tct aac ccg cca agt tgg aac 528 Asp Asp Gly Val Glu Thr Gly Ile Arg Ser Asn Pro Pro Ser Trp Asn 165 170 175 agt gac tat cag agt atg att tat cgc tgg ggc gat aag cag ttg gat 576 Ser Asp Tyr Gln Ser Met Ile Tyr Arg Trp Gly Asp Lys Gln Leu Asp 180 185 190 gtt agc tca cta aaa agc att gct ttt aca gta acc ggc gta ctt gaa 624 Val Ser Ser Leu Lys Ser Ile Ala Phe Thr Val Thr Gly Val Leu Glu 195 200 205 aat aaa aca ctt att ctc gat aac gta cgt tta att cag cct aaa tct 672 Asn Lys Thr Leu Ile Leu Asp Asn Val Arg Leu Ile Gln Pro Lys Ser 210 215 220 ata gat gaa aac tac ctt aaa ggg ctg gtg gat gag ttc ggt caa aac 720 Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Lys Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Asn 225 230 235 240 gat aaa tta gaa ttt gtt aac aag gtt caa tct gtt gag caa ttg cgt 768 Asp Lys Leu Glu Phe Val Asn Lys Val Gln Ser Val Glu Gln Leu Arg 245 250 255 aag tta tcg gaa gaa gag caa gcg cag ttg cga aca aca cct ctt gat 816 Lys Leu Ser Glu Glu Glu Gln Ala Gln Leu Arg Thr Thr Pro Leu Asp 260 265 270 ggc cgc tcc aaa ttt ggt gga tgg gca gag ggg ccg aag ctt gaa gcg 864 Gly Arg Ser Lys Phe Gly Gly Trp Ala Glu Gly Pro Lys Leu Glu Ala 275 280 285 aca ggg tat ttt cgt acg caa aaa gtt aac ggc aaa tgg gcg ttg gtt 912 Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Gln Lys Val Asn Gly Lys Trp Ala Leu Val 290 295 300 gac ccg agt ggt tat tta ttt ttc tct acc ggt att gct aac gtt cgc 960 Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Phe Phe Ser Thr Gly Ile Ala Asn Val Arg 305 310 315 320 tta gca aac act tct act ata act ggc tac gat ttc gat cag tct aaa 1008 Leu Ala Asn Thr Ser Thr Ile Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Gln Ser Lys 325 330 335 atc cct cag cgt caa cct ggt gat tta aca cct gaa gat tct cta ggg 1056 Ile Pro Gln Arg Gln Pro Gly Asp Leu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Gly 340 345 350 ctt aac cgt gcg ccg gat gca gcc cta ccc aca agg cat ata agt tcg 1104 Leu Asn Arg Ala Pro Asp Ala Ala Leu Pro Thr Arg His Ile Ser Ser 355 360 365 ccg cta cga gct gaa atg ttc act tgg tta cct aaa tat gat gag ccg 1152 Pro Leu Arg Ala Glu Met Phe Thr Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Glu Pro 370 375 380 cta gga ctt aac ttt ggc tac cga cgc gaa gtg cat aca ggg gcc att 1200 Leu Gly Leu Asn Phe Gly Tyr Arg Arg Glu Val His Thr Gly Ala Ile 385 390 395 400 gaa cgg ggg gag acg ttc agc ttt tat cgt gca aac cta cag cga aaa 1248 Glu Arg Gly Glu Thr Phe Ser Phe Tyr Arg Ala Asn Leu Gln Arg Lys 405 410 415 tac ggc ata agt gac gaa gcg gca ttg atg gaa aaa tgg cga gaa acc 1296 Tyr Gly Ile Ser Asp Glu Ala Ala Leu Met Glu Lys Trp Arg Glu Thr 420 425 430 act gtg aat cgt atg ctt tct tgg ggg ttc acc tca ttt ggt aat tgg 1344 Thr Val Asn Arg Met Leu Ser Trp Gly Phe Thr Ser Phe Gly Asn Trp 435 440 445 att gac ccc gcc tat tat caa atg gac cgt att cca tac ttt gcg aat 1392 Ile Asp Pro Ala Tyr Tyr Gln Met Asp Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Asn 450 455 460 ggt tgg att att gga aac ttt aaa aca gta agc agt ggc aat gat tat 1440 Gly Trp Ile Ile Gly Asn Phe Lys Thr Val Ser Ser Gly Asn Asp Tyr 465 470 475 480 tgg agc ccg ttg cca gat cca ttc gac ccg cta ttt aaa gag cgc gcg 1488 Trp Ser Pro Leu Pro Asp Pro Phe Asp Pro Leu Phe Lys Glu Arg Ala 485 490 495 tat att act gca gag caa att ggc cgt gag gtt aaa aat aac cct tgg 1536 Tyr Ile Thr Ala Glu Gln Ile Gly Arg Glu Val Lys Asn Asn Pro Trp 500 505 510 tgt gtg ggt gtt ttt atc gat aac gaa aaa agt tgg ggg caa gaa ggg 1584 Cys Val Gly Val Phe Ile Asp Asn Glu Lys Ser Trp Gly Gln Glu Gly 515 520 525 gct gta caa acg cag tac gga att gtg att aac act ctt agc cac gca 1632 Ala Val Gln Thr Gln Tyr Gly Ile Val Ile Asn Thr Leu Ser His Ala 530 535 540 gct gaa gat agc cca acc aaa gcg caa ttt gta atg ctt atg cag caa 1680 Ala Glu Asp Ser Pro Thr Lys Ala Gln Phe Val Met Leu Met Gln Gln 545 550 555 560 aaa tat ggg gat att acc gaa cta aat cgc gct tgg aat att gag cta 1728 Lys Tyr Gly Asp Ile Thr Glu Leu Asn Arg Ala Trp Asn Ile Glu Leu 565 570 575 aac agt tgg caa gaa ttt gct aat ggt gtt gct cta acc caa ttt agc 1776 Asn Ser Trp Gln Glu Phe Ala Asn Gly Val Ala Leu Thr Gln Phe Ser 580 585 590 gat gtc gtg gtt gcc gac ctc tct att atg ttg gag cac tac gcc ggc 1824 Asp Val Val Val Ala Asp Leu Ser Ile Met Leu Glu His Tyr Ala Gly 595 600 605 caa tat ttt aaa att gta cgc gaa gca gtt aaa cat tat tta cca aac 1872 Gln Tyr Phe Lys Ile Val Arg Glu Ala Val Lys His Tyr Leu Pro Asn 610 615 620 cat atg tac ctt ggc gct cgc ttt gca gat tgg ggg atg aca ccg gaa 1920 His Met Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Met Thr Pro Glu 625 630 635 640 ata cgt cgt tcg gct gca aaa tat gcc gat gtt gta agt tac aac tat 1968 Ile Arg Arg Ser Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn Tyr 645 650 655 tac aaa gaa ggc gtt agt aat aaa ttc tgg cac ttc tta gag gag tta 2016 Tyr Lys Glu Gly Val Ser Asn Lys Phe Trp His Phe Leu Glu Glu Leu 660 665 670 gat aag ccc agc att ata gga gaa ttc cat aac ggt gcg ttg gat tct 2064 Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Asn Gly Ala Leu Asp Ser 675 680 685 ggt ttg cta aac ccc ggt gta gta cac gca agc tcg caa gct gat cgc 2112 Gly Leu Leu Asn Pro Gly Val Val His Ala Ser Ser Gln Ala Asp Arg 690 695 700 ggt aaa aaa tat gct gag tat atg aat agc gtg ata gat aac ccg tat 2160 Gly Lys Lys Tyr Ala Glu Tyr Met Asn Ser Val Ile Asp Asn Pro Tyr 705 710 715 720 ttt gtt gga gcc cat tgg ttt cag tat att gat tcg cca ctt acc ggt 2208 Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Ile Asp Ser Pro Leu Thr Gly 725 730 735 cgt gct tac gat ggt gaa aac tat aat att ggt ttt gtg agt att gcg 2256 Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Ile Gly Phe Val Ser Ile Ala 740 745 750 gat atc cct tac acc ccg ctt gta gag gct gcg cga gaa gta aat aaa 2304 Asp Ile Pro Tyr Thr Pro Leu Val Glu Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys 755 760 765 gca cta tat agt cga cgt ttt ggc gag taa 2334 Ala Leu Tyr Ser Arg Arg Phe Gly Glu 770 775 <210> 4 <211> 777 <212> PRT <213> b-agarase <400> 4 Met Thr Lys Phe Ser Ile Lys Lys Ile Leu Ala Cys Val Cys Ile Ala 1 5 10 15 Thr Leu Ile Asn Ala Cys Ala Asp Lys Asp Glu Pro Gln Ala Ile Ala 20 25 30 Ser Gln Ser Ser Ala Glu Glu Gly Ala Leu Asp Asn Val Val Leu Ala 35 40 45 Asn Met Leu Trp Asp Phe Asp Ser Gly Asp Val Thr Pro Ala Ile Gln 50 55 60 Thr Glu Asn Thr Thr Val Lys Phe Val Pro Asn Ser Ser Gly Arg Ala 65 70 75 80 Leu Glu Val Glu Leu Gln Thr Gln Ser His Tyr Ser Ala Asn Leu Thr 85 90 95 Phe Ala Ala Asp Ala Pro Trp Asp Trp Ser Gly Leu Gly Asn Phe Ala 100 105 110 Phe Ala Leu Asp Ile Ala Asn Pro Lys Pro Thr Ser Val Tyr Leu His 115 120 125 Val Val Ala Thr Asp Ser His Gly Lys Glu Arg Lys Arg Ala Ile Ala 130 135 140 Ile Pro Gly Asn Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Glu Leu Lys Gly Pro 145 150 155 160 Asp Asp Gly Val Glu Thr Gly Ile Arg Ser Asn Pro Pro Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Asp Tyr Gln Ser Met Ile Tyr Arg Trp Gly Asp Lys Gln Leu Asp 180 185 190 Val Ser Ser Leu Lys Ser Ile Ala Phe Thr Val Thr Gly Val Leu Glu 195 200 205 Asn Lys Thr Leu Ile Leu Asp Asn Val Arg Leu Ile Gln Pro Lys Ser 210 215 220 Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Lys Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Asn 225 230 235 240 Asp Lys Leu Glu Phe Val Asn Lys Val Gln Ser Val Glu Gln Leu Arg 245 250 255 Lys Leu Ser Glu Glu Glu Gln Ala Gln Leu Arg Thr Thr Pro Leu Asp 260 265 270 Gly Arg Ser Lys Phe Gly Gly Trp Ala Glu Gly Pro Lys Leu Glu Ala 275 280 285 Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Gln Lys Val Asn Gly Lys Trp Ala Leu Val 290 295 300 Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Phe Phe Ser Thr Gly Ile Ala Asn Val Arg 305 310 315 320 Leu Ala Asn Thr Ser Thr Ile Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Gln Ser Lys 325 330 335 Ile Pro Gln Arg Gln Pro Gly Asp Leu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Gly 340 345 350 Leu Asn Arg Ala Pro Asp Ala Ala Leu Pro Thr Arg His Ile Ser Ser 355 360 365 Pro Leu Arg Ala Glu Met Phe Thr Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Glu Pro 370 375 380 Leu Gly Leu Asn Phe Gly Tyr Arg Arg Glu Val His Thr Gly Ala Ile 385 390 395 400 Glu Arg Gly Glu Thr Phe Ser Phe Tyr Arg Ala Asn Leu Gln Arg Lys 405 410 415 Tyr Gly Ile Ser Asp Glu Ala Ala Leu Met Glu Lys Trp Arg Glu Thr 420 425 430 Thr Val Asn Arg Met Leu Ser Trp Gly Phe Thr Ser Phe Gly Asn Trp 435 440 445 Ile Asp Pro Ala Tyr Tyr Gln Met Asp Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Asn 450 455 460 Gly Trp Ile Ile Gly Asn Phe Lys Thr Val Ser Ser Gly Asn Asp Tyr 465 470 475 480 Trp Ser Pro Leu Pro Asp Pro Phe Asp Pro Leu Phe Lys Glu Arg Ala 485 490 495 Tyr Ile Thr Ala Glu Gln Ile Gly Arg Glu Val Lys Asn Asn Pro Trp 500 505 510 Cys Val Gly Val Phe Ile Asp Asn Glu Lys Ser Trp Gly Gln Glu Gly 515 520 525 Ala Val Gln Thr Gln Tyr Gly Ile Val Ile Asn Thr Leu Ser His Ala 530 535 540 Ala Glu Asp Ser Pro Thr Lys Ala Gln Phe Val Met Leu Met Gln Gln 545 550 555 560 Lys Tyr Gly Asp Ile Thr Glu Leu Asn Arg Ala Trp Asn Ile Glu Leu 565 570 575 Asn Ser Trp Gln Glu Phe Ala Asn Gly Val Ala Leu Thr Gln Phe Ser 580 585 590 Asp Val Val Val Ala Asp Leu Ser Ile Met Leu Glu His Tyr Ala Gly 595 600 605 Gln Tyr Phe Lys Ile Val Arg Glu Ala Val Lys His Tyr Leu Pro Asn 610 615 620 His Met Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Met Thr Pro Glu 625 630 635 640 Ile Arg Arg Ser Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn Tyr 645 650 655 Tyr Lys Glu Gly Val Ser Asn Lys Phe Trp His Phe Leu Glu Glu Leu 660 665 670 Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Asn Gly Ala Leu Asp Ser 675 680 685 Gly Leu Leu Asn Pro Gly Val Val His Ala Ser Ser Gln Ala Asp Arg 690 695 700 Gly Lys Lys Tyr Ala Glu Tyr Met Asn Ser Val Ile Asp Asn Pro Tyr 705 710 715 720 Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Ile Asp Ser Pro Leu Thr Gly 725 730 735 Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Ile Gly Phe Val Ser Ile Ala 740 745 750 Asp Ile Pro Tyr Thr Pro Leu Val Glu Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys 755 760 765 Ala Leu Tyr Ser Arg Arg Phe Gly Glu 770 775 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F <400> 5 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R <400> 6 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agar-F <400> 7 cgataagcag ttggatgtta g 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agar-R <400> 8 ttactcgcca aaacgtn 17 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPS1 <400> 9 tcgtagcggc gaacttatat gcct 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPS2 <400> 10 gccatcaaga ggtgttgttc gcaa 24 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 primer <400> 11 gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg acttca 36 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 primer <400> 12 cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga 35 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 08-283 <400> 13 gagagaggat ccgataaaga cgagccgcaa gcgata 36 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 08-284 <400> 14 gagagatcta gattattgct cgccaaaacg tcgac 35

Claims (5)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 베타-아가라제 변이효소.
2. 제1항에 있어서, 상기 내열성 베타-아가라제 변이효소는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제 변이효소.
3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 베타-아가라제 변이효소 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
5. 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 네오아가로올리고사카라이드에 제1항 또는 제2항에 따른 베타-아가라제를 반응시키는 단계를 포함하는 네오아가로비오스(neoagarobiose) 제조방법.

Images