KR102038287B1

KR102038287B1 - 신규한 당화효소 생산 셀룰로파가 속 미생물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102038287B1
Application number: KR1020170174750A
Authority: KR
Inventors: 지원재; 배창환
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-10-30
Also published as: KR20190073681A

Abstract

본 발명은 신규한 당화효소 생산 셀룰로파가 속 미생물 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 제주도 표선리 앞바다의 해수에서 분리되어 우수한 한천 분해 활성을 나타내며 신규한 당화효소를 효율적으로 생산하는 신규 미생물 셀룰로파가(Cellulophaga) sp. J9-3 (수탁번호 KACC92201P)에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물은 지금까지 알려지지 않은 새로운 한천분해효소를 생산하며, 한천 분해능이 매우 우수하다. 특히 한천분해효소를 세포 외부로 분비하는 특성이 있어 본 발명의 미생물을 이용하면 매우 효율적으로 한천분해효소를 수득할 수 있다. 또한 본 발명의 미생물이 생산하는 한천분해효소는 한천의 아가로오스를 네 개의 당분자 또는 여섯 개의 당분자로 이루어진 한천 유래 올리고당을 최종산물로 생성할 수 있을 뿐만 아니라 활성의 조절을 통해 여덟 개, 열 개, 열두 개 또는 그 이상의 당분자로 이루어진 올리고당을 생성할 수도 있으므로, 한천을 분해하여 활용하는 산업분야에서 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

신규한 당화효소 생산 셀룰로파가 속 미생물 및 이의 이용{A novel Cellulophaga sp., producing new saccharogenic enzyme and use thereof}

본 발명은 신규한 당화효소 생산 셀룰로파가 속 미생물 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 제주도 표선리 앞바다의 해수에서 분리되어 우수한 한천 분해 활성을 나타내며 신규한 당화효소를 효율적으로 생산하는 신규 미생물 셀룰로파가(Cellulophaga) sp. J9-3 (수탁번호 KACC92201P)에 관한 것이다.

한천(agar)은 홍조류(red algae)에서 발견되는 세포벽 구성 물질로 바다에 풍부하게 존재하고 쉽게 얻을 수 있는 탄소원이지만, 대부분 단순가공 처리되어 공업용 또는 식용 등의 값싼 원료로 사용되는 수준에 머물고 있다.

이에 한천의 활용성을 높이기 위해, 한천의 효소반응을 통해 특정 생리활성이 우수한 기능성 아가로올리고당을 생산하거나 바이오에탄올을 생산하는 등의 기술들이 연구되고 있다.

홍조류에 함유된 아가의 약 70%는 아가로오스(agarose)이며, 이 아가로오스는 갈락토오스(D-galactose)와 무수갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)가 β-1, 4 결합한 단위체인 아가로바이오스(agarobiose)가 반복하여 α-1, 3 결합으로 연결된 직쇄구조로 구성되어 있다. 아가로오스는 베타-아가레이즈(beta-agarase)에 의해 β-1, 4 결합이 가수분해되어 최소 단위체인 네오아가로바이오스로 되고 알파-네오아가로바이오스 하이드로레이즈에 의해 갈락토오스와 무수갈락토오스로 분해된다. 네오아가로바이오스를 구성하는 무수갈락토오스의 경우 신 물질로 새로운 생리활성의 연구대상이 되고 있으며, 그 효용 가치가 매우 높다. 그리고 갈락토오스는 감미료 타가토스(Tagatose)의 원료로 사용하는 고가의 화합물이며, 무수갈락토오스와 함께 바이오에탄올 생산에 활용될 수 있다.

상기와 같이 한천을 유용하게 활용하기 위해서는 한천을 분해하는 공정이 필요하다. 이를 위해 고온에서 강산 또는 강염기로 처리하는 화학적인 방법이 사용될 수 있지만, 이 경우 식품, 의약품, 화장품과 같이 인체에 직접적으로 관련된 분야에서 사용하기 어렵기 때문에 친환경적이고 부작용이 적은 미생물 또는 효소를 활용하는 방법이 선호된다.

이에 본 발명자는 한천을 활용하는 관련 산업에 유용한 우수한 한천 분해 활성을 갖는 새로운 균주를 제공하고자 한다.

Chi WJ, Chang YK, Hong SK (2012) Agar degradation by microorganisms and agar-degrading enzymes. Applied Microbiology and Biotechnology 94: 917-930. Chi WJ, Park JS, Kwak MJ, Kim JF, Chang YK, Hong SK (2013) Isolation and characterization of a novel agar-degrading marine bacterium, Gayadomonas joobiniege gen, nov, sp. nov., from the Southern Sea, Korea. Journal of Microbiology and Biotechnology 23: 1509-1518. Chi WJ, Park da Y, Seo YB, Chang YK, Lee SY, Hong SK (2014) Cloning, expression, and biochemical characterization of a novel GH16 b-agarase AgaG1 from Alteromonas sp. GNUM-1. Applied Microbiology and Biotechnology 98: 4545-4555.

본 발명의 주된 목적은 우수한 한천 분해 활성을 나타내어 한천 분해 산물을 제조하는데 유용한 새로운 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주을 이용한 한천 분해 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 한천 분해용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 한천분해효소 생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 한천 분해 활성을 갖는 신규 미생물 셀룰로파가(Cellulophaga) sp. J9-3 (수탁번호 KACC92201P)을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 미생물 또는 상기 미생물의 배양액을 한천이 함유된 시료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 한천 분해 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 미생물 또는 상기 미생물의 배양액을 포함하는 한천 분해용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 한천분해효소 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 신규 미생물은 지금까지 알려지지 않은 새로운 한천분해효소를 생산하며, 한천 분해능이 매우 우수하다. 특히 한천분해효소를 세포 외부로 분비하는 특성이 있어 본 발명의 미생물을 이용하면 매우 효율적으로 한천분해효소를 수득할 수 있다. 또한 본 발명의 미생물이 생산하는 한천분해효소는 한천의 아가로오스를 네 개의 당분자 또는 여섯 개의 당분자로 이루어진 한천 유래 올리고당을 최종산물로 생성할 수 있을 뿐만 아니라 활성의 조절을 통해 여덟 개, 열 개, 열두 개 또는 그 이상의 당분자로 이루어진 올리고당을 생성할 수도 있으므로, 한천을 분해하여 활용하는 산업분야에서 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명 신규 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 계통발생적 연관성을 분석하여 나타낸 근연접합 계통수(Neighbor-Joining phylogenetic tree)이다.
도 2는 본 발명 신규 미생물의 한천분해효소(agarase) 활성을 보여주는 결과이다. 본 발명 신규 미생물을 Marine Agar 배지에 접종하여 3일간 배양하고 Lugol's Iodine 염색한 사진.
도 3은 본 발명의 신규 미생물을 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy)으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 본 발명의 신규 미생물로부터 한천분해효소를 정제하는 과정을 나타낸 블록도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 한천분해효소 정제 과정 중 Superdex 76 컬럼을 사용한 겔여과크로마토그래피를 수행하여 분획한 분획물의 단백질 농도 및 한천분해효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 pH에 따른 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 온도에 따른 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 금속이온 및 계면활성제에 따른 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 기질에 따른 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 아가로오스(agarose) 가수분해산물을 판막크로마토그래피(thin layer chromatography) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 한천분해효소의 아가로오스 가수분해산물의 분자량을 액체크로마토그래피/질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 신규 미생물은 제주도 표선리 앞바다의 해수로부터 분리되었으며, 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1)을 통한 계통 분석결과를 바탕으로 셀룰로파가(Cellulophaga) 속의 한 종으로 분류되었다.

본 발명의 신규 미생물은 N-말단 아미노산 서열이 S-P(또는 R)-N-N-W-P-T-P-G-G-M(또는 T)-V인 한천분해효소를 생산하여 세포외부로 분비하는 특징이 있다. 이 한천분해효소는 지금까지 보고된바 없는 신규한 효소이다.

본 발명의 미생물이 생산하는 상기 한천분해효소는 pH 7 ~ 7.5, 약 50℃에서 최대 효소활성(한천분해효소활성)을 나타내며, 35℃ 이상의 온도에서는 약 60% 실활률을 보여 일정온도 이상의 조건에서는 불안정한 온도민감성 효소인 것으로 보인다. 또한 상기 한천분해효소는 Co²⁺의 첨가에 의해서 효소반응이 약 6배 증가하는 반면, Cu²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺ 등의 첨가에 의해서 효소반응이 급격히 저해하고 계면활성제 SDS의 첨가에 의해서 실활되는 특징이 있다.

특히 상기 한천분해효소는 아가로오스를 분해하여 최종산물로 4개의 당분자로 이루어진 테트라머(tetramer)의 한천올리고당(DP4)과 6개의 당분자로 이루어진 헥사머(hexamer)의 한천올리고당(DP6)을 만들 수 있으며, 활성의 조절을 통해 각각 8개, 10개, 12개 등의 보다 많은 수의 당분자로 이루어진 분자량이 더 큰 한천올리고당을 만들 수도 있다.

본 발명의 신규 미생물은 해양 미생물의 배양에 일반적으로 많이 사용되는 Marine agar(MA) 또는 Marine broth(MB) 배지에서 잘 자라기 때문에 배양이 용이하다. 배양온도는 30 ~ 37℃가 바람직하다.

상기와 같이 본 발명의 신규 미생물은 지금까지 보고된바 없는 신규한 한천분해효소를 생산하여 세포외부로 분비하기 때문에, 본 발명 미생물 또는 미생물 배양액을 한천이 함유된 시료에 첨가하면, 본 발명 미생물이 생산하는 또는 본 발명 미생물이 생산 및 분비하여 배양액에 함유된 상기 한천분해효소가 시료의 한천을 분해할 수 있다.

상기와 같은 특징을 이용하여 본 발명은 본 발명의 미생물 또는 미생물 배양액을 한천이 함유된 시료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 한천 분해 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 미생물 또는 미생물 배양액을 포함하는 한천 분해용 조성물을 제공하는데, 본 발명의 조성물에는 본 발명의 미생물 또는 배양액 이외에도 본 발명의 미생물이 생장하는데 필요한 영양소 또는 한천분해효소의 원활한 효소반응에 필요한 pH 조절제, 금속이온 등이 더 포함될 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 특징을 이용하여 본 발명의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 한천분해효소 생산 방법을 제공하는데, 본 발명의 한천분해효소는 본 발명의 미생물이 생장하는 과정에서 생산 및 분비되기 때문에 본 발명에 따르면 한천분해효소의 용이한 생산이 가능하다. 또한 본 발명의 미생물을 배양한 이후 배양액에 함유된 단백질을 농축하기 위한 통상의 농축 방법, 크로마토그래피를 사용한 통상의 정제 방법 등을 추가로 사용하면 높은 순도로 한천분해효소를 수득할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

1. 방법

1-1. 미생물의 분리

2015년 7월에 제주도 표선리 앞바다의 해수를 채취하여 멸균수에 10^-1 ~ 10^-5으로 희석한 후 Marine agar 2216 고체배지(MA, Difco, USA)에 도말하여 30℃에서 1일간 배양하였다. 고체배지에 형성된 콜로니들을 새로운 고체배지에 옮긴 후 37℃에서 2일간 배양하여 순수한 단일 균체를 확인하였다. 육안으로 콜로니 주변으로 한천 분해 활성을 나타내는 균을 선별하였으며, Lugol's Iodine 용액으로 염색하여 확인하였다. 선별된 균주들 중에서 2일간 배양하여 콜로니의 모양, 색깔, 투명도, 크기 등을 관찰하여 형태적 특성을 토대로 하는 선별과정을 통하여 최종 1개의 우수 미생물 균주를 선발하여 균주 J9-3으로 명명하였다.

1-2. 16S rRNA 유전자 염기서열 해독을 통한 계통수 분석

균주 J9-3의 16S rRNA 유전자 염기서열 해독은 마크로젠(Macrogen)에 의뢰하여 수행하였으며, 사용된 프라이머는 785F(5'-GGA TTA GAT ACC CTG GTA-3')와 907R(5'-CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT-3')이다. National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BlastN 프로그램을 사용한 GenBank 데이터베이스의 정보로부터 균주 J9-3의 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성을 검색하였다. 또한 표준균주(type strain)들과의 상동성을 검색하기 위해서, EzTaxon 데이터베이스(http://www.ezbiocloud.net/)로부터 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 비교하였다.

계통수 분석을 위해서, EzTaxon 데이터베이스에서 제공하는 표준균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 Mega6 프로그램으로 Neighbor-Joining 계통수를 제작하여 균주 J9-3의 계통발생적 연관성을 분석하였다.

1-3. 균주 J9-3의 형태적 특성 분석

균주 J9-3을 Gram stain kit(BD, USA)를 사용하여 그램 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 고체배지에서 30℃로 1일간 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid(PTA)로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL, JAPAN)을 사용하여 편모의 유무를 관찰하였다.

1-4. 균주 J9-3의 한천 분해 활성

균주 J9-3을 Marine agar 고체배지(MA)에 계대하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 균체가 자란 고체배지를 Lugol's Iodine 용액(1% I₂, 2% KI)으로 염색한 후 증류수를 사용하여 남은 Lugol's Iodine 용액을 모두 제거하였다. Lugol's Iodine 용액이 다당류만을 염색시키는 특징으로부터 균체 주변의 한천 분해능을 관찰하였다.

0.05% 한천이 포함된 100㎖ Marine broth 액체배지(MB)에서 균주 J9-3을 2일간 진탕배양한 후 원심분리를 통해 균체가 제거된 상등액을 취하여 DNS법으로 한천분해효소의 활성을 측정하였다. DNS법을 통한 한천분해효소 활성 측정 방법은 다음과 같다.

50mM Tris-Cl(pH 7.5)에 아가로오스(agarose)가 0.3%로 녹아 있는 용액 130㎕에 효소시료 20㎕를 넣고, 37℃에서 10분간 반응시킨 후 DNS reagent 150㎕를 첨가하였다. 끓는 물에서 10분간 방치하고 얼음에서 5분간 식힌 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 Blank로는 균체를 접종하지 않은 배지를 사용하였다.

또한 Marine agar 배지에 상등액 10㎕를 spotting하고 37℃에서 12시간 방치한 후 Lugol's Iodine 용액으로 염색하여 한천의 분해를 관찰함으로써 균주 J9-3이 세포 외부로 한천분해효소(agarase)를 분비하는 것을 육안으로 확인하였다.

1-5. 한천분해효소의 정제

균주 J9-3을 0.05% 한천이 포함된 1ℓ의 MB배지에 접종하여 2일간 배양한 후 15,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만을 취하고, 75%가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하였다. 12시간동안 냉장고에 방치한 후 15,000rpm에서 60분간 원심분리하여 상등액을 제거한 pellet를 회수하고 50mM Tris-Cl(pH 7.5) 버퍼로 현탁하였다. 단백질 현탁액을 동일한 버퍼로 12시간 동안 4℃에서 투석하여 salt를 제거하고, 15,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 취하고 0.22㎛ syringe filter(Millipore, USA)로 여과하여 단백질 농축액을 준비하였다.

단백질 농축액을 DEAE sepharose FF레진(GE heathcare, USA)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피로 정제를 시도하였다. 정제 시 unbound fraction 및 wash fraction을 하나의 분획물로 회수하였으며, elution fraction은 100 ~ 500mM(100mM 간격) NaCl 버퍼로 5개의 분획물로 회수하였다. 회수된 총 6개의 분획물은 DNS법으로 한천분해효소 활성을 측정하였다.

한천분해효소 활성이 확인된 unbound fraction 및 wash fraction을 SP 레진(GE heathcare, USA)을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 한천분해효소의 정제를 시도하였다. 정제 시 unbound fraction 및 wash fraction을 하나의 분획물로 회수하였으며, elution fraction은 100 ~ 500mM(100mM 간격) NaCl 버퍼로 5개의 분획물로 회수하였다. 회수된 총 6개의 분획물은 DNS법으로 한천분해효소 활성을 측정하였다. 한천분해효소 활성이 확인된 100mM elution 분획물을 amicon ultracentrifugal filter(Millipore, USA, 10kDa cut off)를 수행하여 농축한 후 Superdex 76 컬럼(GE heathcare, USA)을 이용한 겔여과 크로마토그래피를 수행하여 분자량별로 분획을 시도하였다. 분획물은 DNS법으로 효소활성을 측정하였다. 단백질은 12% SDS-PAGE를 수행하여 확인하였다.

단일 단백질이 확인된 10번 분획물만을 다음 실험에서 사용하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 후 PVDF 막에 transfer하고 ㈜라이프사이언스래보러토리(Lifescience Laboratories)에 의뢰하여 Edman degradation법으로 N-말단 아미노산 서열을 해독하였다. 해독된 아미노산 서열은 NCBI의 BlastP program을 사용한 GenBank 데이터베이스의 정보로부터 상동성을 검색하였다.

1-6. 한천분해효소의 특성 분석

겔여과 크로마토그래피의 10번 분획물을 amicon ultracentrifugal filter(10kDa cut off)를 이용하여 50mM Tris-Cl(pH 7.5) 버퍼로 치환하여 효소의 특성 분석에 사용할 NaCl이 제거된 단백질 용액을 준비하였다.

정제된 한천분해효소의 기질 특이성을 알아보기 위해 0.3%의 agarose, birchwood xylan, beechwood xylan, starch, carboxylmethylcellulose(CMC)를 기질로하여 DNS법으로 한천분해효소 활성을 측정하였다. 효소반응은 pH 7.5 및 37℃에서 30분간 수행하였다. 효소반응 최적 온도 조건을 알아보기 위해 0.3% agarose를 기질로하는 효소반응액을 준비하여 각각 30 ~ 70℃(5℃ 간격)에서 반응을 유도하였다. 효소의 온도안정성을 알아보기 위해 효소액을 각각 30 ~ 70℃(5℃ 간격)에서 1시간 동안 방치한 후 pH 7.5 및 37℃에서 30분간 효소활성을 측정하였다. 효소의 최적 pH 조건을 알아보기 위해 0.3% agarose를 기질로하는 효소반응액을 준비하여 각각 pH 6.0 ~ 10.0(pH 0.5 간격)에서 37℃ 및 30분간 효소활성을 측정하였다. 사용된 버퍼는 50mM MOPS(pH 6.0 ~ 7.0), 50mM Tris-Cl(pH 7.0 ~ 9.0), 50mM Glycine-NaOH(pH 9.0 ~ 10.0)이다.

효소반응에 영향을 미치는 금속이온 및 계면활성제의 효과를 알아보기 위해 1mM의 Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Na⁺, K⁺와 1%의 SDS를 효소반응액에 첨가하여 pH 7.5 및 37℃에서 30분간 효소활성을 측정하였다. 효소활성은 최대값을 나타내는 시료의 활성을 100%으로 하는 상대값으로 환산하여 나타냈다.

1-7. 효소반응물의 판막크로마토그래피(Thin layer chromatography) 분석

균주 J9-3이 분비하는 한천분해효소에 의한 agarose의 가수분해산물을 분석하기 위해, 정제된 단백질용액을 50mM Tris-Cl(pH 7.5) 버퍼로 50배 희석하여 24시간 반응을 유도하였다. 효소반응 중 각각 0.5, 1, 3, 6, 12, 24시간째에 반응샘플을 수득하여 Silica gel 60 plate(Merck, USA)에 10㎕씩 가하였다. 이때 glucose(Simga, USA), neoagarobiose, neoagarotetraose, neoagarohexaose(Dynebio, Korea)를 표준물질(standard)로 사용하였다. 전개용매로 n-부탄올 : 아세트산 : 증류수(2 : 1 : 2) 용액을 사용하였으며, 발색시약은 에탄올 : 황산(9 : 1) 용액을 사용하였다. 전개 후 발색시약을 골고루 뿌리고 120℃로 가열하여 가시화하였다.

정제된 단백질용액을 agarose와 6시간 반응하여 완전히 분해시킨 산물을 TLC를 통하여 분해 유무를 확인하였으며, 효소반응액은 3배 부피의 100% 메탄올을 가하여 3회 반복 추출한 후 농축하였다. 준비된 추출 시료는 서울대학교 농생명과학공동기기원에 의뢰하여 액체크로마토그래피/질량분석기로 분자량을 결정하였다.

2. 결과

2-1. 균주 J9-3의 동정

한천 분해능이 뛰어난 해양미생물 균주 1주를 최종 선별하여 균주 J9-3으로 명명하였다. 이 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다. 해독된 염기서열 정보를 토대로하는 표준균주들과의 상동성 검색결과, 균주 J9-3은 Cellulophaga geojensis M-M6과 99.93%, Cellulophaga lytica DSM7489와 99.19%, Cellulophaga fucicola NN015860과 98.35%, Cellulophaga tyrosinoxydans EM41과 93.9%, Cellulophaga baltica NN015840과 93.81%의 상동성을 나타냈다(표 1 참조).

	표준균주명	Accession No.	짝 유사성(%)	완전성(%)
1	Cellulophaga geojensis M-M6(T)	HQ596527	99.93	100
2	Cellulophaga lytica DSM 7489(T)	CP002534	99.19	100
3	Cellulophaga fucicola NN015860(T)	AJ005973	98.35	99.93
4	Cellulophaga tyrosinoxydans EM41(T)	EU443205	93.9	100
5	Cellulophaga baltica NN015840(T)	AJ005972	93.81	99.93
6	Cellulophaga algicola DSM 14237(T)	CP002453	93.22	100
7	Aquimarina penaei P3-1(T)	KM058086	93.09	100
8	Sediminicola arcticus PAMC 27266(T)	KM576847	92.94	97.74
9	Imtechella halotolerans K1(T)	AJJU01000016	92.93	100
10	Cellulophaga pacifica NBRC 101531(T)	AB681468	92.79	100
11	Sediminicola luteus CNI-3(T)	AB206957	92.57	100
12	Aquimarina macrocephali JAMB N27(T)	JACA01000084	92.49	100
13	Algibacter psychrophilus PAMC 27237(T)	KJ475138	92.48	100
14	Spongiivirga citrea A7G-39(T)	AB920327	92.45	97.44
15	Aquimarina intermedia KMM 6258(T)	AM113977	92.31	100
16	Dokdonia diaphoros MSKK-32(T)	AB198089	92.3	100
17	Dokdonia eikasta PMA-26(T)	AB198088	92.23	100
18	Arenitalea lutea P7-3-5(T)	JQ807811	92.21	100
19	Aquimarina agarivorans HQM9(T)	AFPB01000023	92.21	100
20	Aquimarina addita JC2680(T)	HM475137	92.15	96.75

* 짝 유사성 : Pairwise Similarity

* 완전성 : Completeness

16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 검색결과를 토대로하는 N-J 계통수 제작을 통한 계통발생적 연관성 분석결과, 균주 J9-3은 C. geojensis M-M6와 가장 가까운 연관관계를 형성하고 있는 것으로 분석되었다(도 1 참조). 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 검색결과 및 계통발생적 연관성 결과들을 토대로 균주 J9-3은 Cellulophaga 속(genus)의 한 종(species)으로 판단되었다.

2-2. 균주 J9-3의 한천 분해 활성

균주를 37℃에서 2일간 고체배양한 후 Lugol's Iodine 용액으로 염색하여 균체 주변에 한천이 분해된 것을 확인하였다(도 2 참조). 한천이 포함된 MB 액체배지에서 배양하여 균체를 제거한 상등액에서 한천 분해능이 관찰된 것으로부터 Cellulophaga sp. J9-3은 세포외부로 한천분해효소를 분비한다는 것을 알 수 있었다.

Cellulophaga sp. J9-3 액체배양액으로부터 순수 정제(도 4 참조)된 단백질(겔여과 크로마토그래피 10번 분획물)(도 5 참조)을 규명하기 위해서 N-말단 아미노산 서열을 해독한 결과, S-P(R)-N-N-W-P-T-P-G-G-M(T)-V로 분석되었다(도 6 참조). 분석된 N-말단 아미노산 서열 정보를 토대로 BlastP program으로 상동성 단백질을 검색하였으나 미생물 유래의 어떠한 단백질(효소 포함)도 N-말단에 상동성이 높은 아미노산 서열을 갖고 있지 않은 것으로 검색되었다. 이러한 검색 결과로부터 순수 정제된 한천 분해능을 갖는 단백질은 미생물에서 보고되지 않은 신규한 효소임을 추측할 수 있다.

순수 정제된 신규한 효소의 기질 특이성 분석결과, agarose에 특이적으로 작용하는 한천분해효소임을 확인하였다. 효소반응을 위한 최적 pH 분석 결과, pH 7.0과 7.5에서 최대활성이 관찰되었다(도 7 참조). 효소반응을 위한 최적 온도 분석 결과, 50℃에 최대활성이 관찰되었다(도 8 참조). 온도안정성 분석결과에서는 35℃ 이상의 온도에서는 약 60% 실활률을 보여 일정온도 이상의 조건에서는 불안정한 온도민감성 효소인 것으로 판단된다(도 7 참조). 따라서 이후 효소반응물 분석을 위한 반응조건은 pH 7.5 및 37℃로 하였다. 또한 순수 정제된 효소는 미첨가 반응대비 Co²⁺의 첨가에 의해서 효소반응이 약 6배 증가하는 반면, Cu²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺ 등의 첨가에 의해서 효소반응이 급격히 저해되었고 계면활성제 SDS의 첨가에 의해서 실활되는 것으로 관찰되었다(도 9 참조). 하지만 1가 양이온 Na⁺와 K⁺는 효소활성에 어떠한 영향을 미치지 않았다. Cellulophaga sp. J9-3의 한천분해효소 활성을 위해서는 배양배지 및 효소활성 버퍼를 준비할 때 이러한 연구결과를 충분히 고려해야 할 것으로 판단된다.

정제된 한천분해효소의 판막 크로마토그래피 분석 결과, agarose를 분해하여 최종산물로 테트라머(tetramer)의 한천올리고당(DP4)과 헥사머(hexamer)의 한천올리고당(DP6)을 만드는 것으로 판단된다(도 11 참조). 2종의 최종산물은 액체크로마토그래피/질량분석기를 사용하여 각각 테트라머 및 헥사머임을 확인하였다(도 12 참조). 또한 정제된 한천분해효소의 양을 조절(20배 희석액 또는 50배 희석액)한 반응을 통하여 최종산물(DP4와 DP6)보다 긴 형태의 한천올리고당(DP8, DP10, DP12 등)을 제조할 수 있다(도 11 참조). 이러한 TLC pattern은 일반적인 endo-type 한천분해효소의 가수분해 특성과 일치하였다. 따라서 이러한 연구결과들로부터 순수 정제된 단백질은 agarose를 특이적으로 인식하여 최종산물로 DP4와 DP6로 분해하는 신규한 endo-type agarase 임을 알 수 있었다.

농업생명공학연구원

KACC92201P

20171019

<110> National Institute of Biological Resources <120> A novel Cellulophaga sp., producing new saccharogenic enzyme and use thereof <130> PA-D17374 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1508 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cellulophaga sp. J9-3 <400> 1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaacacatg caagtcgagg 60 ggtaacagag gagcttgctc ttgctgacga ccggcgcacg ggtgcgtaac gcgtatacaa 120 tctgccttgc actaagggat agcccagaga aatttggatt aatatcttat ggtttataat 180 tatggcatca tatttataat aaaggttacg gtgtaagatg agtatgcgtc ccattagttt 240 gttggtaagg taacggctta ccaagactac gatgggtagg ggccctgaga gggggatccc 300 ccacactggt actgagacac ggaccagact cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg 360 acaatggagg agactctgat ccagccatgc cgcgtgcagg aagacggtcc tatggattgt 420 aaactgcttt tatacaggaa gaataaggac tacgtgtagt ctggtgacgg tactgtaaga 480 ataaggaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtcc gagcgttatc 540 cggaattatt gggtttaaag ggtccgtagg cgggctgtta agtcaggggt gaaagtttgc 600 agctcaactg tagaattgcc tttgatactg acggtcttga attattgtga agtggttaga 660 atatgtagtg tagcggtgaa atgcatagat attacataga ataccgattg cgaaggcaga 720 tcactaacaa ttgattgacg ctgatggacg aaagcgtggg tagcgaacag gattagatac 780 cctggtagtc cacgccgtaa acgatggata ctagctgttt ggatttcgat ctgagcggcc 840 aagcgaaagt gataagtatc ccacctgggg agtacgttcg caagaatgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa 960 ccttaccagg gcttaaatgt agattgacag gtttagagat agactttcct tcgggcaatt 1020 tacaaggtgc tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcaggtt aagtcctata 1080 acgagcgcaa cccctgttgt tagttaccag cacattatgg tggggactct agcaagactg 1140 ccggtgcaaa ccgtgaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc ttacgtcctg 1200 ggccacacac gtgctacaat ggtaggtaca gagagcagcc acttagcgat aaggagcgaa 1260 tctataaaac ctatcacagt tcggatcgga gtctgcaact cgactccgtg aagctggaat 1320 cgctagtaat cggatatcag ccatgatccg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaag ccatggaagc tgggggtacc tgaagttcgt caccgcaagg agcgacctag 1440 ggtaaaactg gtaactaggg ctaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa ggtgcggctg 1500 gaacacct 1508

Claims

한천 분해 활성을 갖는 신규 미생물 셀룰로파가(Cellulophaga) sp. J9-3 (수탁번호 KACC92201P).
제 1항의 미생물 또는 상기 미생물의 배양액을 한천이 함유된 시료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 한천 분해 방법.
제 1항의 미생물 또는 상기 미생물의 배양액을 포함하는 한천 분해용 조성물.
제 1항의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 한천분해효소 생산 방법.