CN111235133B - 嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶基因及其克隆表达与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶基因及其克隆表达与应用，所述一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述几丁质酶基因编码上述嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的编码基因编码的酶可有效降解几丁质‑，其编码的几丁质酶活性高，它能有效的降解几丁质，尤其是能够直接降解虾和/或蟹壳粉末获得几丁寡糖，降低工业生产的成本。

Description

嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶基因及其克隆表达与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及嗜几丁质类芽孢杆菌的菌株及其应用。

背景技术

几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质、壳蛋白、壳多糖、明角质等，是以N-乙酰-D-氨基葡萄糖为单体，通过β-1,4糖苷键连接而成的高分子多聚物，是自然界中仅次于纤维素的第二大丰富的天然聚合物，尤其在海洋环境中含量及其丰富。几丁质广泛存在于真菌、细菌、高等植物中，特别是节肢动物如虾、蟹、昆虫等外壳的重要成分，据估计自然界每年生物合成的几丁质约为1×10¹¹t，是一种巨大的可再生资源。

几丁质酶(Chitinase EC 3.2.1.14)是一类重要的糖苷水解酶，细菌、真菌、植物及低等动物均能产生，能够催化几丁质水解产生N-乙酰氨基葡萄糖单体或低分子量几丁寡糖。

中国是海产品大国，每年产生大量的贝壳鱼类下脚料，这些下脚料是富含几丁质的废弃物，从中提取几丁质及其衍生物是将其转化为有用产品的替代方法之一。几丁质降解产物N-乙酰氨基葡萄糖、几丁寡糖和壳聚糖等，在生物医学、营养学、材料科学、生物技术、农业、食品生产、化妆品等领域都具有广阔的市场开发前景。目前这些产品的生产通常采用化学降解法，不仅成本高、能耗高、不易控制，而且对环境污染严重。与化学法相比，从经济和社会的实际情况着眼，微生物分解以其生产工艺简单且成本较低，是理想的几丁质降解方法，具有良好的应用前景。

目前，已报道产几丁质酶的微生物约有46个属近70种，主要有细菌、放线菌和真菌。但是已报道的菌株产几丁质酶量不高、生产效率低、耐受性差，距离工业化生产还有一定的距离。因此，选育耐受性强、几丁质酶活性能高的几丁质酶产生菌株对几丁质酶产业化工作具有重要的指导意义。随着分子生物学技术的不断进步，利用基因工程的手段获得工程菌与野生菌株相比，往往具有表达水平高、产物专一性强、生产的效率高、繁殖周期短、易分离等特点，但构建基因工程菌的难点在于克隆表达载体的构建和异源蛋白的表达。

发明内容

本发明涉及的生物材料样品菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期：2019年7月3日，保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号5楼，保藏编号：GDMCC NO：60710，分类命名为Paenibacilluschitinolyticus。

针对上述现有技术的缺点，本发明的目的之一是提供一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述几丁质酶的制备方法包括以下步骤：

S1:提取菌株的DNA，根据已构建的嗜几丁质类芽孢杆菌转录组注释的几丁质酶基因部分序列，设计引物扩增几丁质酶功能基因，所述引物序列为：

Forward primer:5’-CGGGATCCCGAACCGGCCAAAATCGTCGG-3’，

Reverse primer:5’-CCGCTCGAGGCTGCCTGTTACCACAATATTCG-3’；

应用PCR扩增技术获得所述几丁质酶基因全长序列，测序验证目的序列是否正确；

S2:对所述几丁质酶基因进行克隆与转化；

对几丁质酶基因和质粒pET-22b(+)分别进行双酶切和纯化后，将得到的目的片段和pET-22b(+)载体进行连接，得到重组子pET-22b(+)-CHI；

将重组子pET-22b(+)-CHI转化到E.coli TOP10感受态细胞中构建基因组文库；菌落电泳进行阳性重组子的验证，进一步测序验证目的序列的正确性。

S3:所述几丁质酶的表达与纯化。

将上述重组子pET-22b(+)-CHI转化到E.coli RosettagamiB(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导几丁质酶蛋白的表达，通过SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。确定工程菌经诱导产几丁质酶后，收集菌体，超声破壁收集粗酶液，对重组酶进行分离纯化。

本发明的目的之二是提供一种编码上述几丁质酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

上述几丁质酶的基因在降解几丁质方面的应用。该几丁质酶的基因能有效的降解几丁质。

上述几丁质酶的基因，其编码的几丁质酶能够分解几丁质产生几丁寡糖。

有益效果：本发明一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶的克隆表达及其编码基因与应用，提供一种几丁质酶且提供上述几丁质酶的基因序列及制备方法，另外还提供上述具有良好耐受性几丁质酶在实际工业化中的应用，用来降解几丁质获得几丁寡糖。现有的几丁质酶的酶活大多数在0.10U/mL-1.55U/mL之间，但是本发明的基因编码的几丁质酶的酶活可达12.58U/mL，相比现有的几丁质酶的酶活力提高了数十倍，可迅速降解几丁质，尤其是能够直接降解虾和/或蟹壳粉末获得几丁寡糖，降低工业生产的成本，这不仅克服化学方法对环境造成污染等弊端，而且采用生物的方法降解几丁质制备几丁寡糖具有反应比较温和、可控制、效率高等优势，可产生很好的经济效益和社会效益。本申请提供的几丁质酶的酸碱耐受性十分突出，pH为4.0-10.0范围内稳定性良好。这个效果是我们之前所无法想象的。

附图说明

图1示出了本发明实施例中几丁质酶基因的PCR产物电泳图；

图2示出了本发明实施例中几丁质酶基因的PCR产物纯化检测图；

图3示出了本发明实施例中几丁质酶基因的PCR产物双酶切纯化检测图；

图4示出了本发明实施例中提取质粒pET-22b(+)电泳图；

图5示出了本发明实施例中质粒pET-22b(+)双酶切检测图；

图6示出了本发明实施例中质粒pET-22b(+)切胶回收电泳图；

图7示出了本发明实施例中质粒pET-22b(+)双酶切纯化检测图；

图8示出了本发明实施例中菌落电泳图；

图9示出了本发明实施例中几丁质酶表达SDS-PAGE检测图；

图10示出了本发明实施例中纯化几丁质酶SDS-PAGE检测图；

图11示出了本发明实施例中采用Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶的分离效果评价；

图12示出了本发明实施例中几丁质酶疏水性预测图；

图13示出了本发明实施例中几丁质酶信号肽预测图；

图14示出了本发明实施例中几丁质酶跨膜结构域分析预测图；

图15示出了本发明实施例中几丁质酶二级结构预测图；

图16示出了本发明实施例中几丁质酶蛋白功能位点预测图；

图17示出了本发明实施例中几丁质酶三级结构预测图；

图18示出了本发明实施例中几丁质酶的N-J系统发育树分析；

图19示出了本发明实施例中几丁质酶的最适反应温度；

图20示出了本发明实施例中几丁质酶的温度稳定性；

图21示出了本发明实施例中几丁质酶的最适pH；

图22示出了本发明实施例中几丁质酶的pH稳定性；

图23示出了本发明实施例中胶体几丁质的ESI-MS分析图；

图24示出了本发明实施例中几丁质酶降解几丁质的ESI-MS酶解产物分析。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下面结合图1～24，对本发明请求保护的一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶基因及其克隆表达与应用做详细的介绍。

本发明涉及的生物材料样品菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期：2019年7月3日，保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号5楼，保藏编号：GDMCC NO：60710，分类命名为Paenibacilluschitinolyticus。

一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述几丁质酶的制备方法包括以下步骤：

S1:提取菌株的基因，在本实施例中，本实验室以红树林虾塘养殖基地底泥为样品，采用平板透明圈法对产几丁质酶的菌株进行筛选。使用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取嗜几丁质类芽孢杆菌菌株的DAN。需要说明的是，本发明并不限制提取嗜几丁质类芽孢杆菌菌株的DAN的方法，只要是本领域技术人员能够实现的提取嗜几丁质类芽孢杆菌菌株的DAN的方法，均为本发明要求保护的DAN提取方法。

根据已经构建的嗜几丁质类芽孢杆菌转录组注释的几丁质酶基因部分序列，设计引物扩增几丁质酶功能基因，所述引物序列为：

Forward primer:5’-CGGGATCCCGAACCGGCCAAAATCGTCGG-3’，

Reverse primer:5’-CCGCTCGAGGCTGCCTGTTACCACAATATTCG-3’；

应用PCR扩增技术获得所述几丁质酶基因全长序列；几丁质酶基因PCR扩增体系及程序如下：

反应体系(25μL)：PCR 2×Taq Master Mix 12.5μL，引物1μL，DNA模板1μL，无菌去离子水补足25μL。扩增程序：98℃预热8min；98℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。在PCR结束时，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测产物(图1)，检测合格的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司。

S2:对所述几丁质酶基因进行克隆与转化；

对几丁质酶基因和质粒pET-22b(+)分别进行双酶切和纯化，本发明实施例使用Universal DNA Purification Kit试剂盒纯化PCR样品，琼脂糖凝胶电泳验证目的产物片段大小是否正确(图2)，用限制酶BamHI和XhoI酶切PCR产物，用同样的试剂盒对酶切产物进行纯化，琼脂糖凝胶电泳检测目的产物片段大小是否正确(图3)。采用试剂盒TIANprepMini Plasmid Kit提取质粒pET-22b(+)，琼脂糖凝胶电泳检测pET-22b(+)片段大小是否正确(图4)，并用限制酶BamHI和XhoI酶进行消化，琼脂糖凝胶电泳核实双酶切后的pET-22b(+)片段大小是否正确(图5)，切胶回收酶切产物(图6)，使用EasyPure Quick GelExtravtion Kit试剂盒对双酶切后的载体进行纯化，琼脂糖凝胶电泳再次核实载体片段大小是否正确(图7)。需要说明的是，本发明并不限制纯化PCR样品、酶切PCR产物、提取质粒、酶切质粒的方法，只要是本领域技术人员能够实现的对几丁质酶基因和质粒pET-22b(+)进行纯化和酶切的方法均为本发明要求保护的内容。

将得到的几丁质酶基因片段和pET-22b(+)载体进行连接，得到重组子pET-22b(+)-CHI；在具体实施中，本发明将目的片段和载体pET-22b(+)用T₄ DNA连接酶在16℃进行连接，构建重组子pET-22b(+)-CHI。

将重组子pET-22b(+)-CHI转化到E.coli TOP10感受态细胞中构建基因组文库；通过菌落电泳评估阳性克隆检测是否连接成功，若连接成功，则重组子pET-22b(+)-CHI的片段长度大于pET-22b(+)(图8)。使用TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒提取含有PCR目的基因的重组质粒，并通过自动DNA测序(生工)确认PCR目的基因的序列进一步测序验证目的序列的正确性，是否存在突变。

S3:几丁质酶的表达与纯化。

将上述重组子pET-22b(+)-CHI转化到E.coli RosettagamiB(DE3)感受态细胞中，挑选阳性重组子培养，具体的，挑去单菌落到LB培养基(含100μg·mL^-1Amp)，37℃、200r·min^-1过夜培养。IPTG诱导表达，具体的，将菌液以5％(v/v)的体积比重新接种新鲜10mL的LB培养基(含100μg·mL^-1Amp)中，37℃、200r·min^-1震荡培养至OD₆₀₀至0.8-1时，剩余液体加入IPTG至终浓度0.5mmol·L^-1，进行IPTG诱导8h，目的是诱导重组子的几丁质酶蛋白表达。以IPTG诱导空载体菌液作对照。收集表达蛋白，处理样品并进行10％SDS-PAGE电泳检测，目的是通过SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况，其检测结果如图9所示。确定工程菌经诱导产几丁质酶后，收集菌体进行超声破壁收集粗酶液。具体的，诱导表达结束后，4℃、8000r·min^-1离心5min收集菌体，洗涤菌体并用缓冲液重悬菌体，冰上进行超声破壁。离心收集上清液，即为粗酶液。对分离出的重组几丁质酶进行纯化，具体的使用His-Tagged ProteinPurification Kit(Soluble Protein)试剂盒，采用Ni-NTA亲和层析柱和梯度洗脱的方式，对重组几丁质酶进行分离和纯化,所有纯化步骤在4℃。通过10％SDS-PAGE电泳检测重组酶分离纯化效果，如图10和图11所示。使用Bradford方法测定蛋白的浓度。需要说明的是，本发明并不限制几丁质酶的纯化方法，只要是本领域技术人员能够实现的几丁质酶的纯化方法均为本发明要求保护的方法。

对上述步骤S1～S3制备得到的几丁质酶进行生物信息学分析

具体的，使用在线网址(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对使用上述步骤S1～S3制备得到的几丁质酶基因序列进行分析，寻找开放阅读框共11个，确定为第18家族几丁质酶基因，该基因的编码框由2298个碱基组成，所编码的蛋白质由765个氨基酸组成。

使用(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质的理论相对分子质量为81326.23Da，理论等电点为5.58，正电荷残基总数(Arg+Lys)为53，负电荷残基总数(Asp+Glu)为64，分子式为C₃₆₂₁H₅₅₁₆N₉₄₆O₁₁₅₇S₁₆，消光系数为165170，不稳定系数为20.87，表明稳定性很好，脂肪系数为67.49，总平均亲水性为-0.285，亲水性氨基酸总值较大，表明蛋白为亲水性蛋白。

利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)对CHI蛋白质进行疏水性分析，结果表明chi基因编码的蛋白多肽链第12/13位具有最高的分值为2.444，第83位具有最小值为-2.422，整个多肽链表现为亲水性(图12)。由Singal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析表明其N端的前存在信号肽，其信号肽定位在第1-22个氨基酸上(图13)。

利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对氨基酸序列进行跨膜区域分析，结果表明第1-765段为胞外区，无跨膜螺旋区(图14)。使用在线网站NPS@SOPMA预测蛋白的二级结构表明：α螺旋氨基酸128个，占16.73％；延伸链氨基酸191个，占24.97％；β转角氨基酸有49个，占6.41％；无规则卷曲氨基酸397个，占51.90％；整个结构以延伸链和无规则卷曲为主(图15)。

利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对几丁质酶蛋白进行结构分析，结果显示，所克隆的CHI属于糖苷水解酶18家族，并且具有FN3和CBD_II区域(图16)。

使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)在线对几丁质酶进行同源建模，与PDB数据库蛋白比对，CHI蛋白与(Chitinase ChiA74from Bacillusthuringiensis)的同源性为62.40％(同源性在30％以上建模才具有可信性)，匹配准确度较高(图17)。基于该几丁质酶序列使用MEGA 5.0构建的N-J系统发育树如图18所示，该几丁质酶与类芽孢杆菌属来源的几丁质酶聚在同一个分支，说明他们的亲缘关系比较近。

一种编码所述嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述编码基因在降解几丁质方面的应用。上述编码基因编码的几丁质酶活性高，能有效降解几丁质。

上述编码基因编码的几丁质酶分解几丁质的过程包括如下步骤：

一、菌株的筛选

(一)材料准备

1、样品采集

以红树林虾塘养殖基地底泥为样品，在深度约为15cm处用灭菌勺挖取土样约50g至无菌密封袋中，保存于4℃保温箱中，迅速带回实验室进行下一步处理。

2、培养基

筛选培养基(g/L)：胶体几丁质3.0，胰蛋白胨5.0，盐溶液10.0，琼脂15.0，pH自然，去离子水1L，121℃，高压灭菌20min。

种子培养基(g/L)：几丁质粉末10.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，硫酸镁0.5，K₂HPO₄0.3，KH₂PO₄0.7，去离子水1L，121℃，高压灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：粉末几丁质10.0，(NH₄)₂SO₄2.0；MgSO₄·7H₂O 0.5，K₂HPO₄0.3，KH₂PO₄0.7，FeSO₄ 0.1，pH自然，去离子水1L，121℃，高压灭菌20min。

保藏培养基LB(g/L)：蛋白胨10.0，葡萄糖1.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，去离子水1L，121℃，高压灭菌20min。

需要说明的是，在具体实施时，上述制备培养基的方法并非唯一的，具体配比和浓度等可根据需要进行调整。

(二)菌株的筛选分离与纯化

1、筛选分离

将10.0g样品土样加入90m L无菌水中制备土壤悬液。将土壤悬液经过室温处理30min后，用生理盐水梯度稀释制成10^-1-10^-5倍的样品，然后取10^-3、10^-4及10^-5三个稀释倍数的样品各0.1mL，分别涂布到筛选培养基平板上，30℃倒置恒温培养4～5d后观察。本发明实施例采用平板透明圈法筛选，待菌落周围出现水解圈后，挑取透明圈菌落进行反复划线分离划线以获得纯的单菌落。需要说明的是，本发明并不限制菌株的筛选方法，只要本领域技术人员能够实现的，能够达到筛选出目的菌株的方法，均为本发明要求保护的菌株筛选方法。

2、复筛/纯化

将初筛获得的菌株接种到种子培养基中，然后按照2％的接种量接种于产酶发酵培养基中，于30℃、200r/min下恒温震荡培养6d检测几丁质酶活性。将获得的几丁质菌株接种于斜面培养基培养后于-4℃低温保藏及于30％甘油管-80℃超低温保藏，最终保留产酶活力最高的菌株，其中一株产几丁质酶活力为13.47U/mL，命名为UMBR 0002。

3、上述嗜几丁质类芽孢杆菌的菌株分解几丁质的过程包括如下步骤：

筛选出目的菌株；将初筛获得的菌株接种到种子培养基中得到种子培养液，然后将种子液接种于产酶发酵培养基中检测几丁质酶活力；上述发酵培养基中菌株产生的几丁质酶，可将几丁质内部的β-1，4糖苷键水解，产生几丁寡糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺。

优选地，所述产酶发酵培养基中的碳源可以为虾和/或蟹壳粉末，或其他含有几丁质的碳源，具体实施中如下：

1、在相同的发酵条件下，将基础发酵培养基中的碳源改为虾壳粉末，以几丁质粉末为对阳性照，以不接接菌的发酵液为空白对照。发酵6天检测酶活力和几丁寡糖含量如表1。

2、在相同的发酵条件下，将基础发酵培养基中的碳源改为蟹壳粉末，以几丁质粉末为对阳性照，以不接接菌的发酵液为空白对照。发酵6天检测酶活力和几丁寡糖含量如表1。

3、在相同的发酵条件下，将基础发酵培养基中的碳源改为虾蟹壳粉末混合物，以几丁质粉末为对阳性照，以不接接菌的发酵液为空白对照。发酵6天检测酶活力和几丁寡糖含量如表1。

表1菌株在相同的发酵条件下对不同碳源的产酶情况

从表1可以看出，该菌株产几丁质酶活性较高，从其在相同的发酵条件下对不同碳源进行分解产生的几丁寡糖的含量来看，该菌株能有效的降解几丁质，分解产生的几丁寡糖的含量越高，其几丁质的分解效率越高，同时该菌株能够直接降解虾和/或蟹壳粉末获得几丁寡糖，降低工业生产的成本，这不仅克服化学方法对环境造成污染等弊端，而且采用生物的方法降解几丁质制备几丁寡糖具有反应比较温和、可控制、效率高等优势，可产生很好的经济效益和社会效益。

为验证上述几丁质酶活性及其降解几丁质的效率本实验室进行了如下实验。

1)胶体几丁质的制备

称取10.0g粉末几丁质加入浓盐酸到176mL，搅拌混合均匀，在4℃条件下静置24h，加去离子水1.0L，继续静置24h，8000r·min^-1离心5min，弃上清，用无菌水将沉淀冲洗至中性，最后用去离子水溶解，配制成浓度为25.0g L^-1的胶体几丁质溶液，4℃冰箱保存备用。需要说明的是，上述制备胶体几丁质的方法并非唯一的，具体配比和浓度等可根据需要进行调整。

3)几丁质酶活的检测

取100μL处理好的胶体几丁质溶液(1％)于1.5mL的离心管中，45℃恒温水浴中预热10min，然后向离心管中加入100μL适当稀释的酶液。45℃反应1h，加入300μL DNS试剂终止反应，并在沸水中显色10min。待反应体系冷却至室温后，加入300μL的去离子水，8000r·min^-1离10min，取上清液于OD₅₄₀ nm处测定吸光值。对待测样品以及样品空白分别进行检测。几丁质酶酶活单位定义：45℃水浴保温条件下，每升溶液每分钟释放1μg乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量定为一个酶活力单位。

4)几丁质酶的酶学性性质分析

最适反应温度性研究：在pH为7.0的条件下，分别测定在不同温度(25、30、40、45、50、60、70、80℃)下的重组酶的酶活力，以测得的最高酶活力为100％计算相对酶活力，确定最适反应温度。结果表明最适温度为45℃(图19)；温度稳定性研究：将重组酶分别置于不同温度(25、30、40、45、50、60、70℃)中保温60min和90min，按照标准方法测定酶活力，以未处理组的酶活力为100％，计算各温度条件下几丁质酶的残余酶活百分比。结果表明在25-45℃内保温60min和90min，几丁质酶仍然具有较高的相对酶活(>70％)(图20)。最适反应pH研究：在45℃条件下，分别测定不同pH缓冲溶液(phosphate(pH 2.0–8.0)，glycine–NaOH(pH8.0–11.0))的胶体几丁质底物中的重组酶几丁质酶的活力，以测得的最高酶活力值为100％，计算相对酶活力，确定最适反应pH。结果表明最适pH为5.0(图21)；pH稳定性研究：将重组酶置于不同pH缓冲液中4℃条件下保温5h，在最适pH条件下按照标准方法测定酶活力，以测得的最高酶活力值为100％，计算各pH下几丁质酶的残余酶活百分比。结果表明pH为4.0-10.0范围内几丁质酶稳定性均较好，如图22所示，在pH为8.0时几丁质酶的稳定性最好。

5)几丁质酶解产物分析

200μL酶解反应体系中加入100μL浓度为1％的胶体几丁质和100μL几丁质酶液，45℃水浴锅反应30min。煮沸灭活5min，8000r·min^-1离心10min收集上清液。利用ESI-MS分析酶解产物，如图23和24所示，在正离子的模式下，m/z为244/260、447/463、650的离子峰代表不同聚合度寡糖的钠或钾或氢加合物[(Glc NAc)n-H₂O_n-1+Na/K/H]。从结果可知CHI为一种18家族的内切几丁质酶，随机水解底物生成几丁寡糖。

本发明从红树林虾塘养殖基地底泥来源嗜几丁质类芽孢杆菌中克隆得到几丁质酶基因，为沿海地区来源野生菌株几丁质酶的研究提供理论基础。根据NCBI该菌全基因组序列设计引物调取几丁质酶基因，构建工程菌进行几丁质酶基因片段全长克隆与表达，并对几丁质酶序列进行生信分析，为该几丁质酶的相关研究提供基础。采用Ni-NTA亲和层析柱和梯度洗脱的方式对重组几丁质酶进行纯化，该几丁质酶蛋白的回收率为72.2％，说明采用Ni-NTA亲和层析柱对该几丁质酶蛋白分离是一种有效率的方法。酶学性质表明该几丁质酶的最适pH为5.0，pH为4.0-10.0范围内稳定形良好，在pH为8.0时稳定性最好；该几丁质酶的最适温度为45℃，几丁质酶在25-45℃内保温60min和90min，仍然具有较高的相对酶活(>70％)。因此，该重组酶具有良好的耐受性。事实上，许多工业过程都是在极端的pH值和温度下进行的，此过程中酶活稳定性扮演重要角色。例如，工业虾和蟹壳通常需要酸进行预处理，需要酶具有良好的耐受性。

综上所示，本发明请求保护的几丁质酶具有广泛的pH稳定性和温度稳定性，在工业化应用中非常具有优势。ESI-MS酶解产物分析表明CHI为一种18家族内切几丁质酶，随机水解底物生成几丁寡糖。因此，利用该内切几丁质酶CHI水解几丁质生产几丁寡糖，为其在食品、医药、农业和生物等领域的潜在应用提供有利参考。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广西民族大学广西绿友农生物科技股份有限公司

<120>嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶基因及其克隆表达与应用

<160> 2

<210> 1

<211> 2298

<212> DNA

<213> Chitinase核苷酸序列

<400> 1

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg

atggccatgg atatcggaat taattcggat cccgaaccgg ccaaaatcgt cgggtatttc

acctcttggg gaatatacgg acgcaattat caggtcaagg atatcgacgg ctccaaaatg

actcatttga attatgcttt cgccgacatt tgctggggag gcgtgcacgg caacaactcg

accgacagcc ctaacaagca gacctggtcc tgcacggatt cccacgtgcc tcttcagtct

aagtccgttc caaacggaac gatcgtgctc ggagagcctt gggcggacgt gaacacgccg

tacagcggct attcgtacga agagtgcgat cagaaggcgc tttgcggcaa ttttgcgggt

ctgcgcgacc tgaagaaaaa gaacccgtcg ctcaaaacgc tcatctccgt gggcggatgg

acctggtcta accgtttctc cgacgtagcg gccaatgctg ccacgcgtga aacgttcgcc

aactccgcag tcgaatttat ccgcacctac ggttttgacg gtgtggattt ggactgggag

tatcccgtag cgggcggcct gtccggcaac acgtacagcc ctgcggataa gcagaactac

acgcttctgc tcaaaaaagt ccgtgagaag ctggacgcgg ccggaactgc ggacggcaag

aaatatctct tgaccatcgc gtccggcgcc agtcagaagt ttgccaacaa tacggagctt

tccgaaatcg ccaaaacggt cgactggatc aatatcatga cctatgattt ccacggcggc

tgggaaaaat caaccaatca caacgcggcg ctttacccgg acccgaacga tccgtccacg

ggtgacatca agaagtacaa cacgagcgac gcgatcgata tttacttcca gtcgggcgtc

ccggccaaca agctggtgct cggtcttcct ttctacggca agggctggaa gggctgccct

cccggaccga acaatgacgg ccaataccag acctgcgtag ggggctggga cggtaacgtt

ctgccgaccg gcacatggga cgactgggcg tccggcaaca gcggcacgtt cgattacggc

gatatcatgg ccaattacgt gaacaagaac ggcttcacac gctactggaa cgacacgacc

aaaacgccgt atctgttcaa cccgacaagc ggcacgttca tctcctatga agatacgcaa

tccattgccg ccaaaacggc ttatatcaaa atcaaaggcc tggccggcgc gatgttctgg

gagaccagct ccgactgccg taccagccct aagttctcct gtacgataaa gcttctcgac

aaagtggcgg ccgaccttat gagccctgcc gtaccggata cccaggctcc gacggcggtt

acgaatctgg tctccacggg caaaacatcc acgagcgtca ccttgagctg gaccgcatcg

acggataacg tcggcgttgc cggttatgaa gtgtcctacg gcacgacgaa agtcaacgtg

ccgggaacca ccgccaacat tacgggcctg acggccaata ccgcttatac gttcacggta

aaagcgaaag acgcggcggg caacgtatct gccccggcct ccgtaaccgt cacgacggac

ggcggaacga caaccccgga tacccaggct ccgacagcgg tcacgaatct ggtctccacc

ggcaaaacat cgaccagcgt ggcactgagc tggacggccg cgacggataa catcggcgtt

acgggctatg atgtcactta cggcacgaaa accgtctcca cgacggcgac aagcctgaac

gtgactgacc ttacgccgag cacggcctac acgttcacgg tcaaagcgaa ggatgcggcg

ggcaacgtat ctgccccggc ttccgtaacc gttacgacgg acgcggcgac gaacccgggc

tctccggttc agccgacctt cacggtcacg agcgattggg gaacgggcta caacttcagc

ttctccatca agaacacggg aacgaccccg atcacgaact ggaagctgga attcgactac

acgggaagca tcacatccgt ctgggatgca tccatcgtca gttccgccaa taaccatttc

gtgatcaaag gcgcaggctg gaacaacacg cttcagcctg gagctaccgt tactttcgga

ggagcgggac ttgtcaaagc ccagccgacg aatattgtgg taacaggcag cctcgagcac

caccaccacc accactga

<210> 2

<211> 765

<212> protein

<213> Chitinase氨基酸序列

<400> 2

MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDIGINSD PEPAKIVGYF TSWGIYGRNY QVKDIDGSKM

THLNYAFADI CWGGVHGNNS TDSPNKQTWS CTDSHVPLQS KSVPNGTIVL GEPWADVNTP

YSGYSYEECD QKALCGNFAG LRDLKKKNPS LKTLISVGGW TWSNRFSDVA ANAATRETFA

NSAVEFIRTY GFDGVDLDWE YPVAGGLSGN TYSPADKQNY TLLLKKVREK LDAAGTADGK

KYLLTIASGA SQKFANNTEL SEIAKTVDWI NIMTYDFHGG WEKSTNHNAA LYPDPNDPST

GDIKKYNTSD AIDIYFQSGV PANKLVLGLP FYGKGWKGCP PGPNNDGQYQ TCVGGWDGNV

LPTGTWDDWA SGNSGTFDYG DIMANYVNKN GFTRYWNDTT KTPYLFNPTS GTFISYEDTQ

SIAAKTAYIK IKGLAGAMFW ETSSDCRTSP KFSCTIKLLD KVAADLMSPA VPDTQAPTAV

TNLVSTGKTS TSVTLSWTAS TDNVGVAGYE VSYGTTKVNV PGTTANITGL TANTAYTFTV

KAKDAAGNVS APASVTVTTD GGTTTPDTQA PTAVTNLVST GKTSTSVALS WTAATDNIGV

TGYDVTYGTK TVSTTATSLN VTDLTPSTAY TFTVKAKDAA GNVSAPASVT VTTDAATNPG

SPVQPTFTVT SDWGTGYNFS FSIKNTGTTP ITNWKLEFDY TGSITSVWDA SIVSSANNHF

VIKGAGWNNT LQPGATVTFG GAGLVKAQPT NIVVTGSLEH HHHH

Claims (4)

1.一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:提取菌株GDMCC NO:60710的DNA，根据已构建的嗜几丁质类芽孢杆菌转录组注释的几丁质酶基因部分序列，设计引物扩增几丁质酶功能基因，所述引物序列为：

Forwardprimer:5’-CGGGATCCCGAACCGGCCAAAATCGTCGG-3’，

Reverseprimer:5’-CCGCTCGAGGCTGCCTGTTACCACAATATTCG-3’；

应用PCR扩增技术获得所述几丁质酶基因全长序列,测序验证目的序列是否正确；

S2:对所述几丁质酶基因进行克隆与转化；

对几丁质酶基因和质粒pET-22b(+)分别进行双酶切和纯化后，将得到的目的片段和pET-22b(+)载体进行连接，得到重组子pET-22b(+)-CHI；

将重组子pET-22b(+)-CHI转化到E.coliTOP10感受态细胞中构建基因组文库；菌落电泳进行阳性重组子的验证，进一步测序验证目的序列的正确性；

S3:所述几丁质酶的表达与纯化；

将上述重组子pET-22b(+)-CHI转化到E.coli RosettagamiB(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导几丁质酶蛋白的表达，通过SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况；确定工程菌经诱导产几丁质酶后，收集菌体，超声破壁收集粗酶液，对重组酶进行分离纯化。

3.一种编码权利要求1所述嗜几丁质类芽孢杆菌几丁质酶的基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求3所述的编码基因在降解几丁质方面的应用。