CN109072177A - 用于动物健康和水产养殖的融合蛋白、重组细菌和外孢壁片段 - Google Patents
用于动物健康和水产养殖的融合蛋白、重组细菌和外孢壁片段 Download PDFInfo
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Abstract
提供了融合蛋白、表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员以及来源于该重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。还提供了包含孢子或外孢壁片段的组合物。提供了涉及在动物健康和水产养殖领域中使用重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子和来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段的方法。特别地，提供了使用这种孢子或外孢壁片段来保护动物或水生生物免于病原体的方法。还提供了使用外孢壁片段在水生动物中产生免疫原性应答的方法。还提供了用于保护动物免于病原体的产品，包括粘合贴剂、伤口敷料、用于家畜足浴的插入托盘、蹄绷带、饲料、饲料添加剂和昆虫喷雾器。
Description
技术领域
本申请要求于2016年3月16日提交的美国临时申请序列号62/309,259的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及融合蛋白，表达此类融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，以及来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。本发明还涉及含有重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子或来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段的组合物。还提供了重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子和来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段在动物健康和水产养殖领域中的用途。特别地，本发明涉及使用孢子或外孢壁片段保护动物或水生生物免于病原体的方法。本发明还涉及使用重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段和/或孢子在动物中产生免疫原性应答的方法。还提供了用于保护动物免于病原体的产品，包括粘合贴剂、伤口敷料、用于家畜足浴的插入托盘、蹄绷带、饲料、饲料添加剂和昆虫喷雾器。
背景技术
病原体对生物体的定殖是发生疾病的第一步。目前，没有向动物递送肽、酶或其它蛋白质的有效方法，其允许肽、酶或其它蛋白质保持足够长的活性以有效地破坏细菌、真菌或原生动物的定殖或感染。因此，本领域需要稳定和递送蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽通过抗细菌、抗真菌、抗蠕虫或杀虫活性或通过抑制病原体繁殖来保护动物免于病原体。以前将肽、酶和其它蛋白质引入动物的尝试受到动物体内或动物体上酶、蛋白质和肽的快速降解和有限吸收的阻碍。此外，动物体内蛋白酶的流行；快速代谢；调理作用；构象变化；亚基蛋白的解离；与血液制品形成非共价复合物；以及不稳定侧基的破坏都是使用蛋白质、肽或酶作为动物疾病管理的障碍。
水产养殖是在其生命周期的全部或部分受控条件下养殖水生生物。对水产养殖生产的兴趣正在上升，因为限制许多海产品种的野生收获可能会减少野生收获的海产品供应。水产养殖种植者可以更容易地保持稳定的产品供应。养殖海产品的规模和数量也可能更均匀，从而减缓价格波动。选择性育种可用于增强抗病性，增加生长速率或促进其它所需性状(例如更好的饲料转化)。尽管水产养殖有益，但与野生收获相比，水产养殖也存在一些缺点，例如集约化生产场所的废物处理(导致附近水道富营养化)，饲料来源导致的致癌化学品危险程度，过量使用抗生素和生物控制剂，以及养殖鱼类产品中对疾病爆发的损失。因此，水产养殖业因其在病毒、细菌、真菌、寄生虫和其它未确诊和新出现的病原体引起的疾病和问题中的份额而不堪重负。目前用于疾病管理的水产养殖实践包括使用化学杀虫剂和农药以及通常对鱼本身有毒的其它常见化学品。漂白剂、碘伏和苯扎氯铵通常用于水产养殖中以减少疾病和生物膜形成两者。水产养殖中的许多微生物病原体导致鱼和虾的毒性作为主要问题，并且作为次要问题还形成生物膜，使得控制这些病原体对于继续看到养殖鱼的产量增加是至关重要的。因此，本领域需要控制水产养殖中病原体的方法。
当微生物在潮湿环境中粘附到某些物体的表面并开始繁殖时，形成生物膜。微生物通过分泌细胞外聚合物质而形成几乎任何物体表面的附着物。生物膜通常由许多微生物的混合物组成，包括细菌种类，以及真菌、藻类、酵母和原生动物。已经充分证明，生物膜内的细菌对抗生素和杀生物剂的抗性比其游离形式高数百至数千倍。在生物膜中，假设抗生素渗透性差、营养限制和生长缓慢，适应性应激反应和持久性细胞的形成构成多层防御，使得它们很难消除。由于这些原因，生物膜通过在宿主组织(例如慢性伤口，骨质疏松症，囊性纤维化，耳炎)、水产养殖系统中的表面(例如管道，罐，甚至鱼鳃)、医疗设备(例如导管，经皮装置)以及医疗设备(例如血液透析机，呼吸机，分流器，医院表面)上形成而在动物健康方面存在问题。因此，本领域需要防止生物膜形成或一旦形成后从表面除去生物膜。
在用于治疗动物外部疾病(例如脚腐病或乳腺炎)的方法中，通常的做法是应用抗菌溶液。该方法的问题在于对进行挤奶或剪切的畜群或设施的未受影响成员的污染。此外，需要重复施用并且可能发生抗生素抗性或甚至无效。乳腺炎是一种影响全世界大量奶牛的疾病，使用抗生素并不是一种理想的解决方案。它们不仅影响收集的牛奶(停药数天，抗生素残留物污染，酸奶和奶酪加工相关的问题)，抗生素也没有降低乳腺炎的发病率。因此，本领域需要用于治疗诸如足腐病和乳腺炎的疾病的改进方法。
控制昆虫载体是重要的，因为昆虫是动物疾病的主要传播者。媒介传播的疾病对动物健康和引人注目的经济含义具有显著的负面影响。如果不通过病媒控制进行干预，危险疾病将在全球迅速发展。目前的载体控制方法包括栖息地控制，减少与载体的接触，通过捕食者的生物控制，通过杀虫剂或杀幼虫剂的化学控制，细菌毒素或植物化合物。目前寻找长效杀虫剂和寻找新农药以抗击物种的目标对全球问题是有效的。消除这些昆虫载体可以减轻疾病传播并降低与它们传播的疾病相关的死亡率。因此，本领域还需要通过杀死昆虫载体来保护动物免于病原体的方法。
发明内容
提供了融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和至少一种目标蛋白质或肽。目标蛋白质或肽可包含抗体，抗体片段，组蛋白，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽，腺苷三磷酸双磷酸酶，藻酸盐裂解酶，分散素B，DNA酶，内切壳多糖酶，外切壳多糖酶，蛋白酶K，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，a Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白，Cyt1Aa蛋白，AiiA，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶或其任何组合。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和LfcinB。LfcinB包含与SEQ IDNO：212具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和LysM。LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和β-1,3-葡聚糖酶。β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和Cry21A蛋白。Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
提供了表达任何融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员。
还提供了来源于任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。
提供了包含载体和本文所述的任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的组合物。
还提供了包含载体和来源于本文所述的任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段的组合物。
提供了药物组合物。药物组合物包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了疫苗组合物。该组合物包含药学上可接受的载体。疫苗组合物还包含第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段。第二类外孢壁片段与第一类外孢壁片段不同。第一类和第二类外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，突变或蛋白质的表达增加导致具有外孢壁的蜡状芽孢杆菌家族成员孢子更容易从孢子中除去。第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段中的至少一个包含融合蛋白。融合蛋白包含抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了另一种疫苗组合物。该组合物包含药学上可接受的载体。该组合物还包含表达第一融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。第一融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使第一融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。该组合物还包含外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
提供了另一种疫苗组合物。该组合物包含药学上可接受的载体。该组合物还包含第一免疫原或抗原。该组合物还包含外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
提供了一种在动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括向动物施用任何疫苗组合物。
提供了一种保护动物免于病原体的方法。该方法包括向动物、动物环境或病原体施用表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
提供了另一种保护动物免于病原体的方法。该方法包括向动物、动物环境或病原体施用外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了一种组合物。该组合物包含用于水产养殖可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了一种保护水生生物免于病原体的方法。该方法包括在水产养殖系统中培养水生生物。将表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子引入水产养殖系统。融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。水生生物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵，红藻，褐藻或其任何组合。
提供了另一种保护水生生物免于病原体的方法。该方法包括在水产养殖系统中培养水生生物。将外孢壁片段引入水产养殖系统。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列，外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。水生生物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵，红藻，褐藻或其任何组合。
提供了粘合贴剂和伤口敷料。提供了包含药物组合物的粘合贴剂或伤口敷料。药物组合物包含药学上可接受的载体和表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，粘合贴剂或伤口敷料可包含药物组合物，其包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了一种用于牲畜足浴的插入托盘。插入托盘包含表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。孢子固定在插入托盘的内表面上。
可选地或另外地，插入托盘包含外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。外孢壁片段固定在插入托盘的内表面上。
提供了一种蹄绷带。蹄绷带包含药物组合物。药物组合物包含药学上可接受的载体和表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，蹄绷带包含药物组合物，其包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了饲料和饲料添加剂。饲料或饲料添加剂包含外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白，该融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了通过杀死病原体的昆虫或螨虫(arachnid)载体来保护动物免于病原体的方法。该方法包括使昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫与重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子接触。重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白。融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，通过杀死病原体的昆虫或螨虫载体来保护动物免于病原体的方法包括使昆虫或螨虫载体的昆虫或螨虫载体的幼虫与外孢壁片段接触。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了杀虫或杀螨组合物。该组合物包含载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种蛋白质或肽，其对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性。融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了一种昆虫喷雾器。昆虫雾化器包含载体和表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种蛋白质或肽，其对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性。融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，昆虫雾化器可包含载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种蛋白质或肽，其对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性。融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
提供了一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括向水生动物施用外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。通过将水生动物浸入包含外孢壁片段的溶液中，将外孢壁片段施用于水生动物。
可选地或另外地，在水生动物中产生免疫原性应答的方法包括向水生动物施用孢子。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。通过将水生动物浸入包含孢子的溶液中，将孢子施用于水生动物。
提供了另一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括向水生动物施用外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。水生动物选自鱼类，两栖动物，甲壳类动物，软体动物及其任何组合。
提供了另一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括向水生动物施用外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。向水生动物施用外孢壁片段导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体(Xenohaliotis californiensis)，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌(Branchiomyces sanguinis)，坏死鳃霉菌(Branchiomyces demigrna)，鱼孢霉(Icthyophous hoferi)及其任何组合的病原体。
可选地或另外地，在水生动物中产生免疫原性应答的方法包括向水生动物施用孢子。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。向水生动物施用孢子导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌，鱼孢霉及其任何组合的病原体。
本发明的特征在所附权利要求和下面标题为“实施方式”的部分中提供的实施方式列表中进一步限定。其它目的和特征将部分地显而易见，并且部分地在下文中指出。
附图说明
图1A和1B显示炭疽杆菌Sterne菌株BclA氨基端部分的氨基酸序列与蜡样芽胞杆菌家族成员多种外孢壁蛋白的相应区域的比对。
图2显示含有与mCherry报告基因连接的多种外孢壁蛋白的融合蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁上的表达的示例性荧光显微镜结果。
图3是显示外孢壁片段和缺失了外孢壁的蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的透射电镜显微图，其中所述孢子利用具有CotE基因敲除突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备得到。
图4是SDS-PAGE凝胶图，其显示蛋白质分子量标准(泳道1)和来自外孢壁片段的蛋白(泳道2)，所述蛋白利用具有CotE基因敲除突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备得到。
图5提供了阐述来自具有CotE基因敲除突变的蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段中酸性磷酸酶的酶活性的数据。
图6提供了透射电镜显微图，其显示：(A)苏云金芽孢杆菌BT013A的完整孢子，其被附着的外孢壁包围；(B)苏云金芽孢杆菌BT013A ExsY敲除菌株的孢子，其具有分开的外孢壁；和(C)苏云金芽孢杆菌BT013A CotE敲除菌株的孢子，其具有分开的外孢壁。
相应的附图标记在整个附图中表示相应的部件。
定义
当本文使用冠词“一”，“一个”，“一种”，“该”和“所述”时，除非另有说明，否则它们表示“至少一个”或“一个或多个”。
术语“动物”包括任何非人动物以及人。例如，在本文中使用术语“动物”时，动物可以是哺乳动物(例如人，猴，绵羊，山羊，奶牛，猪，鹿，羊驼，野牛，骆驼，驴，马，骡子，牦牛，驯鹿，骆驼，兔子，狗，猫，白鼬，沙鼠，豚鼠，仓鼠，老鼠，兔子或老鼠)，鸟类(例如鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，鸽子，鸽子，鸵鸟，鸸鹋或野鸡)，鱼类(例如爱好鱼，鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼或鲟鱼)，两栖动物(例如青蛙，蟾蜍，蝾螈或火蜥蜴)，爬行动物(例如蛇，蜥蜴，鬣蜥，鳄鱼，短吻鳄，乌龟或陆龟)，甲壳类动物(例如河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹或小龙虾)，软体动物(例如贻贝，蛤蜊，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼或章鱼)，蠕虫(例如蚯蚓，线虫，扁虫，蛔虫，绦虫或吸虫)，昆虫(例如蜜蜂，瓢虫，蝴蝶，蚕，苍蝇，甲虫或其任何幼虫)，珊瑚或海绵。
本文所用的术语“水产养殖”是指养殖水生生物，特别是鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵，红藻，褐藻。如本文所用的术语“水产养殖”不包括水生植物的养殖。
如本文所用的术语“蜡状芽孢杆菌家族成员”是指能够产生外孢壁的任何芽孢杆菌属物种。因此，蜡状芽孢杆菌家族细菌包括炭疽芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，蕈状芽胞杆菌，假蕈状芽孢杆菌，撒氏芽孢杆菌(Bacillus samanii)，盖氏芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)，韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephensis)和托氏芽孢杆菌(Bacillus toyoiensis)。蜡状芽孢杆菌家族成员在本领域中也称为“蜡状芽孢杆菌一类”。
术语“包含”，“包括”和“具有”旨在是包含性的，并且意味着可能存在除所列元素之外的其它元素。
如本文所用的术语“融合蛋白”是指具有多肽序列的蛋白质，所述多肽序列包含来源于两种或更多种分开的蛋白质的序列。融合蛋白可以通过将编码第一多肽的全部或部分的核酸分子与编码第二多肽的全部或部分的核酸分子连接在一起以产生核酸序列来产生，所述核酸序列在表达时产生单个核酸序列。具有来源于每种原始蛋白质的功能特性的多肽。
本文所用的术语“爱好鱼”指的是保存在私人或公共水族馆、花园池塘或其它围栏中作为宠物鱼、观赏鱼和/或用于娱乐目的的任何鱼(相对于养殖用于食品或制造产品的鱼类)。
如本文所用，术语“灭活”或“失活”是指重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的灭活意味着孢子不能发芽，或孢子可发芽但是受到损害，使得发芽不会导致活细菌。术语“部分灭活”或“部分失活”是指一定百分比的孢子被灭活，但一些孢子保留了发芽和恢复活的复制状态的能力。术语“遗传失活”是指通过孢子DNA的突变使重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子失活，导致孢子完全或部分失活。术语“物理灭活”和“化学灭活”是指使用任何物理或化学方法灭活孢子，例如通过热处理，γ辐射，X射线辐射，UV-A辐射，UV-B辐射或用溶剂如戊二醛，甲醛，过氧化氢，乙酸，漂白剂，氯仿或苯酚，或其任何组合。
如本文所用的术语“非疫苗方法”是指不需要使用疫苗、抗原或免疫原的方法。相反，在不使用疫苗、抗原或免疫原的情况下实现了保护动物免于病原体的所需效果。
如本文所用，术语“保护动物免于病原体的蛋白质或肽”和“保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽”包括预防或治疗受病原体感染的动物或水生生物的任何蛋白质或肽。保护动物或水生生物免于病原体的蛋白质或肽可直接或间接作用于病原体。保护动物或水生生物免于病原体的蛋白质或肽的保护机制包括但不限于病原体细胞壁的裂解，病原体对动物的建立或定植的阻止，病原体中的细胞对细胞通讯阻断，动物中免疫应答的激活(但不诱导抗体应答)，和/或增加动物对病原体的识别。保护动物或水生生物免于病原体的蛋白质或肽还包括蛋白质或肽，其阻止或抑制生物膜的形成或促进生物膜在动物或水生生物体上或在动物或水生生物环境内的表面上的溶解。
本文所述的细菌所用的术语“重组”包括与相同类型的野生型细菌相比具有任何遗传修饰的细菌，包括已被修饰以缺失基因或部分基因的细菌(例如具有基因“敲除”的细菌)，以及已被修饰以表达外源肽或蛋白质的细菌。
如本文所用的术语“靶向序列”是指多肽序列，当作为较长多肽或蛋白质的一部分存在时，导致较长多肽或蛋白质定位于特定亚细胞位置。本文描述的靶向序列导致蛋白质定位于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
具体实施方式
I.用于在蜡状芽孢杆菌家族成员中表达的融合蛋白和表达此类融合蛋白的重组
蜡状芽孢杆菌家族成员
本发明涉及融合蛋白，表达此类融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，以及来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。本发明还涉及含有重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的组合物或来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段，以及重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子和来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段在动物健康和水产养殖领域中的用途。还提供了含有孢子或外孢壁片段的各种产品，包括含有孢子或外孢壁片段的粘合贴剂或伤口敷料，包含孢子或外孢壁片段的用于家畜足浴的插入托盘，包含孢子或外孢壁片段的蹄绷带，包含孢子或外孢壁片段的饲料和饲料添加剂，以及含有孢子或外孢壁片段的昆虫雾化器。
孢子表达融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和至少一种目标蛋白质或肽(例如保护动物免于病原体的蛋白质或肽，保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽，对动物病原体的昆虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫活性的蛋白质或肽，或抗原或免疫原)。当在蜡状芽孢杆菌家族成员细菌中表达时，这些融合蛋白靶向孢子的外孢壁层并且物理定向使得目标蛋白质或肽展示在孢子外部。
该芽孢杆菌外孢壁展示(BEMD)系统可用于将肽、酶和其它蛋白质递送至动物、水生生物或动物病原体的昆虫载体。另外，如下文进一步描述的，可以修饰BEMD系统，使得可以从孢子中除去重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁，产生含有融合蛋白的外孢壁片段。外孢壁片段还可用于在无细胞制剂中将肽、酶和其它蛋白质递送至动物、水生生物或动物病原体的昆虫载体。
A.用于使目标蛋白质或肽靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢 壁蛋白和外孢壁蛋白片段
为了便于参考，如表1所示，描述了可用于使目标蛋白质或肽靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白和外孢壁蛋白片段的氨基酸序列(例如保护动物免于病原体的蛋白质或肽或保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽)以及它们的SEQ IDNO。
表1.用于使目标蛋白质或肽靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的肽和蛋白序列
AA＝氨基酸
*炭疽杆菌Sterne菌株BclA与苏云金芽孢杆菌BclA具有100％序列同一性。因此，SEQ ID NO：1、2及95还分别表示苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-41、全长苏云金芽孢杆菌BclA以及苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-196。同样，SEQ ID NO：96还表示甲硫氨酸残基加苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸20-35。
**蕈状芽孢杆菌假设蛋白TIGR03720与蕈状芽孢杆菌假设蛋白WP003189234具有100％序列同一性。因此，SEQ ID NO：57和58还分别表示蕈状芽孢杆菌假设蛋白WP003189234的氨基酸1-136和全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白WP003189234。
芽孢杆菌属于杆状细菌。蜡状芽孢杆菌细菌家族包括能够产生外孢壁的任何芽孢杆菌属物种。因此，蜡状芽孢杆菌家族细菌包括炭疽芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，蕈状芽胞杆菌，假蕈状芽孢杆菌，撒氏芽孢杆菌，盖氏芽孢杆菌，韦氏芽孢杆菌和托氏芽孢杆菌。在压力环境条件下，蜡状芽孢杆菌家族细菌经历孢子形成并形成椭圆形内生孢子，其可以长时间保持休眠状态。内生孢子的最外层被称为外孢壁，并且包括被毛发状突起的外部绒毛包围的基底层。毛发状绒毛上的细丝主要由胶原样糖蛋白BclA形成，而基底层由许多不同的蛋白质组成。另一种胶原相关蛋白BclB也存在于外孢壁中并暴露于蜡状芽孢杆菌家族成员的内生孢子上。BclA是表面绒毛的主要成分，已显示附着于外孢壁，其氨基末端(N末端)位于基底层，其羧基末端(C末端)从孢子向外延伸。
先前发现来自BclA和BclB的N-末端区域的某些序列可用于使肽或蛋白质靶向蜡状芽孢杆菌家族成员内生孢子的外孢壁(参见美国专利申请公开号2010/0233124和2011/0281316，和Thompson等人，使BclA和BclB蛋白靶向炭疽芽孢杆菌孢子表面，MolecularMicrobiology 70(2):421-34(2008))。还发现炭疽芽孢杆菌的BetA/BAS3290蛋白定位于外孢壁。美国专利申请公开号2016/0031948中描述了可掺入融合蛋白并用于使目标肽或蛋白质靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁的其它靶向序列，以及外孢壁蛋白和外孢壁蛋白片段，其全部内容通过引用并入本文。
特别地，已发现来自炭疽芽孢杆菌Sterne菌株的BclA的氨基酸20-35足以靶向外孢壁。图1A和1B显示了BclA(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-41与几个其它蜡状芽孢杆菌家族外孢壁蛋白和具有相关序列的蜡状芽孢杆菌家族蛋白的相应N-末端区域的序列比对。从图1A和1B可以看出，在对应于BclA的氨基酸20-41的区域中的所有蛋白质之间存在高度同源性的区域。然而，在这些序列中，对应于BclA的氨基酸36-41的氨基酸含有二级结构，并且对于融合蛋白定位于外孢壁不是必需的。BclA的保守靶向序列区(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)在图1A和1B中以粗体显示，并且对应于定位于外孢壁所需的最小靶向序列。跨越靶向序列内BclA的氨基酸25-35的更高度保守区域在图1A和1B的序列中加下划线，并且是ExsFA/BxpB/ExsFB和同源物的识别序列，其指导和组装在外孢壁的表面上的所述蛋白质。图1A中的SEQ ID NO：3、5和7的氨基酸序列分别是炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BetA/BAS3290的氨基酸1-33，然后是炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BAS4623的氨基酸2-43，以及炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BclB的氨基酸1-34。(对于BAS4623，发现用蛋氨酸取代天然蛋白质中在位置1处存在的缬氨酸导致更好的表达。)从图1A中可以看出，这些序列中的每一个都含有对应于BclA的氨基酸20-35的保守区域(SEQ ID NO：1；以粗体显示)，和对应于BclA的氨基酸20-35的更高度保守区域(加下划线)。
来自蜡状芽孢杆菌家族成员的其它蛋白质也含有保守的靶向区域。特别地，在图1A和1B中，SEQ ID NO：9是炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BAS1882的氨基酸1-30，SEQ ID NO：11是韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物的氨基酸1-39，SEQ ID NO：13是韦氏芽孢杆菌KBAB43572基因产物的氨基酸1-39，SEQ ID NO：15是蜡状芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽的氨基酸1-49，SEQ ID NO：17是蜡状芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽的氨基酸1-33，SEQ ID NO：19是蜡状芽孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663的氨基酸1-39，SEQ ID NO：21是韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸1-39，SEQ ID NO：23是韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸1-30，SEQ ID NO：25是韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸1-30，SEQ ID NO：27是韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-36，SEQ ID NO：29是蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸1-39，SEQ IDNO：31是蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1-30，SEQ ID NO：33是蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-21，SEQ ID NO：35是苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-22，SEQ ID NO：43是蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP_69652的氨基酸1-35，SEQ ID NO：45是蜡状芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717的氨基酸1-41，SEQ ID NO：47是蜡状芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192的氨基酸1-49，SEQ ID NO：49是蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP87353的氨基酸1-38，SEQ ID NO：51是蜡状芽孢杆菌外孢壁肽02112369的氨基酸1-39，SEQ ID NO：53是蜡状芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770的氨基酸1-39，SEQ ID NO：55是苏云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525的氨基酸1-36，SEQ ID NO：57是芽孢杆菌假设蛋白TIGR03720的氨基酸1-136，SEQ ID NO：59是蜡状芽孢杆菌ATCC 10987胶原三螺旋重复结构域蛋白的氨基酸1-36，SEQ ID NO：61是蜡状芽孢杆菌E33L胶原样蛋白的氨基酸1-39，SEQ ID NO：63是韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-41，SEQ ID NO：65是苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam假设蛋白BALH_2230的氨基酸1-30，SEQ IDNO：67是蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-33，SEQ ID NO：69是蜡状芽孢杆菌胶原三螺旋重复的氨基酸1-44，SEQ ID NO：71是蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-38，SEQ ID NO：73是蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK1835的氨基酸1-30，SEQ ID NO：75是韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-48，SEQ ID NO：77是蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-30，SEQ IDNO：79是蜡状芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋白BC4725的氨基酸1-39，SEQ ID NO：81是蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476的氨基酸1-44，SEQ ID NO：83是炭疽芽孢杆菌str.'AmesAncestor'含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-40，SEQ ID NO：85是苏云金芽孢杆菌serovarkonkukian str.97-27BclA蛋白的氨基酸1-34，SEQ ID NO：87是蜡状芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白的氨基酸1-34，SEQ ID NO：89是蜡状芽孢杆菌ATCC14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-34，SEQ ID NO：91是蜡状芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列的氨基酸1-99，SEQ ID NO：93是韦氏芽孢杆菌假设蛋白ER45_27600的氨基酸1-136。如图1A和1B所示，这些蛋白质的每个N末端区域含有与BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1)保守的区域，以及对应于BclA的氨基酸25-35的更高度保守区域。
包含氨基酸20-35的BclA的任何部分可用于使融合蛋白靶向外孢壁。此外，全长外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可用于使融合蛋白靶向外孢壁。因此，包括氨基酸20-35的全长BclA或BclA片段可用于靶向外孢壁。例如，全长BclA(SEQ ID NO：2)或缺乏羧基末端的BclA的中型片段如SEQ ID NO：95(BclA的氨基酸1-196)可用于使融合蛋白靶向外孢壁。中等片段如SEQ ID NO：95的片段具有比全长BclA更少的二级结构，并且已发现其适合用作靶向序列。靶向序列还可包含更短的BclA部分，其包括氨基酸20-35，例如SEQ ID NO：1(BclA的氨基酸1-41)，SEQ ID NO：1的氨基酸1-35，SEQ ID NO：1的氨基酸20-35，或SEQ ID NO：96(与BclA的氨基酸20-35连接的甲硫氨酸残基)。甚至更短的BclA片段(其仅包括一些氨基酸20-35)也表现出使融合蛋白靶向外孢壁的能力。例如，靶向序列可包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-31，SEQ ID NO：1的氨基酸22-33，或SEQ ID NO：1的氨基酸20-31。
可选地，BetA/BAS3290，BAS4623，BclB，BAS1882，KBAB4 2280基因产物，KBAB43572基因产物，蜡状芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽，蜡状芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽，蜡状芽孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663，韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白，韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363，韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131，韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原，蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660，蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540，蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510，苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白，蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP_69652，蜡状芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717，蜡状芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192，蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP87353，蜡状芽孢杆菌外孢壁肽02112369，蜡状芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770，苏云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525，蕈状芽胞杆菌假设蛋白TIGR03720，蜡状芽孢杆菌ATCC10987胶原三螺旋重复结构域蛋白，蜡状芽孢杆菌E33L胶原样蛋白，韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原，苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam假设蛋白BALH_2230，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原，蜡状芽孢杆菌胶原三螺旋重复，蜡状芽孢杆菌ATCC14579含有三螺旋重复的胶原，蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK1835，韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋白BC4725，蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476，炭疽杆菌str.'AmesAncestor'含有三螺旋重复的胶原，苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str.97-27BclA蛋白，蜡状芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原蛋白，蜡状芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列，或韦氏芽孢杆菌假设蛋白ER45_27600的任何部分，其包含对应的氨基酸BclA的氨基酸20-35，可用作靶向序列。
从图1A中可以看出，BetA/BAS3290的氨基酸12-27，BAS4623的氨基酸23-38，BclB的氨基酸13-28，BAS1882的氨基酸9-24，KBAB4 2280基因产物的氨基酸18-33，KBAB4 3572基因产物的氨基酸18-33，蜡状芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽的氨基酸28-43，蜡状芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽的氨基酸12-27，蜡状芽孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663的氨基酸18-33，韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33，韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24，韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24，韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸15-30，蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18-33，蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24，蕈状芽胞杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-15，苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-16，蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP_69652的氨基酸14-29，蜡状芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717的氨基酸20-35，蜡状芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192的氨基酸28-43，蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP87353的氨基酸17-32，蜡状芽孢杆菌外孢壁肽02112369的氨基酸18-33，蜡状芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770的氨基酸18-33，苏云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525的氨基酸15-30和蕈状芽胞杆菌假设蛋白TIGR03720的氨基酸115-130对应于BclA的氨基酸20-35。从图1B可以看出，蜡状芽孢杆菌ATCC 10987胶原三螺旋重复结构域蛋白的氨基酸15-30，蜡状芽孢杆菌E33L胶原蛋白的氨基酸18-33，韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸20-35，苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam假设蛋白BALH_2230的氨基酸9-24，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸12-27，蜡状芽孢杆菌胶原三螺旋重复的氨基酸23-38，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸17-32，蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK1835的氨基酸9-24，韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸27-42，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸9-24，蜡状芽孢杆菌ATCC 14579的假设蛋白BC4725的氨基酸18-33，蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476的氨基酸23-38，炭疽杆菌str.'Ames Ancestor'含有三螺旋重复的胶原的氨基酸19-34，苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str.97-27BclA蛋白的氨基酸13-28，蜡状芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白的氨基酸13-28，蜡状芽孢杆菌ATCC14579含有三螺旋重复的胶原的氨基酸13-28，蜡状芽孢杆菌前孢子前导肽部分序列的氨基酸78-93和韦氏芽孢杆菌假设蛋白ER45_27600的氨基酸115-130对应于BclA的氨基酸20-35。因此，包括上面列出的相应氨基酸的这些蛋白质的任何部分可用作靶向序列。
此外，包含BclA的氨基酸20-35或任何上面列出的相应氨基酸的任何氨基酸序列可用作靶向序列。
因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-35，SEQ ID NO：1的氨基酸20-35，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：1的氨基酸22-31，SEQ ID NO：1的氨基酸22-33，或SEQ ID NO：1的氨基酸20-31。可选地，靶向序列由SEQ ID NO：1的氨基酸1-35，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：1的氨基酸20-35或SEQ ID NO：96组成。可选地，靶向序列可由SEQ ID NO：1的氨基酸22-31，SEQ ID NO：1的氨基酸22-33或SEQ ID NO：1的氨基酸20-31组成。可选地，外孢壁蛋白可包含全长BclA(SEQ ID NO：2)，或外孢壁蛋白片段可包含缺乏羧基末端的BclA的中型片段，例如SEQ ID NO：59(BclA的氨基酸1-196)。可选地，外孢壁蛋白片段可以由SEQID NO：59组成。
靶向序列可包含SEQ ID NO：1的氨基酸2-35；SEQ ID NO：1的氨基酸5-35；SEQ IDNO：1的氨基酸8-35；SEQ ID NO：1的氨基酸10-35；或SEQ ID NO：1的氨基酸15-35。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：3的氨基酸1-27，SEQ ID NO：3的氨基酸12-27或SEQID NO：3，或者外孢壁蛋白可包含全长BetA/BAS3290(SEQ ID NO：4)。还发现与BetA/BAS3290的氨基酸12-27连接的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQID NO：97。靶向序列还可包含SEQ ID NO：3的氨基酸14-23，SEQ ID NO：3的氨基酸14-25，或SEQ ID NO：3的氨基酸12-23。
靶向序列可包含SEQ ID NO：3的氨基酸2-27；SEQ ID NO：3的氨基酸5-27；SEQ IDNO：3的氨基酸8-27；或SEQ ID NO：3的氨基酸10-27。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：5的氨基酸1-38，SEQ ID NO：5的氨基酸23-38，或SEQ ID NO：5，或者外孢壁蛋白可包含全长BAS4623(SEQ ID NO：6)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：5的氨基酸2-38；SEQ ID NO：5的氨基酸5-38；SEQ IDNO：5的氨基酸8-38；SEQ ID NO：5的氨基酸10-38；SEQ ID NO：5的氨基酸15-38；或SEQ IDNO：5的氨基酸20-38。
可选地，靶向序列可包含SEQ ID NO：7的氨基酸1-28，SEQ ID NO：7的氨基酸13-28或SEQ ID NO：7，或者外孢壁蛋白可包含全长BclB(SEQ ID NO：8)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：7的氨基酸2-28；SEQ ID NO：7的氨基酸5-28；SEQ IDNO：7的氨基酸8-28；或SEQ ID NO：7的氨基酸10-28。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-24，SEQ ID NO：9的氨基酸9-24或SEQID NO：9，或者外孢壁蛋白可包含全长BAS1882(SEQ ID NO：10)。与BAS1882的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：105。
靶向序列可包含SEQ ID NO：9的氨基酸2-24；SEQ ID NO：9的氨基酸5-24；或SEQID NO：9的氨基酸8-24。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：11的氨基酸1-33，SEQ ID NO：11的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：11，或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB42280基因产物(SEQ ID NO：12)。与韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物的氨基酸18-33连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：98。
靶向序列可包含SEQ ID NO：11的氨基酸2-33；SEQ ID NO：11的氨基酸5-33；SEQID NO：11的氨基酸8-33；SEQ ID NO：11的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：11的氨基酸15-33。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：13的氨基酸1-33，SEQ ID NO：13的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：13，或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB43572基因产物(SEQ ID NO：14)。与韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基因产物的氨基酸18-33连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：99。
靶向序列可包含SEQ ID NO：13的氨基酸2-33；SEQ ID NO：13的氨基酸5-33；SEQID NO：13的氨基酸8-33；SEQ ID NO：13的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：13的氨基酸15-33。
可选地，靶向序列可包含SEQ ID NO：15的氨基酸1-43，SEQ ID NO：15的氨基酸28-43，或SEQ ID NO：15，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽(SEQID NO：16)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：15的氨基酸2-43；SEQ ID NO：15的氨基酸5-43；SEQID NO：15的氨基酸8-43；SEQ ID NO：15的氨基酸10-43；SEQ ID NO：15的氨基酸15-43；SEQID NO：15的氨基酸20-43；或SEQ ID NO：15的氨基酸25-43。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：17的氨基酸1-27，SEQ ID NO：17的氨基酸12-27或SEQ ID NO：17，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽(SEQ ID NO：18)。与蜡状芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽的氨基酸12-27连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：100。
靶向序列可包含SEQ ID NO：17的氨基酸2-27；SEQ ID NO：17的氨基酸5-27；SEQID NO：17的氨基酸8-27；或SEQ ID NO：17的氨基酸10-27。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：19的氨基酸1-33，SEQ ID NO：19的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：19，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663(SEQID NO：20)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：19的氨基酸2-33；SEQ ID NO：19的氨基酸5-33；SEQID NO：19的氨基酸8-33；SEQ ID NO：19的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：19的氨基酸15-33。
可选地，靶向序列包含SEQ ID NO：21的氨基酸1-33，SEQ ID NO：21的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：21，或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白(SEQ ID NO：22)。与韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：101。
靶向序列可包含SEQ ID NO：21的氨基酸2-33；SEQ ID NO：21的氨基酸5-33；SEQID NO：21的氨基酸8-33；SEQ ID NO：21的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：21的氨基酸15-33。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：23的氨基酸1-24，SEQ ID NO：23的氨基酸9-24或SEQ ID NO：23，或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363(SEQ ID NO：24)。与韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：102。
靶向序列可包含SEQ ID NO：23的氨基酸2-24；SEQ ID NO：23的氨基酸5-24；或SEQID NO：23的氨基酸8-24。
靶向序列包含SEQ ID NO：25的氨基酸1-24，SEQ ID NO：25的氨基酸9-24或SEQ IDNO：25，或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131(SEQ IDNO：26)。与韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：103。
靶向序列可包含SEQ ID NO：25的氨基酸2-24；SEQ ID NO：25的氨基酸5-24；或SEQID NO：25的氨基酸8-24。
可选地，靶向序列包含SEQ ID NO：27的氨基酸1-30，SEQ ID NO：27的氨基酸15-30或SEQ ID NO：27，或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：28)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：27的氨基酸2-30；SEQ ID NO：27的氨基酸5-30；SEQID NO：27的氨基酸8-30；或SEQ ID NO：27的氨基酸10-30。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：29的氨基酸1-33，SEQ ID NO：29的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：29，或者外孢壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660(SEQ ID NO：30)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：29的氨基酸2-33；SEQ ID NO：29的氨基酸5-33；SEQID NO：29的氨基酸8-33；SEQ ID NO：29的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：29的氨基酸15-33。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：31的氨基酸1-24，SEQ ID NO：31的氨基酸9-24或SEQ ID NO：31，或者外孢壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540(SEQ ID NO：32)。与蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：104。
靶向序列可包含SEQ ID NO：31的氨基酸2-24；SEQ ID NO：31的氨基酸5-24；或SEQID NO：31的氨基酸8-24。
可选地，靶向序列包含SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：33的氨基酸1-15，或者外孢壁蛋白包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510(SEQ ID NO：34)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：35的氨基酸1-16，或者外孢壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白(SEQ ID NO：36)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：43的氨基酸1-29，SEQ ID NO：43的氨基酸14-29或SEQID NO：43，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP_69652(SEQ ID NO：44)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：43的氨基酸2-29；SEQ ID NO：43的氨基酸5-29；SEQID NO：43的氨基酸8-29；或SEQ ID NO：43的氨基酸10-29。
可选地，靶向序列可包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-35，SEQ ID NO：45的氨基酸20-35，或SEQ ID NO：45，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717(SEQ ID NO：46)。与蜡状芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717的氨基酸20-35连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO：106。
靶向序列可包含SEQ ID NO：45的氨基酸2-35；SEQ ID NO：45的氨基酸5-35；SEQID NO：45的氨基酸8-35；SEQ ID NO：45的氨基酸10-35；或SEQ ID NO：45的氨基酸15-35。
靶向序列可包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-43，SEQ ID NO：47的氨基酸28-43，或SEQ ID NO：47，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192(SEQ IDNO：48)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：47的氨基酸2-43；SEQ ID NO：47的氨基酸5-43；SEQID NO：47的氨基酸8-43；SEQ ID NO：47的氨基酸10-43；SEQ ID NO：47的氨基酸15-43；SEQID NO：47的氨基酸20-43；或SEQ ID NO：47的氨基酸25-43。
靶向序列可包含SEQ ID NO：49的氨基酸1-32，SEQ ID NO：49的氨基酸17-32，或SEQ ID NO：49，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌假设蛋白WP87353(SEQ ID NO：50)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：49的氨基酸2-32；SEQ ID NO：49的氨基酸5-32；SEQID NO：49的氨基酸8-32；SEQ ID NO：49的氨基酸10-32；或SEQ ID NO：49的氨基酸15-32。
可选地，靶向序列可包含SEQ ID NO：51的氨基酸1-33，SEQ ID NO：51的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：51，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌外孢壁肽02112369(SEQ IDNO：52)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：51的氨基酸2-33；SEQ ID NO：51的氨基酸5-33；SEQID NO：51的氨基酸8-33；SEQ ID NO：51的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：51的氨基酸15-33。
靶向序列可包含SEQ ID NO：53的氨基酸1-33，SEQ ID NO：53的氨基酸18-33，或SEQ ID NO：53，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770(SEQ IDNO：54)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：53的氨基酸2-33；SEQ ID NO：53的氨基酸5-33；SEQID NO：53的氨基酸8-33；SEQ ID NO：53的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：53的氨基酸15-33。
可选地，靶向序列可包含SEQ ID NO：55的酸1-30，SEQ ID NO：55的氨基酸15-30，或SEQ ID NO：55，或者外孢壁蛋白可包含全长苏云金假设蛋白质YP006612525(SEQ ID NO：56)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：55的氨基酸2-30；SEQ ID NO：55的氨基酸5-30；SEQID NO：55的氨基酸8-30；或SEQ ID NO：55的氨基酸10-30。
靶向序列还可包含SEQ ID NO：57的氨基酸1-130，SEQ ID NO：57的氨基酸115-130，或SEQ ID NO：57，或者外孢壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白TIGR03720(SEQID NO：58)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：57的氨基酸2-130；SEQ ID NO：57的氨基酸5-130；SEQID NO：57的氨基酸10-130；SEQ ID NO：57的氨基酸20-130；SEQ ID NO：57的氨基酸30-130；SEQ ID NO：57的氨基酸40-130；SEQ ID NO：57的氨基酸50-130；SEQ ID NO：57的氨基酸60-130；SEQ ID NO：57的氨基酸70-130；SEQ ID NO：57的氨基酸80-130；SEQ ID NO：57的氨基酸90-130；SEQ ID NO：57的氨基酸100-130；或SEQ ID NO：57的氨基酸110-130。
靶向序列可包含SEQ ID NO：59的氨基酸1-30；或SEQ ID NO：59；或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌ATCC 10987胶原三螺旋重复结构域蛋白(SEQ ID NO：60)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：59的氨基酸2-30；SEQ ID NO：59的氨基酸4-30；或SEQID NO：59的氨基酸6-30。
靶向序列可包含SEQ ID NO：61的氨基酸1-33；SEQ ID NO：61的氨基酸18-33；或SEQ ID NO：61；或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌E33L胶原样蛋白(SEQ ID NO：62)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：61的氨基酸2-33；SEQ ID NO：61的氨基酸5-33；SEQID NO：61的氨基酸10-33；或SEQ ID NO：61的氨基酸15-33。
靶向序列可包含SEQ ID NO：63的氨基酸1-35；或SEQ ID NO：63；或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：64)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：63的氨基酸2-35；SEQ ID NO：63的氨基酸5-35；SEQID NO：63的氨基酸8-35；SEQ ID NO：63的氨基酸10-35；或SEQ ID NO：63的氨基酸15-35。
靶向序列可包含SEQ ID NO：65的氨基酸1-24；SEQ ID NO：65的酸9-24；SEQ IDNO：65；或SEQ ID NO：107；或者外孢壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam假设蛋白BALH_2230(SEQ ID NO：66)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：65的氨基酸2-24；或SEQ ID NO：65的氨基酸5-24。
靶向序列可包含SEQ ID NO：67的酸1-27；SEQ ID NO：67的氨基酸12-27；或SEQ IDNO：67；或者外孢壁蛋白可包含全长的蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：68)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：67的氨基酸2-27；SEQ ID NO：67的氨基酸5-27；或SEQID NO：67的氨基酸10-27。
靶向序列可包含SEQ ID NO：69的氨基酸1-38；SEQ ID NO：69的氨基酸23-38；或SEQ ID NO：69；或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌胶原三螺旋重复(SEQ ID NO：70)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：69的氨基酸2-38；SEQ ID NO：69的氨基酸5-38；SEQID NO：69的氨基酸10-38；或SEQ ID NO：69的氨基酸15-38。
外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原(SEQ IDNO：72)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：73，或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK1835(SEQ ID NO：74)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：75的氨基酸1-42；SEQ ID NO：75的氨基酸27-42；或SEQ ID NO：75；或者外孢壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：76)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：75的氨基酸2-42；SEQ ID NO：75的氨基酸5-42；SEQID NO：75的氨基酸10-42；SEQ ID NO：75的氨基酸15-42；SEQ ID NO：75的氨基酸20-42；或SEQ ID NO：75的氨基酸25-42。
靶向序列可包含SEQ ID NO：77的氨基酸1-24；SEQ ID NO：77的氨基酸9-24；或SEQID NO：77；或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：78)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：77的氨基酸2-24；或SEQ ID NO：77的氨基酸5-24；
外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋白BC4725(SEQ ID NO：80)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：81的氨基酸1-38；SEQ ID NO：81的氨基酸23-38；或SEQ ID NO：81；或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476(SEQ IDNO：82)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：81的氨基酸2-38；SEQ ID NO：81的酸5-38；SEQ IDNO：81的氨基酸10-38；SEQ ID NO：81的氨基酸15-38；或SEQ ID NO：81的氨基酸20-38。
靶向序列可包含SEQ ID NO：83的氨基酸1-34；或SEQ ID NO：83；或者外孢壁蛋白可包含全长炭疽杆菌str.'Ames Ancestor'含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：84)。
外孢壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str.97-27BclA蛋白(SEQ ID NO：86)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：87的氨基酸1-28；SEQ ID NO：87的氨基酸13-28；或SEQ ID NO：87；或者外孢壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白(SEQID NO：88)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：87的氨基酸2-28；SEQ ID NO：87的氨基酸5-28；或SEQID NO：87的氨基酸10-28。
靶向序列可包含SEQ ID NO：89的氨基酸1-28；或SEQ ID NO：89；或者外孢壁蛋白可包含全长的蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO：90)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：89的氨基酸2-28；SEQ ID NO：89的氨基酸5-28；或SEQID NO：89的氨基酸10-28
靶向序列可包含SEQ ID NO：91的氨基酸1-93；或SEQ ID NO：91；或者外孢壁蛋白可包含蜡状芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列(SEQ ID NO：92)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：91的氨基酸2-93；SEQ ID NO：91的氨基酸10-93；SEQID NO：91的氨基酸20-93；SEQ ID NO：91的氨基酸30-93；SEQ ID NO：91的氨基酸40-93；SEQID NO：91的氨基酸50-93；或SEQ ID NO：91的氨基酸60-93。
靶向序列可包含SEQ ID NO：93的氨基酸1-130；或SEQ ID NO：93；或者外孢壁蛋白可包含韦氏芽孢杆菌假设蛋白ER45_27600，部分序列(SEQ ID NO：94)。
靶向序列可包含SEQ ID NO：93的氨基酸2-130；SEQ ID NO：93的氨基酸10-130；SEQ ID NO：93的氨基酸20-130；或SEQ ID NO：93的氨基酸30-130。
此外，如下文提供的实施例中所示，已发现短于BclA的氨基酸20-35的序列可用于使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。特别地，BclA的氨基酸20-33，BclA的氨基酸20-31，BclA的氨基酸21-33或BclA的氨基酸23-31可用于使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。因此，靶向序列可以由SEQ ID NO：1的氨基酸20-33，SEQ IDNO：1的氨基酸20-31，SEQ ID NO：1的氨基酸21-33或SEQ ID NO：1的氨基酸23-31组成。图1A和1B中所示的任何SEQ ID NO的相应区域也可用于使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。“相应区域”是指当序列与SEQ ID NO：1比对时，如图1A和1B所示，与SEQ IDNO：氨基酸比对的其它氨基酸序列的区域是那些序列的“相应区域”。因此，例如，SEQ IDNO：3的氨基酸12-25，SEQ ID NO：5的氨基酸23-36，SEQ ID NO：7的氨基酸13-26等可用于使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁，因为这些区域与SEQ ID NO：1的氨基酸20-33比对，如图1A所示。
BclA的氨基酸20-35内甚至更短的区域也可用于使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。特别地，可以使用包括SEQ ID NO：1的氨基酸25-30的任何氨基酸序列或来自图1A和1B中所示的任何序列的相应氨基酸。技术人员将认识到，从SEQ ID NO：1的氨基酸25-30或图1A和1B中所示的任何序列的相应区域开始，可以将另外的氨基酸添加到氨基末端、羧基末端或氨基末端和羧基末端两者以产生靶向序列，该靶向序列可有效地使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
另外，从图1A和1B中的序列比对可以容易地看出，虽然BclA的氨基酸20-35是保守的，并且氨基酸25-35是更保守的，但是在该区域可以发生一定程度的变异，而不影响靶向序列使蛋白质靶向外孢壁的能力。图1A和1B列出了每个序列的每个相应氨基酸与BclA的氨基酸20-35(“20-35％同一性”)和BclA的氨基酸25-35(“25-35％同一性”)的百分比同一性。因此，例如，与BclA的氨基酸20-35相比，BetA/BAS3290的相应氨基酸约81.3％相同，BAS4623的相应氨基酸约50.0％相同，BclB的相应氨基酸约为43.8％相同，BAS1882的相应氨基酸约62.5％相同，KBAB4 2280基因产物的相应氨基酸约81.3％相同，并且KBAB4 3572基因产物的相应氨基酸约81.3％相同。其余序列在该区域上的序列同一性列于图1A和1B中。
相对于BclA的氨基酸25-35，BetA/BAS3290的相应氨基酸约90.9％相同，BAS4623的相应氨基酸约72.7％相同，BclB的相应氨基酸约54.5％相同，BAS1882的相应氨基酸约72.7％相同，KBAB4 2280基因产物的相应氨基酸约90.9％相同，并且KBAB4 3572基因产物的相应氨基酸约81.8％相同。其余序列在该区域上的序列同一性列于图1A和1B中。
因此，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
可选地，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。靶向序列还可以由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约62％的同一性，其中与SEQ ID NO：1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少68％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％的同一性，其中与SEQ ID NO：1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％的同一性，其中与SEQ ID NO：1的氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。可选地，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。
技术人员将认识到，上述序列的变体也可用作靶向序列，只要靶向序列包含BclA的氨基酸20-35，BetA/BAS3290，BAS4263，BclB，BAS1882，KBAB42280基因产物，或KBAB 3572基因产物的相应氨基酸，或存在包含与BclA的氨基酸20-35和25-35的任何上述序列同一性的序列。
缺少与BclA的氨基酸25-35具有同源性的区域的某些蜡状芽孢杆菌家族外孢壁蛋白也可用于使肽或蛋白质靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。特别地，融合蛋白可包含：包含SEQ ID NO：108(蕈状芽胞杆菌InhA)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：109(炭疽芽孢杆菌Sterne BAS1141(ExsY))的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：110(炭疽芽孢杆菌SterneBAS1144(BxpB/ExsFA))的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：111(炭疽芽孢杆菌Sterne BAS1145(CotY))的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：112(炭疽杆菌Sterne BAS1140)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：113(炭疽芽孢杆菌H9401ExsFB)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：114(苏云金芽孢杆菌HD74InhA1)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：115(蜡状芽孢杆菌ATCC 10876ExsJ)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：116(蜡状芽孢杆菌ExsH)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：117(炭疽芽孢杆菌Ames YjcA)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：118(炭疽芽孢杆菌YjcB)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：119(炭疽杆菌Sterne BclC)的外孢壁蛋白，一种包含SEQ IDNO：120(苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str.97-27酸性磷酸酶)的外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO：121(苏云金芽孢杆菌HD74InhA2)的外孢壁蛋白，或包含SEQ ID NO：122(蕈状芽胞杆菌InhA3)的外孢壁蛋白。在本文所述的融合蛋白中加入包含任何SEQ ID NO：108-122的外孢壁蛋白将导致靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
此外，与上述任何全长外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段具有高度序列同一性的外孢壁蛋白也可用于使肽或蛋白质靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。因此，融合蛋白可包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。可选地，融合蛋白可包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122中的任一个具有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性的外孢壁蛋白
在表达本文所述任何融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子形成期间，靶向基序、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段被孢子外孢壁组装机器识别并导向外孢壁，导致融合蛋白的目标部分的蛋白质或肽展示在孢子外部。
如通过下文提供的实施例进一步说明的，使用不同的靶向序列允许控制融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员孢子表面上的表达水平。使用本文所述的某些靶向序列将导致融合蛋白的更高水平表达，而使用其它靶向序列将导致融合蛋白在孢子表面上的更低水平表达。
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X为任何氨基酸。
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残基。
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以在紧接靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一个氨基酸的氨基酸位置处或对应于SEQ ID NO：1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
B.用于在重组蜡状芽孢杆菌家族成员中表达的融合蛋白
本发明涉及融合蛋白，其包含至少一种目标蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白片段或外孢壁蛋白，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。还提供了表达此类融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员和来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。提供了含有重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子或来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段的组合物。此外，本发明的方法和产品涉及使用包含至少一种目标蛋白质或肽的融合蛋白(例如保护动物免于病原体的蛋白质或肽，保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽，对动物病原体的昆虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫活性的蛋白质或肽，或抗原或免疫原)，以及靶向序列、外孢壁蛋白片段或外孢壁蛋白，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在本文所述的任何融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器中，融合蛋白可包含：(1)靶向序列，其包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-35的靶向序列；(3)包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-35的靶向序列；(4)包含SEQ ID NO：1的靶向序列；(5)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)包含SEQ ID NO：1的氨基酸2-35的靶向序列；(7)包含SEQ ID NO：1的氨基酸5-35的靶向序列；(8)包含SEQ IDNO：1的氨基酸8-35的靶向序列；(9)包含SEQ ID NO：1的氨基酸10-35的靶向序列；(10)包含SEQ ID NO：1的氨基酸15-35的靶向序列；(11)包含SEQ ID NO：3的氨基酸1-27的靶向序列；(12)包含SEQ ID NO：3的氨基酸12-27的靶向序列；(13)包含SEQ ID NO：3的靶向序列；(14)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：4具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)包含SEQ IDNO：3的氨基酸2-27的靶向序列；(16)包含SEQ ID NO：3的氨基酸5-27的靶向序列；(17)包含SEQ ID NO：3的氨基酸8-27的靶向序列；(18)包含SEQ ID NO：3的氨基酸10-27的靶向序列；(19)包含SEQ ID NO：5的氨基酸1-38的靶向序列；(20)包含SEQ ID NO：5的氨基酸23-38的靶向序列；(21)包含SEQ ID NO：5的靶向序列；(22)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：6具有至少85％同一性的氨基酸序列；(23)包含SEQ ID NO：5的氨基酸2-38的靶向序列；(24)包含SEQ ID NO：5的氨基酸5-38的靶向序列；(25)包含SEQ ID NO：5的氨基酸8-38的靶向序列；(26)包含SEQ ID NO：5的氨基酸10-38的靶向序列；(27)包含SEQ ID NO：5的氨基酸15-38的靶向序列；(28)包含SEQ ID 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NO：110具有至少85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：112具有至少85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：113具有至少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：114具有至少85％同一性的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：115具有至少85％同一性的氨基酸序列；(243)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白，其包含与SEQID NO：117具有至少85％同一性的氨基酸序列；(245)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：118具有至少85％同一性的氨基酸序列；(246)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：119具有至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：120具有至少85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：121具有至少85％同一性的氨基酸序列；(249)包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-31的靶向序列；(250)包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-33的靶向序列；(251)包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-31的靶向序列；(252)包含SEQ IDNO：3的氨基酸14-23的靶向序列；(253)包含SEQ ID NO：3的氨基酸14-25的靶向序列；(254)包含SEQ ID NO：3的氨基酸12-23的靶向序列；(255)包含SEQ ID NO：59的氨基酸1-30的靶向序列；(256)包含SEQ ID NO：59的靶向序列；(257)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60具有至少85％同一性的氨基酸序列；(258)包含SEQ ID NO：59的氨基酸2-30的靶向序列；(259)包含SEQ ID NO：59的氨基酸4-30的靶向序列；(260)包含SEQ ID NO：59的氨基酸6-30的靶向序列；(261)包含SEQ ID NO：61的氨基酸1-33的靶向序列；(262)包含SEQ ID NO：61的氨基酸18-33的靶向序列；(263)包含SEQ ID 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NO：69的靶向序列；(294)外孢壁蛋白，其包含与SEQID NO：70具有至少85％同一性的氨基酸序列；(295)包含SEQ ID NO：69的氨基酸2-38的靶向序列；(296)包含SEQ ID NO：69的氨基酸5-38的靶向序列；(297)包含SEQ ID NO：69的氨基酸10-38的靶向序列；(298)包含SEQ ID NO：69的氨基酸15-38的靶向序列；(299)包含SEQID NO：72的外孢壁蛋白；(300)包含SEQ ID NO：73的靶向序列；(301)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：74具有至少95％同一性的氨基酸序列；(302)包含SEQ ID NO：75的氨基酸1-42的靶向序列；(303)包含SEQ ID NO：75的氨基酸27-42的靶向序列；(304)包含SEQ ID NO：75的靶向序列；(305)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：76具有至少85％同一性的氨基酸序列；(306)包含SEQ ID NO：75的氨基酸2-42的靶向序列；(307)包含SEQ ID NO：75的氨基酸5-42的靶向序列；(308)包含SEQ ID NO：75的氨基酸10-42的靶向序列；(309)包含SEQ IDNO：75的氨基酸15-42的靶向序列；(310)包含SEQ ID NO：75的氨基酸20-42的靶向序列；(311)包含SEQ ID NO：75的氨基酸25-42的靶向序列；(312)包含SEQ ID NO：7的氨基酸1-24的靶向序列；(313)包含SEQ ID NO：7的氨基酸9-24的靶向序列；(314)包含SEQ ID NO：77的靶向序列；(315)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：78具有至少85％同一性的氨基酸序列；(316)包含SEQ ID NO：7的氨基酸2-24的靶向序列；(317)包含SEQ ID NO：7的氨基酸5-24的靶向序列；(318)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：80具有至少85％同一性的氨基酸序列；(319)包含SEQ ID NO：81的氨基酸1-38的靶向序列；(320)包含SEQ ID NO：81的氨基酸23-38的靶向序列；(321)包含SEQ ID NO：81的靶向序列；(322)外孢壁蛋白，其包含与SEQ IDNO：82具有至少85％同一性的氨基酸序列；(323)包含SEQ ID NO：81的氨基酸2-38的靶向序列；(324)包含SEQ ID NO：81的氨基酸5-38的靶向序列；(325)包含SEQ ID NO：81的氨基酸10-38的靶向序列；(326)包含SEQ ID NO：81的氨基酸15-38的靶向序列；(327)包含SEQ IDNO：81的氨基酸20-38的靶向序列；(328)包含SEQ ID NO：83的氨基酸1-34的靶向序列；(329)包含SEQ ID NO：83的靶向序列；(330)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：84具有至少85％同一性的氨基酸序列；(331)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：86具有至少85％同一性的氨基酸序列；(332)包含SEQ ID NO：87的氨基酸1-28的靶向序列；(333)包含SEQ ID NO：87的氨基酸13-28的靶向序列；(334)包含SEQ ID NO：87的靶向序列；(335)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：88具有至少85％同一性的氨基酸序列；(336)包含SEQ ID NO：87的氨基酸2-28的靶向序列；(337)包含SEQ ID NO：87的氨基酸5-28的靶向序列；(338)包含SEQ IDNO：87的氨基酸10-28的靶向序列；(339)包含SEQ ID NO：89的氨基酸1-28的靶向序列；(340)包含SEQ ID NO：89的靶向序列；(341)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：90具有至少85％同一性的氨基酸序列；(342)包含SEQ ID NO：89的氨基酸2-28的靶向序列；(343)包含SEQ ID NO：89的氨基酸5-28的靶向序列；(344)包含SEQ ID NO：89的氨基酸10-28的靶向序列；(345)包含SEQ ID NO：91的氨基酸1-93的靶向序列；(346)包含SEQ ID NO：91的靶向序列；(347)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：92具有至少85％同一性的氨基酸序列；(348)包含SEQ ID NO：91的氨基酸2-93的靶向序列；(349)包含SEQ ID NO：91的氨基酸10-93的靶向序列；(350)包含SEQ ID NO：91的氨基酸20-93的靶向序列；(351)包含SEQ ID 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例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。
例如，靶向序列可以由以下组成：(a)由16个氨基酸组成的氨基酸序列，其与SEQID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(b)SEQ ID NO：1的氨基酸1-35；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸20-35；(d)SEQ ID NO：1；(e)SEQ ID NO：96；或(f)SEQ ID NO：120。
靶向序列可以由这些实施例中所述的氨基酸序列组成。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122具有至少90％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122具有至少95％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122具有至少98％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122具有至少99％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122具有100％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少90％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少95％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少98％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少99％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有100％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X为任何氨基酸。
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残基。
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以在紧接靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一个氨基酸的氨基酸位置处或对应于SEQ ID NO：1的氨基酸20的靶向序列的位置处进一步包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
上述融合蛋白中的目标蛋白质或肽可包含保护动物免于病原体的蛋白质或肽。
上述融合蛋白中的目标蛋白质或肽可包含保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽。
上述融合蛋白中的目标蛋白质或肽可包含对动物病原体的昆虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫活性的蛋白质或肽。
上述融合蛋白中的目标蛋白质或肽可包含抗原或免疫原。
提供了融合蛋白。在任何融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以是本文所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。
提供了融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和至少一种目标蛋白质或肽。目标蛋白质或肽可包含抗体，抗体片段，组蛋白，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽，腺苷三磷酸双磷酸酶，藻酸盐裂解酶，分散素B，DNA酶，内切壳多糖酶，外切壳多糖酶，蛋白酶K，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，a Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白，Cyt1Aa蛋白，AiiA，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶或其任何组合。
DNA酶可包含DNA酶I。
内切壳多糖酶可包含几丁质酶C。
外切壳多糖酶包含几丁质酶D。
感兴趣的蛋白质或肽可包含抗体，抗体片段，组蛋白，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽，腺苷三磷酸双磷酸酶，藻酸盐裂解酶，分散素B，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素或其任何组合。
例如，目标蛋白质或肽可包含腺苷三磷酸双磷酸酶。
当酶包含腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含由Rrop1基因编码的马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶。该马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：204提供。
可选地，当酶包含腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含由YtkD基因编码的枯草芽孢杆菌腺苷三磷酸双磷酸酶。该枯草芽孢杆菌腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：205提供。
在目标蛋白质或肽包含腺苷三磷酸双磷酸酶的情况下，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少70％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少75％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少80％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少85％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少90％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少95％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少98％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少99％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有100％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少70％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少75％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少80％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少85％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少90％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少95％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少98％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有至少99％序列同一性的氨基酸。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：205具有100％序列同一性的氨基酸。
目标蛋白质或肽可包含分散素B.
目标蛋白质或肽可包含内切壳多糖酶、外切壳多糖酶或其组合。
例如，内切壳多糖酶可包含具有SEQ ID NO：206提供的氨基酸序列的苏云金芽孢杆菌内切壳多糖酶。
在目标蛋白质或肽包含内切壳多糖酶的情况下，内切壳多糖酶可包含与SEQ IDNO：206具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有100％序列同一性的氨基酸序列。
目标蛋白质或肽可包含AiiA内酯酶。
例如，AiiA内酯酶可包含苏云金芽孢杆菌B184AiiA或假蕈状芽孢杆菌B30AiiA。苏云金芽孢杆菌B184AiiA的氨基酸序列由SEQ ID NO：207提供。假蕈状芽孢杆菌B30AiiA的氨基酸序列由SEQ ID NO：208提供。
当目标蛋白质或肽包含AiiA内酯酶时，AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少70％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少75％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少80％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少85％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少90％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少95％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少98％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有至少99％序列同一性的氨基酸。
AiiA内酯酶可包含与SEQ ID NO：207或208具有100％序列同一性的氨基酸。
目标蛋白质或肽可包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的说明性氨基酸序列由SEQ ID NO：209和210提供。
在目标蛋白质或肽包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的情况下，丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有100％序列同一性的氨基酸序列。
在目标蛋白质或肽包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的情况下，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有100％序列同一性的氨基酸序列。
目标蛋白质或肽可包含杀蚊毒素。
例如，杀蚊毒素可包含Mtx样杀蚊毒素或Bin样杀蚊毒素。
Mtx样杀蚊毒素可包含Mtx1。
例如，Mtx1可包含球形芽孢杆菌Mtx1。球形芽孢杆菌Mtx1的氨基酸序列由SEQ IDNO：211提供。
当目标蛋白质或肽包含Mtx1时，Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少70％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少75％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少80％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少85％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少90％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少95％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少98％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少99％同一性的氨基酸序列。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有100％同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和LfcinB。LfcinB包含与SEQ IDNO：212具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
例如，LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有100％序列同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和LysM。LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少70％同一性的氨基酸序列。
例如，LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
LysM包含与SEQ ID NO：213具有100％序列同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和β-1,3-葡聚糖酶。β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少70％同一性的氨基酸序列。
例如，β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少75％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少80％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少85％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少90％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少95％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少98％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少99％同一性的氨基酸序列。
β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有100％同一性的氨基酸序列。
提供了另一种融合蛋白。融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和Cry21A蛋白。Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
例如，Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
Cry21A蛋白包含与SEQ ID NO：215具有至少100％序列同一性的氨基酸序列。
C.用于制备融合蛋白的方法
可使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制备本文所述的任何融合蛋白。例如，编码目标蛋白质或肽的基因(例如编码保护动物免于病原体的蛋白质或肽的基因)可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增，并连接到编码任何上述靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的DNA上，以形成编码融合蛋白的DNA分子。编码融合蛋白的DNA分子可以克隆到任何合适的载体中，例如质粒载体。载体适当地包含多克隆位点，其中可以容易地插入编码融合蛋白的DNA分子。载体还适当地含有可选择标记，例如抗生素抗性基因，使得可以容易地鉴定和分离转化载体、转染载体或与载体交配的细菌。当载体是质粒时，质粒也适当地包含复制起点。可选地，编码融合蛋白的DNA可以整合到蜡状芽孢杆菌家族成员或孢子形成细菌宿主的染色体DNA中。
D.融合蛋白中可包含的标签、标记和接头
本文所述的任何融合蛋白还可包含不是靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段或目标蛋白质或肽的一部分的其它多肽序列。例如，融合蛋白可包括标签或标记以促进融合蛋白(例如多组氨酸标签或荧光蛋白，例如GFP或YFP)的纯化或可视化，或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的可视化。
使用本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白和外孢壁蛋白片段的融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁上的表达由于这些序列的氨基末端缺乏二级结构而得到增强，这允许用于融合蛋白的天然折叠和活性的保留。通过在靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段、孢子外壳蛋白和目标蛋白质或肽之间包含短的氨基酸接头，可以进一步增强适当的折叠。
因此，本文所述的任何融合蛋白可包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段与目标蛋白质或肽之间的氨基酸接头。
接头可包含聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。也可以使用包含丙氨酸和甘氨酸残基两者的混合物的接头。
例如，在靶向序列包含SEQ ID NO：1的融合蛋白中，融合蛋白可具有以下结构之一：
无接头：SEQ ID NO：1–POI
丙氨酸接头：SEQ ID NO：1–An–POI
甘氨酸接头：SEQ ID NO：1–Gn–POI
混合的丙氨酸和甘氨酸接头：SEQ ID NO：1–(A/G)n–POI
其中An，Gn和(A/G)n分别是任何数量的丙氨酸，任何数量的甘氨酸，或任何数量的丙氨酸和甘氨酸的混合物。例如，n可以是1至25，并且优选是6至10。当接头包含丙氨酸和甘氨酸残基的混合物时，可以使用甘氨酸和丙氨酸残基的任何组合。在上述结构中，“POI”代表目标蛋白质或肽。
可选地或另外地，接头可包含蛋白酶识别位点。包含蛋白酶识别位点允许在暴露于识别蛋白酶识别位点的蛋白酶时靶向去除目标蛋白质或肽。
E.用于表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员宿主
提供了表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员。融合蛋白可以是上文第I.B部分中描述的任何融合蛋白。
还提供了来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。外孢壁片段可包含上文第I.B部分中描述的任何融合蛋白。允许收集外孢壁片段的突变和制备外孢壁片段的方法在下面的第III部分中描述。
此外，本发明的组合物、方法和产品涉及使用表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，或来源于包含融合蛋白的这种孢子的外孢壁片段。融合蛋白可以是本文所述的任何融合蛋白。
任何蜡状芽孢杆菌家族成员可用作融合蛋白表达的宿主，所述融合蛋白包含靶向序列、外孢壁蛋白或外胚层蛋白片段，其使融合蛋白靶向蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
重组蜡状芽孢杆菌家族成员可包含能够产生外孢壁的任何芽孢杆菌属物种。例如，重组蜡状芽孢杆菌家族成员可包括炭疽芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，蕈状芽胞杆菌，假蕈状芽孢杆菌，撒氏芽孢杆菌，盖氏芽孢杆菌，韦氏芽孢杆菌，托氏芽孢杆菌或其组合。特别地，重组蜡状芽孢杆菌家族成员可包含苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
重组蜡状芽孢杆菌家族成员可以共表达两种或更多种上述任何融合蛋白。例如，重组蜡状芽孢杆菌家族成员可以共表达两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白包含保护动物免于病原体的蛋白质或肽。保护动物免于病原体的两种或更多种蛋白质可以保护动物免于同一病原体。可选地，保护动物免于病原体的两种或更多种蛋白质可以保护动物免于两种不同的病原体。例如，重组蜡状芽孢杆菌家族成员可以表达包含抗细菌蛋白质或肽的第一融合蛋白和包含抗真菌蛋白质或肽的第二融合蛋白。
为了产生表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，可以使用本领域已知的标准方法(例如通过电穿孔)用编码融合蛋白的载体缀合、转导或转化任何蜡状芽孢杆菌家族成员。然后可以通过本领域已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，当载体包含抗生素抗性基因时，可以筛选细菌的抗生素抗性。可选地，编码融合蛋白的DNA可以整合到蜡状芽孢杆菌家族成员宿主的染色体DNA中。然后重组蜡状芽孢杆菌家族成员可以暴露于诱导孢子形成的条件。诱导孢子形成的合适条件是本领域已知的。例如，可将重组蜡状芽孢杆菌家族成员铺在琼脂平板上，并在约30℃的温度下培养数天(例如3天)。
也可以合适地使用任何上述物种的灭活菌株、无毒菌株或遗传操作菌株。例如，可以使用缺乏Cry毒素的苏云金芽孢杆菌。可选地或另外地，一旦已产生表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员孢子，它们可以被灭活以防止一旦使用进一步发芽。可以使用本领域已知的任何灭活细菌孢子的方法。合适的方法包括但不限于热处理，γ辐射，X射线辐射，UV-A辐射，UV-B辐射，化学处理(例如用戊二醛，甲醛，过氧化氢，乙酸，漂白剂或其任何组合处理)，或其组合。可选地，可以使用来源于非产毒菌株或遗传或物理灭活菌株的孢子。
许多蜡状芽孢杆菌家族成员菌株具有在本文所述方法中有益的固有属性。例如，一些菌株具有杀虫、杀真菌、杀线虫或杀菌化合物。因此，表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员可包含产生杀虫毒素(例如Cry毒素)，产生杀真菌化合物(例如β-1,3-葡聚糖酶，壳聚糖酶，裂解酶或其组合)，产生杀线虫化合物(例如Cry毒素)，或产生杀菌化合物，对一种或多种抗生素具有抗性，或包含一种或多种自由复制的质粒的细菌菌株。
重组蜡状芽孢杆菌家族成员可在其BclA基因、其CotE基因或其CotO基因中包含失活突变(例如敲除BclA基因、CotE基因或CotO基因)。例如，重组蜡状芽孢杆菌家族成员可在其BclA基因中包含失活突变(例如敲除BclA基因)。已经发现，在具有这种突变的重组蜡状芽孢杆菌家族成员中融合蛋白的表达导致融合蛋白的表达水平增加。
F.目标蛋白和肽
可包含在融合蛋白中的目标蛋白质或肽在下文中结合每种方法、组合物和相关产物进一步描述。目标蛋白质或肽可包含：(a)保护动物免于病原体的蛋白质或肽；(b)保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽；(c)对动物病原体的昆虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫活性的蛋白质或肽；或(d)或抗原或免疫原。
II.用于在重组蜡状芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的启动子
编码本文所述的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂和昆虫喷雾器中使用的融合蛋白的DNA适当地在孢子形成启动子控制下，其将导致融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员内生孢子的外孢壁上表达(例如来自蜡状芽孢杆菌家族成员的天然bclA启动子)。
因此，上文I.B部分中描述的任何融合蛋白可以在重组蜡状芽孢杆菌家族成员中在孢子形成启动子或一部分这种启动子的控制下表达，所述孢子形成启动子对融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段是天然的。
可以在高表达孢子形成启动子的控制下表达任何融合蛋白。
高表达孢子形成启动子可包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
为了便于参考，下表2中提供了可用于表达重组蜡状芽孢杆菌家族成员中的任何融合蛋白的启动子的示例性核苷酸序列，以及它们的SEQ ID NO。表2还提供了许多启动子的示例性最小启动子序列。在表2中，启动子中的σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列用粗体和加下划线文字表示。几个序列具有彼此重叠的多个σ-K序列。重叠在表中用双下划线表示。对于每个指定的基因，启动子序列紧邻起始密码子的上游。换句话说，在下表2中所示的序列中，启动子序列的最后一个核苷酸紧接编码所示蛋白质的基因的编码区的起始密码子的第一个核苷酸。
表2.用于在重组蜡状芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的启动子序列
表2中所示的启动子序列中的σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列在晚期孢子形成期间导致融合蛋白的高表达水平。σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列的共有序列是CATANNNTN；然而，该序列可包含多达两个突变并且仍然是功能性的。σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列通常位于核糖体结合位点(RBS)的上游。
与表2中所示的任何序列具有高度序列同一性的启动子也可用于表达融合蛋白。
例如，融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有至少99％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有100％同一性的核酸序列。
例如，融合蛋白可以在BclA启动子(例如SEQ ID NO：149、150、175、189或190)，CotY启动子(例如SEQ ID NO：41、41或181)，ExsY启动子(例如SEQ ID NO：37、38或180)或鼠李糖启动子(例如，SEQ ID NO：185)的控制下表达。例如，融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少85％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少99％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与SEQ ID NO：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有100％同一性的核酸序列。
融合蛋白可以在包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列的启动子的控制下表达，其中σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列与任何SEQ ID NO：37-42和123-191的相应核苷酸具有100％同一性。
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子对融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段是天然的。因此，例如，当靶向序列来源于BclA时，融合蛋白可以在天然BclA启动子的控制下表达(例如SEQ ID NO：149、150、175、189或190)。
表2还提供了示例性的最小启动子序列。融合蛋白可以在任何这些最小启动子序列下表达。
此外，融合蛋白可以在上面表2中列出的任何一部分启动子下表达，只要该部分启动子包括σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列即可。例如，融合蛋白可以在启动子区域下表达，该启动子区域包含起始密码子上游的前25、50、100、150、200、250或300个核苷酸，只要该区域包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列即可。
III.允许收集游离外孢壁的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的突变和其它遗传改变
如本文下面进一步所述，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其可用于各种目的，包括将目标蛋白或肽递送至动物、水生生物或动物病原体的昆虫载体。然而，在一些情况下，活微生物的存在可能是不期望的，而是期望将活孢子与孢子外表面上的外孔壁中的融合蛋白分离。例如，在一些应用中，期望增加酶活性而不关心孢子完整性。在这种情况下，外孢壁片段可能优于在其外孢壁上具有酶的活微生物。
另外，对于一些用途，可能希望降低产品的密度。在这种情况下，需要将密孢子与外孢壁(含有融合蛋白)分离。在疫苗领域，可能需要将孢子与外孢壁(含有包含抗原的融合蛋白)分离，以从疫苗制剂中除去存在于孢子本身上的潜在抗原。另外，在某些情况下，活孢子的存在将导致产品中细菌生长的潜力，这对于一些应用(例如伤口敷料)是不期望的。
突变或其它基因改变(例如蛋白的过表达)可引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员，这允许游离外孢壁从重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子分离。这种分离过程产生含有融合蛋白但基本上没有孢子本身的外孢壁片段。“基本上没有孢子”是指一旦游离外孢壁与孢子分离，则获得的配制物含有小于5体积％的孢子，优选小于3体积％的孢子，甚至更优选小于1体积％的孢子，最优选不含孢子，或如果存在孢子它们是不可检测的。这些外孢壁片段可用于代替重组蜡样芽胞杆菌家族成员本身、或可用于本文所述的任何组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带或昆虫喷雾器中。
来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段可用于本文所述的任何组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料或饲料添加剂，昆虫喷雾器中。重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白，其包含至少一种目标蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁更容易从孢子中除去。
如下文第IV部分中进一步描述的，对于包含外孢壁片段的疫苗组合物，外孢壁片段不需要包含融合蛋白。这种外孢壁片段可以来源于不表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁更容易从孢子中除去。如在第IV部分中进一步解释的，外孢壁片段可以作为疫苗组合物中的佐剂。
重组蜡状芽孢杆菌家族成员：(i)可包含CotE基因的突变；(ii)可以表达ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含羧基-末端标签，其包含球状蛋白；(iii)可以表达BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加；(iv)可以表达YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加；(v)可包含ExsY基因的突变；(vi)可包含CotY基因的突变；(vii)可包含ExsA基因的突变；或(viii)可包含CotO基因的突变。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含CotE基因的突变，例如CotE基因或CotE基因的显性阴性形式的敲除。CotE基因的突变可部分或完全抑制CotE使外孢壁附接孢子的能力。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可表达ExsY蛋白。ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签(例如绿色荧光蛋白(GFP)或其变体)，并且在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于ExsY蛋白的表达，ExsY蛋白的表达增强。球状蛋白可具有分子量为25kDa至100kDa。ExsY蛋白的表达包含含有球状蛋白的羧基端标签，其可抑制ExsY蛋白与外孢壁中的其靶标结合。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可表达BclB蛋白。BclB蛋白的表达可导致易碎外孢壁的形成。在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于BclB蛋白的表达，BclB蛋白的表达可增强。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可表达YjcB蛋白。YjcB蛋白的表达可使所述外孢壁形成碎片而不是完整结构。在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于YjcB蛋白的表达，YjcB蛋白的表达可增强。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含ExsY基因的突变，例如ExsY基因的敲除。ExsY基因的突变可部分或完全抑制ExsY完全形成所述外孢壁或使所述外孢壁附接所述孢子的能力。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含CotY基因的突变，例如CotY基因的敲除。CotY基因的突变可导致易碎外孢壁的形成。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含ExsA基因的突变，例如ExsA基因的敲除。ExsA基因的突变可导致易碎外孢壁的形成。
重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含CotO基因的突变，例如CotO基因或CotO基因的显性阴性形式的敲除。CotO基因的突变可使所述外孢壁形成条。
为了便于参考，下表3中提供了CotE，ExsY，BclB，YjcB，CotY，ExsA和CotO的示例性序列的描述。
表3.可以突变或以其它方式遗传改变以允许收集游离外孢壁的蛋白质的序列
外孢壁片段可以从任何这些重组蜡状芽孢杆菌家族成员制备，并用于各种目的，如下文进一步描述的。当重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白时，外孢壁片段将包含融合蛋白。在纯化含有来自孢子的融合蛋白的外孢壁片段后，获得无细胞蛋白质制剂，其中融合蛋白通过与外孢壁片段的共价键而稳定和支持。
为了从重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子中去除具有允许收集游离外孢壁的突变或其它遗传改变的孢子，可以对孢子的悬浮液进行离心或过滤以产生与孢子分开的外孢壁的片段。当重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白时，外孢壁片段将包含融合蛋白。
可以将包含孢子的悬浮液进行离心，然后收集上清液。上清液包含外孢壁的片段并且基本上不含孢子。
可选地，可以对包含孢子的悬浮液进行过滤，然后收集滤液。滤液包含外孢壁的片段并且基本上不含孢子。
在离心或过滤之前，可以搅拌或机械破碎孢子悬浮液。
还可以通过梯度离心、亲和纯化或通过使孢子从悬浮液中沉淀以将外孢壁片段与孢子分离。
由于融合蛋白和外孢壁片段之间的强共价键，融合蛋白变得耐热。与外孢壁片段结合的融合蛋白的耐热性允许它们用于需要耐热蛋白质或酶的应用(例如在饲料添加剂中)。
IV.组合物
提供了包含载体和本文所述的任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的组合物。
还提供了包含载体和来源于本文所述的任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段的组合物。
组合物可包含上文第I.E部分中描述的任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子或来源于此类孢子的外孢壁片段。
A.药物，杀虫，杀螨，杀蠕虫和杀线虫组合物
组合物可以是药物组合物。当组合物包含药物组合物时，载体包含药学上可接受的载体。
组合物可以是杀虫组合物。
组合物可以是杀螨组合物。
当组合物是杀虫或杀螨组合物时，目标蛋白质可包含分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素，内切壳多糖酶，外切壳多糖酶，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，a Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白，Cyt1Aa蛋白或其任何组合。
杀蚊毒素可包含Mtx样杀蚊毒素(例如Mtx1)或Bin样杀蚊毒素。在灭蚊毒素包含Mtx1的情况下，Mtx1可以是本文所述的任何Mtx1蛋白。
组合物可以是杀蠕虫组合物
组合物可以是杀线虫组合物。
当组合物是杀蠕虫或杀线虫组合物时，目标蛋白质或肽可包含几丁质酶C，几丁质酶D或其组合。
提供了药物组合物。药物组合物包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
当组合物包含药物组合物时，该组合物可适用于局部，口服，静脉内，动脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，胸膜内，鼻内，皮内，吸入，直肠，透皮，上皮施用，通过将动物浸入药物组合物或其任何组合中而施用于水生动物。
例如，药物组合物可适用于局部施用。
药物组合物可以是局部喷雾组合物的形式。
药物组合物可适用于口服施用。
例如，药物组合物可以配制成饲料添加剂。
在除疫苗组合物之外的任何药物组合物中，保护动物免于病原体的蛋白质或肽优选不包含抗原或免疫原。
在任何药物组合物中，保护动物免于病原体的蛋白质或肽优选不包含核酸结合蛋白或肽。
对于任何药物组合物，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可以保护本文所讨论的任何动物。
对于任何药物组合物，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可以保护动物免于本文讨论的任何病原体。
在本文所述的任何组合物中，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可具有抗菌活性，抗真菌活性，抗蠕虫活性，杀线虫活性，杀虫活性，杀螨活性，可抑制昆虫或蠕虫繁殖，或其任何组合。
例如，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可具有抗菌活性，抗真菌活性或其组合。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含细菌素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，抗微生物肽，伴清蛋白，白蛋白，乳铁蛋白，乳铁蛋白肽，溶菌酶肽，TasA，防御素，抗体，抗体片段，酶，组蛋白或其任何组合。
乳铁蛋白肽可包含LfcinB。
LfcinB可包含牛(Bos taurus)乳铁蛋白。牛乳铁蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：212提供。
LfcinB可包含以上第I.B部分中描述的任何LfcinB肽。因此，LfcinB可包含与SEQID NO：212具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
溶菌酶肽可包含LysM肽。LysM可包含鸡(Gallus gallus)LysM。鸡LysM的氨基酸序列由SEQ ID NO：213提供。
LysM可包含上文第I.B部分中所述的任何LysM肽。因此，LysM可包含与SEQ ID NO：213具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
卵清蛋白可包含一种卵清蛋白。
抗微生物肽可包含非核糖体抗菌肽，非核糖体抗真菌肽，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽或其任何组合。
酶可包含核酸酶，蛋白酶，内酯酶，腺苷三磷酸双磷酸酶，糖苷水解酶，藻酸盐裂解酶，葡聚糖酶，壳聚糖酶，几丁质酶，壳聚糖酶样酶，裂解酶，变溶菌素或葡萄球菌溶血素，或其任何组合。
当酶包含腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含上文第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。因此，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含由Rrop1基因编码的马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶。马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：204提供。
可选地，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含由YtkD基因编码的枯草芽孢杆菌腺苷三磷酸双磷酸酶。枯草芽孢杆菌腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：205提供。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含糖苷水解酶时，糖苷水解酶可包含溶菌酶，分散素B或其任何组合。
当酶包含核酸酶时，核酸酶可包含DNase(例如DNAseI)。
内酯酶可包含上文第I.B部分中所述的任何内酯酶。因此，内酯酶可包含与SEQ IDNO：207或208具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含几丁质酶时，几丁质酶可包含内切壳多糖酶(例如几丁质酶C)或外切壳多糖酶(例如几丁质酶D)。
当几丁质酶包含内切壳多糖酶时，内切壳多糖酶可包含苏云金芽孢杆菌内切壳多糖酶。苏云金芽孢杆菌内切壳多糖酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：206提供。
内切壳多糖酶可包含上文第I.B部分中描述的任何内切壳酶。因此，内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
酶可包含对细菌信号转导分子特异的酶。例如，酶可包含蛋白酶或内酯酶。蛋白酶可包含本文所述的任何蛋白酶。内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶。
内酯酶可包含对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子特异的内酯酶。
当酶包含内酯酶时，内酯酶可包含1,4-内酯酶，2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶，3-氧代己二酸烯醇-内酯酶，放线菌素内酯酶，脱氧柠檬酸A-环-内酯酶，葡糖酸内酯酶L-鼠李-1,4-内酯酶，柠檬苦素-D-环-内酯酶，类固醇-内酯酶，三乙酸酯-内酯酶，木-1,4-内酯酶，或其任何组合。
内酯酶可包含AiiA内酯酶。
例如，内酯酶可包含苏云金芽孢杆菌B184AiiA或假蕈状芽孢杆菌B30AiiA。苏云金芽孢杆菌B184AiiA的氨基酸序列由SEQ ID NO：207提供。假蕈状芽孢杆菌B30AiiA的氨基酸序列由SEQ ID NO：208提供。
酶可包含对细菌或真菌的细胞或细胞外组分特异的酶。例如，酶可包含葡聚糖酶，壳聚糖酶，几丁质酶，壳聚糖酶样酶，裂解酶，蛋白酶，变溶菌素，葡萄球菌溶血素，溶菌酶或其任何组合。
当酶包含葡聚糖酶时，葡聚糖酶可包含纤维素酶，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶或其组合。
当酶包含β-1,3-葡聚糖酶时，β-1,3-葡聚糖酶可包含由BglH基因编码的环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶。该β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：216提供。
可选地，β-1,3-葡聚糖酶可包含由HvGII基因编码的大麦β-1,3-葡聚糖酶。该β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：214提供。
β-1,3-葡聚糖酶可包含上文第I.B部分中所述的任何β-1,3-葡聚糖酶。因此，β-1,3-葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO：214或216具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含蛋白酶时，蛋白酶可包含肽酶(例如内肽酶或外肽酶)，蛋白酶(例如蛋白酶K)或其组合。
蛋白酶可包含碱性蛋白酶，酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
蛋白酶可包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
例如，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含上文第I.B部分中描述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。因此，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可具有抗蠕虫活性，杀线虫活性，杀虫活性，杀螨活性，可抑制昆虫或蠕虫繁殖，或其任何组合。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含杀虫细菌毒素(例如VIP杀虫蛋白)，杀螨细菌毒素，内毒素(例如δ内毒素)，Cry毒素，蛋白酶抑制蛋白或肽(例如胰蛋白酶抑制剂或箭头蛋白酶抑制剂)，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素(例如Mtx1样杀蚊毒素，Bin样杀蚊毒素或其组合)，半胱氨酸蛋白酶，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，几丁质酶或其任何组合。
几丁质酶可包含本文所述的任何几丁质酶(例如本文所述的任何内切壳酶)。
枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含本文所述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
Mtx1样杀蚊毒素可包含Mtx1。
Mtx1可以包括上文第I.B部分中描述的任何Mtx1毒素。因此，例如，Mtx1可包含球形芽孢杆菌Mtx1。球形芽孢杆菌Mtx1的氨基酸序列由SEQ ID NO：211提供。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
Cry毒素可包含来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素。
Cry毒素可包含Cry5B蛋白，Cry21A蛋白，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白质，Cry4Ab蛋白质，Cry11Aa蛋白质，Cyt1Aa蛋白质或其任何组合。
例如，Cry毒素可包含Cry21A蛋白。
Cry21A蛋白可包含苏云金芽孢杆菌Cry21A蛋白。苏云金芽孢杆菌Cry21A蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：215提供。
Cry21A蛋白可包含上文第I.B部分中描述的任何Cry21A蛋白。因此，Cry21A蛋白可包含与SEQ ID NO：215具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
下文描述了另外的组合物(例如用于水产养殖的疫苗组合物和组合物)。
B.疫苗组合物
在任何药物组合物中，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含抗原或免疫原。此类药物组合物在本文中称为“疫苗组合物”，并且适合与下文第VI部分中描述的产生免疫原性应答的方法一起使用。
1.适用于在水生动物中产生免疫原性应答的疫苗组合物
提供了适用于在水生动物中提供免疫原性应答的药物组合物。水生动物可以是第VI部分中列出的任何水生动物。
在其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含抗原或免疫原的药物组合物中，抗原或免疫原可包含来源于水生动物病原体的抗原或免疫原(例如鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌或鱼孢霉)。此类组合物适用于在水生动物中产生免疫原性应答的方法，包括下面第VI部分中描述的方法。
药物组合物可以是粉末或液体浓缩物的形式。此类组合物特别适用于在水生动物中产生免疫原性应答的方法，包括下面第VI部分中描述的方法。
2.含有外孢壁片段作为佐剂和/或稳定性增强剂的疫苗组合物
当包含在疫苗组合物中时，外孢壁片段可以充当佐剂。另外，不同类型的外孢壁片段(例如来源于不同种类细菌的外孢壁片段或来源于具有允许收集游离外孢壁的不同突变的重组芽孢杆菌属家族成员的外孢壁片段)可具有不同的佐剂性质或效果。
此外，当外孢壁片段用于疫苗组合物时，抗原或免疫原与外孢壁片段共价结合。不受任何特定理论的束缚，据认为这增加了疫苗组合物的长期稳定性，从而允许疫苗组合物的长期储存，同时保持抗原或免疫原在动物中引发免疫应答的能力。
如下文更详细描述的，本文提供了含有外孢壁片段的各种疫苗组合物。外孢壁片段可以来源于表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中融合蛋白包含抗原或免疫原。在这种情况下，外孢壁片段既可以作为疫苗组合物中抗原或免疫原的载体，又可以发挥其佐剂作用。在其它组合物中，外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族的孢子，其不表达包含抗原或免疫原的融合蛋白。这种外孢壁片段不携带抗原或免疫原，但可用作疫苗组合物中的佐剂，所述疫苗组合物含有：(1)抗原或免疫原；(2)来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段，其表达包含抗原或免疫原的融合蛋白；或(3)表达包含抗原或免疫原的融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
允许收集游离外孢壁的突变和其它遗传改变在第III部分中描述。这些突变或其它遗传改变中的任一种都可用于产生可包含在疫苗组合物中的外孢壁片段。
a.含有第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段的疫苗组合物
提供了疫苗组合物。该组合物包含药学上可接受的载体。疫苗组合物还包含第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段。第二类外孢壁片段与第一类外孢壁片段不同。第一类和第二类外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁更容易从孢子中除去。第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段中的至少一个包含融合蛋白。融合蛋白包含抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段均包含融合蛋白。融合蛋白包含抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
当第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段都包含融合蛋白时，第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段可以包含彼此相同的融合蛋白。
可选地，第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段可包含彼此不同的融合蛋白。
例如，第一类外孢壁片段可包含含有第一抗原或免疫原的融合蛋白，第二类外孢壁片段可包含含有第二抗原或免疫原的融合蛋白，其中第一抗原或免疫原是与第二抗原或免疫原不同。
可选地或另外地，当第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段包含彼此不同的融合蛋白时，第一类外孢壁片段可包含融合蛋白，其包含第一序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段靶向的融合蛋白。第二类外孢壁片段包含融合蛋白，其包含第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段不同于第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。
在包含第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段的任何疫苗组合物中，第一类外孢壁片段可以来源于蜡状芽孢杆菌家族中第一种细菌的孢子，并且第二类外孢壁片段可以来源于蜡状芽孢杆菌家族中第二种细菌的孢子。第二种细菌与第一种细菌不同。例如，第一种细菌可包含苏云金芽孢杆菌，第二种细菌可包含假蕈状芽孢杆菌。
在包含第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段的任何疫苗组合物中，第一类外孢壁片段可以来源于包含第一突变的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。第一突变导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子具有与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去的外孢壁。第二类外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其包含第二突变。第二突变导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子具有与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去的外孢壁。第一个突变与第二个突变不同。
第一突变和第二突变可以独立地选自：(i)CotE基因的突变；(ii)ExsY基因的突变；(iii)CotY基因的突变；(iv)ExsA基因的突变；和(v)CotO基因的突变。例如，第一突变可包含CotE基因的敲除，第二突变可包含ExsY基因的敲除。
在包含第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段的任何疫苗组合物中，第一类外孢壁片段可以来源于表达第一蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中第一蛋白质的表达相比，第一蛋白质的表达增加。第一蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子具有与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去的外孢壁。第二类外孢壁片段来源于表达第二蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中第二蛋白质的表达相比，第二蛋白质的表达增加。第二蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子具有与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去的外孢壁。第一蛋白质与第二蛋白质不同。
例如，第一蛋白质和第二蛋白质可以独立地选自：(i)ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签；(ii)BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加；和(iii)YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加。
在包含第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段的任何疫苗组合物中，第一类外孢壁片段可以来源于包含突变的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与野生型孢子的外孢壁相比，突变导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子具有更容易从孢子中去除的外孢壁。第二类外孢壁片段来源于表达蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，蛋白质表达的增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁更容易从孢子中除去。
例如，突变可以选自：(i)CotE基因的突变；(ii)ExsY基因的突变；(iii)CotY基因的突变；(iv)ExsA基因的突变；和(v)CotO基因的突变。蛋白质可以选自：(i)ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签；(ii)BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加；和(iii)YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加。
b.包含重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子和外孢壁片段的疫苗组合物
提供了另一种疫苗组合物。该组合物包含药学上可接受的载体。该组合物还包含表达第一融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。第一融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其将第一融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。该组合物还包含外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
外孢壁片段可以来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员，其包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中的蛋白质表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁更容易从孢子中除去。
外孢壁片段可以来源于表达第二融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。第二融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使第二融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
第一融合蛋白和第二融合蛋白可彼此相同。可选地，第一融合蛋白和第二融合蛋白可彼此不同。
例如，第一融合蛋白可包含第一抗原或免疫原，第二融合蛋白可包含第二抗原或免疫原。第一抗原或免疫原不同于第二抗原或免疫原。
可选地或另外地，第一融合物可包含第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。第二融合蛋白包含第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段不同于第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。
对于包含重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的疫苗组合物，孢子优选是灭活的。用于灭活蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的方法在上文第I.E部分和以下第VIII部分中描述。
c.包含免疫原或抗原和外孢壁片段的疫苗组合物
提供了另一种疫苗组合物。该组合物包含药学上可接受的载体。该组合物还包含第一免疫原或抗原。该组合物还包含外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
外孢壁片段可以来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员，其包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加。与野生型孢子的外孢壁相比，突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁更容易从孢子中除去。
外孢壁片段可以来源于表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含第二抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
第一抗原或免疫原和第二抗原或免疫原可以是相同的。
可选地，第一抗原或免疫原和第二抗原或免疫原可彼此不同。
免疫原或抗原优选包含游离抗原或游离免疫原。本文所用的术语“游离抗原”和“游离免疫原”包括部分纯化的、基本上纯化的或纯化的抗原或免疫原。
可以任选地将游离抗原或免疫原固定在化学基质或载体上以允许控制释放抗原或免疫原。基质或载体可包括木炭，生物炭，纳米碳，琼脂糖，藻酸盐，纤维素，纤维素衍生物，二氧化硅，塑料，不锈钢，玻璃，聚苯乙烯，陶瓷，白云石，粘土，硅藻土，滑石，聚合物，树胶，水分散性材料或其任何组合。在相同条件下，与相同的非固定化抗原或免疫原的释放速率相比，抗原或免疫原在基质或载体上的固定优选导致抗原或免疫原的较慢释放。
此外，游离抗原或免疫原可以是融合蛋白的一部分。然而，游离抗原或游离免疫原优选不包括与蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁结合的抗原或免疫原。游离抗原或免疫原也优选不包括与完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁结合的酶。
抗原或免疫原可以是编码抗原或免疫原的DNA的形式。编码抗原或免疫原的DNA可以施用于动物。然后由动物在体内表达抗原或免疫原。
如本文所用，关于抗原和免疫原的术语“部分纯化的”是指抗原或免疫原的粗制剂(例如细胞裂解物)已经过除去至少一些非抗原或非免疫原组分(例如废蛋白，死细胞材料，过量水和/或不需要的细胞碎片)的程序。在部分纯化的抗原或免疫原制剂中，抗原或免疫原优选占制剂中总蛋白质含量的至少1％，更优选制剂中总蛋白质含量的至少2.5％，甚至更优选制剂中总蛋白质含量的大于5％。
本文所用的与游离抗原和游离免疫原有关的术语“基本上纯化的”是指抗原或免疫原制剂已经过去除大量非抗原或非免疫原组分(例如废蛋白，死细胞材料，过量水和/或不需要的细胞碎片)的程序。在基本上纯化的抗原或免疫原制剂中，抗原或免疫原优选占制剂中总蛋白质含量的30％以上，更优选制剂中总蛋白质含量的约40％以上，甚至更优选制剂中总蛋白质含量的50％以上。
3.佐剂
在本文所述的任何疫苗组合物中，疫苗还可包含佐剂。
当疫苗组合物包含外孢壁片段时，除了由外孢壁片段提供的那些之外，佐剂还可以提供进一步的佐剂效应。
例如，佐剂可包含弗氏完全佐剂(FCA)，弗氏不完全佐剂(FIA)，铝(例如铝盐，例如氢氧化铝，磷酸铝或硫酸铝)，单磷酰脂质A，角鲨烯，和油基佐剂，皂苷，不可代谢的油(如矿物油，植物油或动物油)，聚合物，卡波姆，表面活性剂，天然有机化合物，植物提取物，碳水化合物，油包水或水包油乳液，或其任何组合。合适的皂苷佐剂包括QUIL-A(Invivogen)，QS-21(Cambridge Biotech，Inc.，来自含有水溶性三萜糖苷化合物的Quillaja saponaria的纯化植物提取物)和GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，半合成三萜糖苷，来源于天然存在的皂苷)产品。合适的乳液包括含有轻质液体石蜡油(欧洲药典型)的那些。诸如角鲨烯或角鲨烯的类异戊二烯油；由烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚反应产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油，油酸乙酯，丙二醇二(辛酸盐/癸酸盐)，甘油基三-(辛酸盐/癸酸盐)或丙二醇二油酸酯；或支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。该油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇，甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)，二醇，聚甘油，丙二醇和油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其任选地被乙氧基化，和聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产品，尤其是L121。(参见Hunter等人,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),John Wiley和Sons,NY,pp 51-94(1995)和Todd等人,Vaccine15:564-570(1997))。
当疫苗组合物用于在水生动物中产生免疫原性应答时，合适的佐剂包括但不限于酵母提取物，例如LIEBERβ-S(来自酿酒酵母的细胞壁的高纯度1,3/1,6-β-D-葡聚糖分子)，NUPRO酿酒酵母(富含核苷酸的酿酒酵母酵母蛋白)或MACROGARD(由酿酒酵母的菌株；左旋咪唑；二聚体溶菌酶；β-羟基-甲基丁酸(HMB)；和BIOIMMUNO(葡聚糖和异丙肌苷的混合物)产生的高度纯化、暴露和保存的β1,3/1,6葡聚糖)。
V.用于保护动物或水生生物免于病原体的非疫苗方法和用于保护动物或水生生物免于病原体的非疫苗组合物和产品
提供了用于保护动物免于病原体的方法。这些方法优选是非疫苗方法，因为该方法不需要使用疫苗、抗原或免疫原。相反，在不使用疫苗、抗原或免疫原的情况下实现了保护动物免于病原体的所需效果。
表达本文所述融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子或来源于此类孢子的外孢壁片段可用于展示通过抗菌活性、抗真菌活性、抗生物膜活性和/或其它保护活动保护动物免于病原体的蛋白质或肽(例如酶)。保护动物免于病原体的蛋白质或肽可对其靶标(例如细菌素，白蛋白，伴白蛋白，溶菌酶和乳铁蛋白)发挥直接的抗微生物作用和/或可结合并隔离病原体对毒力所需的必需营养素(例如抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白)。例如，LfcinB或乳铁蛋白可用于裂解细菌细胞。保护动物免于病原体的蛋白质或肽可以对选择的微生物具有特异性作用，并且可以选择性地靶向一组病原体而不阻碍所有微生物。
提供了一种用于保护动物免于病原体的方法。该方法包括向动物、动物环境或病原体施用表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
可选地或另外地，该方法包括将外孢壁片段施用于动物、动物环境或病原体。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该方法可包括向动物施用孢子、外孢壁片段或其组合。
该方法优选包括施用外孢壁片段。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽优选不包含抗原或免疫原。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽优选不包含核酸结合蛋白或肽。
动物可包括哺乳动物，鸟类，鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，昆虫，珊瑚或海绵。
在动物包括哺乳动物的情况下，哺乳动物可包括人，猴，绵羊，山羊，奶牛，猪，鹿，羊驼，野牛，骆驼，驴，马，骡子，牦牛，驯鹿，骆驼，兔子，狗，猫，雪貂，沙鼠，豚鼠，仓鼠，小鼠，兔子或老鼠。
在动物包括鸟类的情况下，鸟类可以包括鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，鸽子，鸽子，鸵鸟，鸸鹋或野鸡。
在动物包括鱼类的情况下，鱼类可包括爱好鱼，鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼或鲟鱼。
在动物包括两栖动物的情况下，两栖动物可包括青蛙，蟾蜍，蝾螈或火蜥蜴。
在动物包括爬行动物的情况下，爬行动物可包括蛇，蜥蜴，鬣蜥，鳄鱼，短吻鳄，乌龟或陆龟。
在动物包含甲壳类动物的情况下，甲壳类动物可包括河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹或小龙虾。
当动物包括鸟类，鱼类，两栖动物，爬行动物或甲壳类动物时，用于保护动物免于病原体的方法可包括保护动物的卵免于病原体。
当动物包括鸟类，鱼类，两栖动物，爬行动物或甲壳类动物时，用于保护动物免于病原体的方法可包括将外孢壁片段或孢子施用于动物的卵。
在动物包含软体动物的情况下，软体动物可包括贻贝，蛤，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼或章鱼。
在动物包含蠕虫的情况下，蠕虫可包括蚯蚓，线虫，扁虫，蛔虫，绦虫或吸虫。
在动物包含昆虫的情况下，昆虫可包括蜜蜂，瓢虫，蝴蝶，蚕，苍蝇，甲虫或其任何幼虫。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可具有抗菌活性，抗真菌活性，抗蠕虫活性，杀线虫活性，杀虫活性，杀螨活性，可抑制昆虫或蠕虫繁殖，或其任何组合。
例如，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可具有抗菌活性、抗真菌活性或其组合。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含细菌素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，抗微生物肽，伴清蛋白，白蛋白，乳铁蛋白，乳铁蛋白肽，TasA，防御素，抗体，抗体片段，酶，组蛋白或其任何组合。
乳铁蛋白肽可包含LfcinB。
LfcinB可包含牛乳铁蛋白。牛乳铁蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：212提供。
LfcinB可包含上文第I.B部分中描述的任何LfcinB肽。因此，LfcinB可包含与SEQID NO：212具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
卵清蛋白可包含一种卵清蛋白。
抗微生物肽可包含非核糖体抗菌肽，非核糖体抗真菌肽，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽或其任何组合。
酶可包含核酸酶，蛋白酶，内酯酶，腺苷三磷酸双磷酸酶，糖苷水解酶，藻酸盐裂解酶，葡聚糖酶，壳聚糖酶，几丁质酶，壳聚糖酶样酶，裂解酶，变溶菌素或葡萄球菌溶血素，或其任何组合。
当酶包含腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含上文第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。因此，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含由Rrop1基因编码的马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶。马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：204提供。
可选地，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含由YtkD基因编码的枯草芽孢杆菌腺苷三磷酸双磷酸酶。该枯草芽孢杆菌腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：205提供。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包含与SEQ ID NO：204或205具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含糖苷水解酶时，糖苷水解酶可包含溶菌酶(例如LysM)，溶菌酶肽，分散素B或其任何组合。
当糖苷水解酶包含LysM时，LysM可包含鸡LysM。鸡LysM的氨基酸序列由SEQ IDNO：213提供。
LysM可包含上文第I.B部分中所述的任何LysM肽。因此，LysM可包含与SEQ ID NO：213具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含核酸酶时，核酸酶可包含DNase(例如DNAseI)。
内酯酶可包含上文第I.B部分中所述的任何内酯酶。因此，内酯酶可包含与SEQ IDNO：207或208具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含几丁质酶时，几丁质酶可包含内切壳多糖酶(例如几丁质酶C)或外切壳多糖酶(例如几丁质酶D)。
在几丁质酶包含内切壳多糖酶的情况下，内切壳多糖酶可包含苏云金芽孢杆菌内切壳多糖酶。苏云金芽孢杆菌内切壳多糖酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：206提供。
内切壳多糖酶可包含上文第I.B部分中描述的任何内切壳酶。因此，内切壳多糖酶可包含与SEQ ID NO：206具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
酶可包含对细菌信号转导分子特异的酶。例如，酶可包含蛋白酶或内酯酶。蛋白酶可包含本文所述的任何蛋白酶。内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶。
内酯酶可包含对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子特异的内酯酶。
当酶包含内酯酶时，内酯酶可包含1,4-内酯酶，2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶，3-氧代己二酸烯醇-内酯酶，放线菌素内酯酶，脱氧柠檬酸A-环-内酯酶，葡糖酸内酯酶L-鼠李-1,4-内酯酶，柠檬苦素-D-环-内酯酶，类固醇-内酯酶，三乙酸酯-内酯酶，木-1,4-内酯酶，或其任何组合。
内酯酶可包含AiiA内酯酶。
例如，内酯酶可包含苏云金芽孢杆菌B184AiiA或假蕈状芽孢杆菌B30AiiA。苏云金芽孢杆菌B184AiiA的氨基酸序列由SEQ ID NO：207提供。假蕈状芽孢杆菌B30AiiA的氨基酸序列由SEQ ID NO：208提供。
酶可包含对细菌或真菌的细胞或细胞外组分特异的酶。例如，酶可包含葡聚糖酶，壳聚糖酶，几丁质酶，壳聚糖酶样酶，裂解酶，蛋白酶，变溶菌素，葡萄球菌溶血素，溶菌酶或其任何组合。
当酶包含葡聚糖酶时，葡聚糖酶可包含纤维素酶，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,4-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶或其组合。
当酶包含β-1,3-葡聚糖酶时，β-1,3-葡聚糖酶可包含由BglH基因编码的环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶。该β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：216提供。
可选地，β-1,3-葡聚糖酶可包含由HvGII基因编码的大麦β-1,3-葡聚糖酶。该β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：214提供。
β-1,3-葡聚糖酶可包含上文第I.B部分中所述的任何β-1,3-葡聚糖酶。因此，β-1,3-葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO：214或216具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当酶包含蛋白酶时，蛋白酶可包含肽酶(例如内肽酶或外肽酶)，蛋白酶(例如蛋白酶K)或其组合。
蛋白酶可包含碱性蛋白酶，酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
蛋白酶可包含丝氨酸蛋白酶。
例如，丝氨酸蛋白酶可包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含上文第I.B部分中描述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。因此，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：210具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可具有抗蠕虫活性，杀线虫活性，杀虫活性，杀螨活性，可抑制昆虫或蠕虫繁殖，或其任何组合。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含杀虫细菌毒素(例如VIP杀虫蛋白)，杀螨细菌毒素，内毒素(例如δ内毒素)，Cry毒素，蛋白酶抑制蛋白或肽(例如胰蛋白酶抑制剂或箭头蛋白酶抑制剂)，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素(例如Mtx1样杀蚊毒素，Bin样杀蚊毒素或其组合)，半胱氨酸蛋白酶，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，几丁质酶或其任何组合。
几丁质酶可包含本文所述的任何几丁质酶(例如本文所述的任何内切壳酶)。
枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含本文所述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
Mtx1样杀灭蚊毒素可包含Mtx1。
Mtx1可包含上文第I.B部分中描述的任何Mtx1毒素。因此，例如，Mtx1可包含球形芽孢杆菌Mtx1。球形芽孢杆菌Mtx1的氨基酸序列由SEQ ID NO：211提供。
Mtx1可包含与SEQ ID NO：211具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
Cry毒素可包含来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素。
Cry毒素可包含Cry5B蛋白，Cry21A蛋白，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa。蛋白质，Cry4Ab蛋白质，Cry11Aa蛋白质，Cyt1Aa蛋白质或其任何组合。
例如，Cry毒素可包含Cry21A蛋白。
Cry21A蛋白可包含苏云金芽孢杆菌Cry21A蛋白。苏云金芽孢杆菌Cry21A蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：215提供。
Cry21A蛋白可包含上文第I.B部分中描述的任何Cry21A蛋白。因此，Cry21A蛋白可包含与SEQ ID NO：215具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
病原体可包括细菌病原体，真菌病原体，致病性蠕虫，致病性昆虫，致病性螨虫，病原性原生生物或其任何组合。
细菌病原体可包括葡萄球菌属的细菌病原体，嗜血杆菌属的细菌病原体，假单胞菌属的细菌病原体，链球菌属的细菌病原体，分枝杆菌属的细菌病原体，梭菌属的病原体，肠杆菌属的细菌病原体，肠球菌属的细菌病原体，气单胞菌属的细菌病原体，不动杆菌属的细菌病原体，梭菌属的细菌病原体，普氏菌属的细菌病原体，黄杆菌属的细菌病原体，爱德华氏菌属的细菌病原体，无形体属的细菌病原体，芽孢杆菌属的细菌病原体，巴尔通体属的细菌病原体，博德特氏菌属的细菌病原体，包柔氏螺旋体属的细菌病原体，布鲁氏菌属的细菌病原体，伯克氏菌属的病原体，衣原体属的细菌病原体，柯克斯体属的细菌病原体，埃立克体属的细菌病原体，幽门螺杆菌属的细菌病原体，克雷伯菌属的细菌病原体，拉氏菌属的细菌病原体，钩端螺旋体属的细菌病原体，支原体属的细菌病原体，新立克次体属的细菌病原体，巴斯德氏菌属的细菌病原体，立克次体属的细菌病原体，沙门氏菌属的细菌病原体，或其任何组合。
例如，细菌病原体可包括鲍曼不动杆菌，嗜水气单胞菌，嗜粒细胞无形体，嗜吞噬细胞无形体，扁平无形体，炭疽杆菌，汉氏巴尔通体，罗氏巴尔通体，韦氏巴尔通体伯格霍夫亚种，支气管败血性鲍特菌，泰累尔氏包柔氏螺旋体，伯氏包柔氏螺旋体，流产布氏杆菌，羊布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，鼻疽伯克霍尔德菌，假鼻疽伯克霍尔德菌，流产嗜性衣原体，猫衣原体，鹦鹉热衣原体，肉毒梭菌，艰难梭菌，产气荚膜梭菌，毛状梭菌，破伤风杆菌，贝氏柯克斯体，鮰爱德华氏菌，犬埃立克体，查菲埃立克体，埃氏埃立克体，反刍兽埃立克体，粪肠球菌，猪瘟病毒杆菌，黄杆菌菌株，坏死梭杆菌，流感嗜血杆菌，猫嗜血杆菌，肝炎螺杆菌，肺炎克雷伯菌，胞内劳森菌，波蒙那钩端螺旋体，秋令热钩端螺旋体，拜伦钩端螺旋体，犬型钩端螺旋体，感冒伤寒型钩端螺旋体，出血性黄疸钩端螺旋体，感染途径钩端端螺旋体，鸟支原体，牛支原体，偶发支原体，微小支原体，副结核支原体，结核支原体，无乳支原体，山羊支原体，山羊支原体亚种肺炎衣原体，猫支原体，蕈状山羊支原体，蕈状支原体亚种蕈状，腐败支原体，牛淤点热新立克次体，蠕虫新立克次体，里氏新立克次体，多杀性巴氏杆菌，绿浓杆菌，产黑色素普氏菌，普氏立克次体，地方性斑疹伤寒立克次体，非凡螺原体，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，鱼发酵葡萄球菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，牛链球菌，链球菌组A，链球菌组B，链球菌组C，链球菌组D，链球菌组G，马类亚种链球菌，兽疫亚种链球菌，马生殖道泰勒氏菌，或其任何组合。
真菌病原体可包括曲霉属的真菌病原体，小孢子菌属的真菌病原体，隐球菌属的真菌病原体，金孢子菌属的真菌病原体，脑炎的真菌病原体，真菌肠嗜血杆菌属的病原体，镰刀菌属的真菌病原体，横梗霉属的真菌病原体，马鞭草属的真菌病原体，毛癣菌属的真菌病原体，被孢霉属的真菌病原体，菌根属的真菌病原体，犁头霉属的真菌病原体，根霉属的真菌病原体，枝孢菌属的真菌病原体，帚霉属的真菌病原体，原壁菌属的真菌病原体，强雄腐霉属的真菌病原体，红酵母属的真菌病原体，葡萄状穗霉属的真菌病原体，链壶菌属的真菌病原体，离壶菌属的真菌病原体，念珠菌属的真菌病原体，或其任何组合。
真菌病原体可包括机会性的暗色性真菌病原体。
真菌病原体可包括短小金孢子菌，家兔脑胞内原虫，伞状毛霉菌，Lagenidiummyophilum，沃尔夫被孢霉，纸葡萄穗霉，新型隐球菌，白念珠菌，疣状毛癣菌，马发癣菌，须毛癣菌，或其任何组合。
致病性蠕虫可包括线虫，蠕虫，蛔虫，蛲虫，鞭虫，蚯蚓，盲肠蠕虫，胃蠕虫，毛虫，螺纹蠕虫，吸虫，绦虫或其任何组合。
例如，致病性蠕虫可包括猪蛔虫，旋毛虫，猪鞭虫，人蛔虫，蛔虫属，旋毛虫，奥斯特线虫，帕莱斯血矛线虫，肿孔古柏线虫，网尾线虫，肝片吸虫，捻转血矛线虫，巴特斯细颈线虫，类圆线虫属，犬钩虫，犬弓蛔虫，猫弓蛔虫，巨颈绦虫，或其任何组合。
致病性昆虫可包括内寄生虫，外寄生虫或其组合。
外寄生虫可选自跳蚤，蜱，虱，螨，苍蝇，蚊子，其任何幼虫及其任何组合。
内寄生虫可选自踵蝇，皮蝇，肤蝇，胃蝇属，其任何幼虫，及其任何组合。
致病原生生物可包括巴贝斯虫属的原生生物，新孢子虫属的原生生物，肉孢子虫属的原生生物，泰勒虫属的原生生物，锥虫属的原生生物，内阿米巴属的原生生物，贾第虫属的原生生物，隐孢子虫属的原生生物，毛滴虫属的原生生物，弓形虫属的原生生物，疟原虫属的原生生物，球虫属的原生生物，利什曼原虫属的原生生物，隐孢子虫属的原生生物，环孢子的原生生物，艾美球虫属的原生生物，纳氏虫属的原生生物，肉孢子虫属的原生生物，新孢子虫属的原生生物，芽囊原虫属的原生生物，微孢子虫属的原生生物，或其任何组合。
例如，致病原生生物可以包括溶组织内阿米巴，牛巴贝虫，双芽巴贝虫，犬巴贝虫，巨型艾美球虫，柔嫩艾美耳球虫，兔贾第鞭毛虫，杜氏利什曼虫，犬新孢子虫，神经肉孢子虫，小泰累尔梨浆虫，环状泰累尔梨浆虫，羊泰累尔梨浆虫，刚地弓形虫，或其任何组合。
A.水产养殖组合物和方法
本文提供了用于水产养殖的组合物和用于保护水生生物免于病原体的方法。许多病原体在水产养殖中存在问题。细菌和真菌病原体可直接感染水产养殖系统中的水生生物。此外，生物膜通常在水产养殖系统中形成。生物膜可以在水产养殖系统中的生物体上形成(例如在鱼鳃上)或在水产养殖系统内的表面上(例如管道，罐，泵或过滤器)。因此，需要保护水产养殖系统中的水生生物免于病原体的方法。
提供了一种组合物。该组合物包含可用于水产养殖和外孢壁片段的载体。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
载体可包含疏水聚合物。疏水聚合物的使用可以帮助组合物粘附到水产养殖系统内的表面上。
组合物可以是干粉或水分散性颗粒的形式。
在用于水产养殖的任何组合物中，保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽包括腺苷三磷酸双磷酸酶，分散素B或其组合。腺苷三磷酸双磷酸酶可以是本文讨论的任何腺苷三磷酸双磷酸酶，包括上文第I.B部分中讨论的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。
提供了一种用于保护水生生物免于病原体的方法。该方法包括在水产养殖系统中培养水生生物。将表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子引入水产养殖系统。融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。水生生物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵，红藻，褐藻或其任何组合。
可选地或另外地，该方法包括在水产养殖系统中培养水生生物。将外孢壁片段引入水产养殖系统。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。水生生物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵，红藻，褐藻或其任何组合。
在任何水产养殖组合物或方法中，保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽优选不包含抗原或免疫原。
水生生物可包含红藻，褐藻或其组合。
褐藻可包含海藻(例如紫菜，海藻或其组合)。
提供了一种用于保护水生动物免于病原体的方法。该方法包括在水产养殖系统中培养水生动物，并通过将孢子或外孢壁片段引入水产养殖系统来向水生动物施用孢子或外孢壁片段。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白质靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁，并且保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，其中融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在涉及使用水产养殖系统的任何方法中，该方法优选包括将外孢壁片段引入水产养殖系统。
对于用于水产养殖的任何组合物或涉及使用水产养殖系统的任何方法，水生生物或水生动物可包括鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵或其任何组合。
当水生生物或水生动物包括鱼类时，鱼类可包括鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼，鲟鱼或其任何组合。
当水生生物或水生动物包含两栖动物时，两栖动物可包括青蛙，蟾蜍，蝾螈，火蜥蜴或其任何组合。
在水生生物或水生动物包括爬行动物的情况下，爬行动物可包括蛇，蜥蜴，鳄鱼，短吻鳄，乌龟，陆龟或其任何组合。
水生生物或水生动物可包括青蛙，蟾蜍，短吻鳄，乌龟或其任何组合。
当水生生物或水生动物包含甲壳类动物时，甲壳类动物可包括河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹，小龙虾或其任何组合。
当水生生物或水生动物包括软体动物时，软体动物可包括贻贝，蛤，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼或章鱼，或其任何组合。
在涉及使用水产养殖系统的任何方法中，该方法可以预防或治疗由病原体引起的水生生物或水生动物的疾病。
在涉及使用水产养殖系统的任何方法中，该方法可以防止或抑制生物膜形成或促进生物膜在水产养殖系统内的表面上的溶解(例如管道，罐，泵，过滤器的表面或其任何组合)。
在涉及使用水产养殖系统的任何方法中，将外孢壁片段或孢子引入水产养殖系统可包括将外孢壁片段或孢子添加到水产养殖系统中的水中。
在涉及使用水产养殖系统的任何方法中，将外孢壁片段或孢子引入水产养殖系统可包括将外孢壁片段或孢子施用于水产养殖系统内的表面(例如管道，罐，泵，过滤器的表面或其任何组合)。
在涉及使用水产养殖系统的任何方法中，将外孢壁片段或孢子引入水产养殖系统可包括将水生生物或水生动物浸入包含外孢壁片段或孢子的溶液中。
水产养殖系统可以是淡水水产养殖系统。
水产养殖系统可以是盐水水产养殖系统。
水产养殖系统可以是微咸水养殖系统。
可将外孢壁片段或孢子以包含外孢壁片段或孢子和载体的组合物引入水产养殖系统。
保护动物或水生动物免于可用于任何水产养殖组合物或涉及使用水产养殖系统的任何方法的病原体的蛋白质或肽的实例包括但不限于腺苷三磷酸双磷酸酶，蛋白酶(例如枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶)，几丁质酶，葡聚糖酶(例如β-1,3-葡聚糖酶)，抗微生物蛋白或肽(例如乳铁蛋白肽)和内酯酶。也可以使用任何这些蛋白质或肽的组合。
当蛋白质或肽包含腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可包含本文所述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶，包括第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。
蛋白酶可包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。当蛋白酶包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶时，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含本文所述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，包括第I.B部分中描述的枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。例如，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶可包含与SEQ ID NO：209或210具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
当蛋白质或肽包含几丁质酶时，几丁质酶可包含本文所述的任何几丁质酶，包括第I.B部分中描述的任何内切壳酶。
当蛋白质或肽包含葡聚糖酶时，葡聚糖酶可包含本文所述的任何葡聚糖酶，包括第I.B部分中描述的任何β-1,3-葡聚糖酶。
当蛋白质或肽包含内酯酶时，内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶，包括第I.B部分中描述的任何AiiA内酯酶。
当抗微生物蛋白质或肽包含乳铁蛋白肽时，乳铁蛋白肽可包含LfcinB。LfcinB可包含本文所述的任何乳铁蛋白肽，包括第I.B部分中描述的任何LfcinB肽。
对于任何水产养殖组合物或涉及使用水产养殖系统的任何方法，病原体可包含链壶菌属的真菌病原体，离壶菌属的真菌病原体，嗜水气单胞菌或其任何组合。
B.治疗或预防伤口感染的方法、粘合贴剂、伤口敷料和用于与方法、粘合贴剂和伤
口敷料关联的组合物
提供了通过预防或治疗动物伤口感染来保护动物免于病原体的方法。
提供了一种保护动物免于病原体的方法。该方法包括通过将孢子施用于动物的伤口来向动物施用孢子。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
可选地或另外地，该方法包括通过将外孢壁片段施用于动物的伤口来向动物施用外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该方法优选包括将外孢壁片段施用于动物的伤口。
该方法可以预防或治疗伤口感染。
该方法可以预防或抑制伤口中的生物膜形成或促进生物膜在伤口内的溶解。
该方法可包括将外孢壁片段或孢子以包含外孢壁片段或孢子和药学上可接受的载体的药物组合物施用于伤口。
组合物可包含溶液，洗剂，乳膏，软膏，凝胶，泡沫，喷雾剂，浸渍剂或浴液。
本文所述的任何药物组合物可包含溶液，洗剂，乳膏，软膏，凝胶，泡沫，喷雾剂，浸渍剂或浴液。这种组合物适用于动物的伤口。
本文所述的任何药物组合物可以在粘合贴剂或伤口敷料中提供。
提供了包含药物组合物的粘合贴剂或伤口敷料。药物组合物包含药学上可接受的载体和表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，粘合贴剂或伤口敷料可包含药物组合物，其包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在任何涉及将外孢壁片段或孢子施用于动物伤口的方法中，在任何适用于动物伤口或任何粘合贴剂或伤口敷料的组合物中，蛋白质保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包括，例如，酶，抗菌肽，内毒素(例如δ内毒素)，Cry蛋白，抗真菌肽或蛋白质，或其任何组合。
酶可包含腺苷三磷酸双磷酸酶，内酯酶，蛋白酶，葡聚糖酶，几丁质酶或其任何组合。
当酶包含腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可包括本文所述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶，包括第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。
当酶包含内酯酶时，内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶，包括第I.B部分中描述的任何AiiA内酯酶。
当酶包含抗菌肽时，酶可包含本文所述的任何抗菌肽，包括第I.B部分中描述的任何LfcinB或LysM肽。
在任何涉及将外孢壁片段或孢子施用于动物伤口的方法中，在任何适用于动物伤口或任何粘合贴剂或伤口敷料的组合物中，病原体可以包括链球菌属的细菌病原体，葡萄球菌属的细菌病原体，假单胞菌属的细菌病原体，肠球菌属的细菌病原体，或其任何组合。可选地或另外地，病原体可包含鲍氏不动杆菌。
C.预防或治疗蹄感染的方法，用于牲畜足浴的插入托盘和蹄绷带
提供了通过预防或治疗蹄动物中的蹄感染来保护动物免于病原体的方法。这些方法可用于例如治疗感染性皮肤病(也称为蹄腐病或脚腐病)或钩端螺旋体病。
提供了一种用于保护蹄动物免于病原体的方法。该方法包括将孢子施用于动物的一个或多个蹄。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
可选地或另外地，该方法包括将外孢壁片段施用于蹄动物的一个或多个蹄。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该方法优选包括将外孢壁片段施用于动物的一个或多个蹄。
该方法可以预防或治疗影响动物蹄的感染性疾病。
感染性疾病可包括感染性皮肤病或钩端螺旋体病，鹅口疮，白线病，由密螺旋体属的细菌病原体引起的感染，由节瘤偶蹄形菌属的细菌病原体引起的感染，由梭菌属的细菌病原体引起的感染，由放线菌属的细菌病原体引起的感染，或其任何组合。
蹄动物可包括奶牛，绵羊，野牛，水牛，鹿，马，骡子，骆驼，猪或山羊。
将外孢壁片段或孢子施用于动物的一个或多个蹄可以包括使用足浴。例如，该方法可以包括使动物通过含有包含外孢壁片段或孢子和载体的组合物的足浴。当动物走过足浴时，该组合物可以足够的深度存在于足浴中，使组合物与动物蹄的感染区域接触。该组合物可包含液体，半固体，水分散性颗粒，可溶性粉末，泡沫，洗剂或凝胶。例如，该组合物可包含用于足浴的液体浓缩物或粉末。
此外，本文所述的任何药物组合物可包含液体，半固体，水分散性颗粒，可溶性粉末，泡沫，洗剂或凝胶。例如，本文所述的任何药物组合物可包含用于足浴的液体浓缩物或粉末。此类组合物适合与包括将孢子或外孢壁片段施用于蹄动物的一个或多个蹄的方法结合使用。
提供了一种用于牲畜足浴的插入托盘。插入托盘包含表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。孢子固定在插入托盘的内表面上。
可选地或另外地，插入托盘包含外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。将外孢壁片段固定在插入托盘的内表面上。
插入托盘可以插入牲畜足浴中。这里所用的关于插入托盘的术语“内表面”是指插入托盘的表面，当蹄动物进入足浴时，该表面将与蹄动物的蹄接触。
通过将孢子或外孢壁片段喷雾干燥到表面上，可以将孢子或外孢壁片段固定在插入托盘的内表面上。然后，在最终用户向插入托盘中添加水时，孢子或外孢壁片段将从插入托盘的表面释放。
插入托盘优选包含外孢壁片段。
当使用足浴并且蹄动物是奶牛动物时，施用方法和剂量方案通常将部分地取决于挤奶的频率，因为它们从挤奶厅回到他们的摊位，畜栏，谷仓或牧场时，通常可以接触到足浴单位。
足浴应用通常包括填充有至少约4至6英寸组合物的罐，或足以覆盖任何脓肿，鞋底瘀伤，趾间皮肤，叉指间隙或其中蹄上有脚腐烂，毛茸茸脚疣或蹄叶炎的任何区域。组合物应足够深，以便与蹄的任何感染区域接触。
泡沫组合物可以直接施加到蹄上以确保蹄完全被泡沫涂覆，其中泡沫应用是有效的。
凝胶应用可用于足浴系统中作为液体浸渍组合物的替代物。凝胶的主要优点是它们的厚度，这使得组合物和蹄之间的接触时间更长。
在包括将外孢壁片段或孢子施用于蹄动物的一个或多个蹄的任何方法中，可以使用蹄绷带将外孢壁片段或孢子施用于动物的一个或多个蹄。蹄绷带可包含含有外孢壁片段或孢子和载体的组合物。
提供了一种蹄绷带。蹄绷带包含药物组合物。药物组合物包含药学上可接受的载体和表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，蹄绷带包含药物组合物，其包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
孢子或外孢壁片段可以固定在绷带的表面上，该表面与蹄动物的蹄接触。
蹄绷带中的药物组合物优选包含外孢壁片段。
与蹄动物的蹄接触的蹄绷带的表面可包括织物或泡沫，并且将孢子或外孢壁片段固定在蹄绷带的表面上可包括将织物或泡沫浸泡在包含孢子或外孢壁片段的溶液中。可选地或另外地，孢子或外孢壁片段可悬浮在油，乳液，聚合物或凝胶中。然后可以用油，乳液，聚合物或凝胶浸渍蹄绷带。当绷带由最终用户施加到蹄动物的蹄上时，外孢壁片段或孢子将从绷带释放。
蹄绷带允许感染的蹄保持无水并延长组合物与感染的蹄的接触。
在任何方法中，包括将外孢壁片段或孢子以适用于此类方法的任何组合物，任何插入托盘，或任何蹄绷带施用于蹄动物的一个或多个蹄，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽(例如LfcinB)，溶菌酶或溶菌酶肽(例如LysM)，蛋白酶，葡聚糖酶，抗微生物肽或蛋白质，腺苷三磷酸双磷酸酶，内酯酶或其任何组合。
LfcinB可包含本文所述的任何LfcinB肽，包括第I.B部分中描述的任何LfcinB肽。
LysM可包含本文所述的任何LysM肽，包括第I.B部分中描述的任何LysM肽。
蛋白酶可包含本文所述的任何蛋白酶，包括第I.B部分中描述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
葡聚糖酶可包含本文所述的任何葡聚糖酶，包括第I.B部分中描述的任何β-1,3-葡聚糖酶。
腺苷三磷酸双磷酸酶可包括本文所述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶，包括第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。
内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶，包括第I.B部分中描述的任何AiiA内酯酶。
对于任何包括将外孢壁片段或孢子施用于蹄动物的一个或多个蹄的方法，对于任何适合用于此类方法的组合物，对于任何插入盘，或对于任何蹄绷带，病原体可包括坏死梭杆菌，黑色素原菌，小孢子菌，钩端螺旋体属的细菌病原体，放线菌属的细菌病原体，密螺旋体属的细菌病原体，节瘤偶蹄形菌，梭菌属的细菌病原体，或其任何组合。
病原体可包含两种或更多种病原体的混合物。
D.用于预防或治疗反刍动物臃肿的方法，饲料和饲料添加剂
提供了用于预防或治疗反刍动物臃肿的方法。当向饮食中添加大量淀粉时，会发生瘤胃臃肿(瘤胃酸中毒)。在这些条件下，某些细菌如牛链球菌的生长不再受到缺乏这种能源的限制，并且牛链球菌的细菌种群比其它种类的瘤胃细菌生长得更快。牛链球菌产生乳酸，一种比乙酸、丙酸或丁酸强十倍的酸，其积累最终超过导致疾病的瘤胃液的缓冲能力。
提供了一种用于保护反刍动物免于病原体的方法。该方法包括将孢子口服施用于反刍动物。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
可选地或另外地，该方法包括将外孢壁片段口服施用于反刍动物。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该方法优选包括将外孢壁片段口服施用于反刍动物。
例如，通过将孢子或外孢壁片段喂给反刍动物，可以将孢子或外孢壁片段口服施用于反刍动物。
反刍动物可包括奶牛，绵羊，野牛，山羊，鹿或马。
该方法可以治疗或预防反刍动物臃肿。
提供了饲料和饲料添加剂。饲料或饲料添加剂包含外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在用于保护反刍动物免于病原体的任何方法或任何饲料或饲料添加剂中，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽(例如LfcinB)，溶菌酶或溶菌酶肽(例如LysM)，抗微生物蛋白或肽，酶(例如腺苷三磷酸双磷酸酶，蛋白酶，葡聚糖酶，内酯酶或其任何组合)，或其任何组合。
LfcinB可包含本文所述的任何LfcinB肽，包括第I.B部分中描述的任何LfcinB肽。
LysM可包含本文所述的任何LysM肽，包括第I.B部分中描述的任何LysM肽。
腺苷三磷酸双磷酸酶可以是本文所述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶，包括第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。
蛋白酶可包含本文所述的任何蛋白酶，包括第I.B部分中描述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
葡聚糖酶可包含本文所述的任何葡聚糖酶，包括第I.B部分中描述的任何β-1,3-葡聚糖酶。
内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶，包括第I.B部分中描述的任何AiiA内酯酶。
病原体可包括牛链球菌，坏死梭杆菌或其组合。
E.用于预防或治疗动物乳腺炎的方法和组合物
提供了用于预防或治疗动物乳腺炎的方法。
提供了一种用于保护动物免于病原体的方法。该方法包括向动物施用孢子以预防或治疗乳腺炎。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
可选地或另外地，该方法包括向动物施用外孢壁片段以预防或治疗乳腺炎。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该方法优选包括施用外孢壁片段。
动物可包含乳品动物
动物可包括山羊，奶牛，绵羊，水牛，骆驼，牦牛，马，驯鹿，人，狗，猫或驴。
该方法可包括以包含外孢壁片段或孢子和药学上可接受的载体的组合物施用外孢壁片段或孢子。
可以将组合物局部施用于动物的乳房或乳头。
局部施用可包括将动物的乳房或乳头浸入组合物中，将组合物喷雾到动物的乳房或乳头上，或其组合。
乳腺炎可包括真菌性乳腺炎(例如由新型隐球菌，白色念珠菌，原壁菌属的真菌病原体或其组合引起的真菌性乳腺炎)。
乳腺炎可包括细菌性乳腺炎(例如由葡萄球菌属的细菌病原体，埃希氏菌属的细菌病原体或其组合引起的细菌性乳腺炎)。
当乳腺炎包括细菌性乳腺炎时，该方法可以进一步包括共同施用抗生素。
本文所述的任何药物组合物可以是乳头浸渍组合物的形式。此类组合物适用于预防或治疗乳腺炎的方法。
该组合物可进一步包含抗生素。
然而，本文所述的用于预防或治疗乳腺炎的组合物和方法的一个优点是它们可以避免过度使用抗生素。因此，该方法优选不进一步包括抗生素的共同施用。同样，组合物优选不进一步包含抗生素。
在使用抗生素的方法或组合物中，抗生素可包含β-内酰胺(例如阿莫西林，头孢噻呋，头孢匹林，clooxillin，海他西林，青霉素或其任何组合)，林可酰胺(例如吡利霉素)，或其组合。
在用于预防或治疗乳腺炎的任何方法中或在任何适用于预防或治疗乳腺炎的方法中的组合物中，保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含葡聚糖酶(例如β-1,3-葡聚糖酶)，裂解酶，几丁质酶，腺苷三磷酸双磷酸酶，抗菌肽或蛋白质，蛋白酶，乳铁蛋白或乳铁蛋白肽(例如LfcinB)，溶菌酶或溶菌酶肽(例如LysM)，内酯酶，或其任何组合。
LfcinB可包含本文所述的任何LfcinB肽，包括第I.B部分中描述的任何LfcinB肽。
LysM可包含本文所述的任何LysM肽，包括第I.B部分中描述的任何LysM肽。
腺苷三磷酸双磷酸酶可以是本文所述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶，包括第I.B部分中描述的任何腺苷三磷酸双磷酸酶。
蛋白酶可包含本文所述的任何蛋白酶，包括第I.B部分中描述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
葡聚糖酶可包含本文所述的任何葡聚糖酶，包括第I.B部分中描述的任何β-1,3-葡聚糖酶。
内酯酶可包含本文所述的任何内酯酶，包括第I.B部分中描述的任何AiiA内酯酶。
几丁质酶可以是本文所述的任何几丁质酶，包括第I.B部分中描述的任何内切壳酶。
F.用于预防或治疗动物中的昆虫、螨虫或线虫感染或侵染的方法和组合物
提供了用于预防或治疗动物中昆虫或蠕虫感染的方法。
提供了通过预防或治疗昆虫、螨虫或线虫感染或侵染来保护动物免于病原体的方法。该方法包括向动物或昆虫、螨虫或线虫施用孢子。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
可选地或另外地，该方法包括将外孢壁片段施用于动物或昆虫、螨虫或线虫。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
动物可包括家畜，人或伴侣动物。
动物可以包括奶牛，马，绵羊，山羊，猪，野牛，骆驼，驴，骡子，牦牛，驯鹿，美洲驼，兔子，狗，猫，雪貂，沙鼠，豚鼠，仓鼠，老鼠，兔子，老鼠，火鸡，鸡，鹅或鸭子。
该方法可以预防或治疗苍蝇或苍蝇幼虫侵染(例如马或奶牛的苍蝇或苍蝇幼虫侵染)。
该方法可以预防或治疗螨虫侵染(例如人类中的螨虫感染)。
该方法可包括将外孢壁片段或孢子局部施用于动物。
例如，该方法可包括通过局部喷雾剂，局部洗剂，局部乳膏，局部凝胶或其任何组合施用外孢壁片段或孢子。
本文所述的药物组合物，特别是本文所述的局部药物组合物，可以与预防或治疗昆虫、螨虫或线虫感染或侵染的方法联合使用。
在任何药物组合物中或用于预防或治疗昆虫的任何方法中。保护动物免于病原体的蛋白质或肽可以包括Mtx1，δ内毒素，Cry毒素，几丁质酶，分泌的杀虫(Sip)蛋白或其任何组合。
Mtx1可包含本文所述的任何Mtx1蛋白，包括第I.B部分中描述的任何Mtx蛋白。
该方法可包括预防或治疗线虫感染。
该方法可包括将外孢壁片段或孢子喂食给线虫。
保护动物免于病原体的蛋白质或肽可包含杀线虫蛋白质或肽。
提供了杀线虫组合物。该组合物包含载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种杀线虫蛋白或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在用于预防或治疗线虫感染的任何方法中或在任何杀线虫组合物中，杀线虫蛋白质或肽可包含几丁质酶，Cry蛋白，δ内毒素或其任何组合。
几丁质酶可包含本文所述的任何几丁质酶，包括第I.B部分中描述的内切壳酶。
几丁质酶可包含几丁质酶C，几丁质酶D或其组合。
Cry蛋白可包含Cry5B蛋白，Cry21A蛋白或其任何组合。
Cry21A蛋白可包含本文所述的任何Cry21A蛋白，包括第I.B部分中描述的Cry21A蛋白。
在用于预防或治疗线虫感染的任何方法中或在任何杀线虫组合物中，外孢壁片段可包含来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达Cry毒素，杀线虫毒素，几丁质酶，蛋白酶抑制剂蛋白，或其任何组合。
在用于预防或治疗线虫感染的任何方法中，该方法可以进一步包括施用来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达Cry毒素，杀线虫毒素，几丁质酶，蛋白酶抑制剂蛋白，或其组合。
在任何杀线虫组合物中，组合物可进一步包含来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达Cry毒素，杀线虫毒素，几丁质酶，蛋白酶抑制剂蛋白或其组合。
在用于预防或治疗线虫感染的任何方法中，该方法可以进一步包括施用Cry蛋白或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种Cry蛋白以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在任何杀线虫组合物中，组合物可进一步包含Cry蛋白或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种Cry蛋白以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
G.通过杀死病原体的昆虫载体、杀虫和杀螨组合物和昆虫喷雾器来保护动物免于
病原体的方法
提供了通过杀死病原体的昆虫载体来保护动物免于病原体的方法。
提供了通过杀死病原体的昆虫或螨虫载体来保护动物免于病原体的方法。该方法包括使昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫与重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子接触。重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白。融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，该方法包括使昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫与外孢壁片段接触。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该方法优选包括使昆虫或螨虫或其幼虫或龄虫与外孢壁片段接触。
提供了杀虫或杀螨组合物。该组合物包含载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种蛋白质或肽，其对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性。融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
该组合物可适用于局部施用。例如，可以是乳液，凝胶，乳霜或乳液的形式。
组合物可以是干粉，滤饼或水分散性颗粒的形式。
本文所述的任何杀虫或杀螨组合物，包括本节中描述的那些和上文第IV部分中描述的那些，可适用于昆虫喷雾器。
提供了一种昆虫喷雾器。昆虫雾化器包含表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的载体和孢子。融合蛋白包含至少一种蛋白质或肽，其对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性。融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
可选地或另外地，昆虫雾化器可包含载体和外孢壁片段。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种蛋白质或肽，其对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性。融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在任何涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的方法中，在任何杀虫或杀螨组合物中，或在任何昆虫喷雾器中，具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽优选不包含核酸结合蛋白或肽。
在涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法中，在任何杀虫或杀螨组合物中，或在任何昆虫喷雾器中，具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽可包含杀虫细菌毒素(例如VIP杀虫蛋白)，杀螨细菌毒素，内毒素(例如δ内毒素)，Cry毒素，蛋白酶抑制剂蛋白或肽(例如胰蛋白酶抑制剂或箭头蛋白酶抑制剂)，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素(例如Mtx样杀蚊毒素，Bin样杀蚊毒素或其组合)，半胱氨酸蛋白酶，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，几丁质酶或其任何组合。
Mtx1样杀灭蚊毒素可包含Mtx1蛋白。Mtx1蛋白可包含本文所述的任何Mtx1蛋白，包括第I.B部分中描述的任何Mtx1蛋白。
Cry毒素可包含来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素。
Cry毒素可包含Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白质或Cyt1Aa蛋白质。
丝氨酸蛋白酶可包含本文所述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，包括第I.B部分中描述的任何枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
几丁质酶可包含本文所述的任何几丁质酶，包括第I.B部分中描述的任何内切壳酶。
对于涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法，对于任何杀虫或杀螨组合物，或对于任何昆虫喷雾器，昆虫或螨虫载体可包括跳蚤，蝇(例如白蛉或黑蝇)，蜱，螨，蚊子，刺客虫或其任何组合。
昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫可包括跳蚤，苍蝇(例如白蛉或黑蝇的幼虫)，蜱，螨，蚊子，刺客虫的幼虫，或其任何组合。
对于涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法，对于任何杀虫或杀螨组合物，或对于任何昆虫喷雾器，病原体可包括黄热病病毒，登革热病毒，耶尔森菌属的细菌病原体，盘尾丝虫属的致病性蠕虫，寨卡病毒，欧利希氏体属的细菌病原体，无形体属的细菌病原体，伯氏疏螺旋体属的细菌病原体，巴贝虫属的病原体，利什曼原虫属的病原性原生生物，锥虫属的病原性原生生物，血吸虫属的病原性原生生物，西尼罗河病毒，疟原虫属的病原性原生生物，立克次体属的细菌病原体，川崎病毒，基孔肯雅病毒，恶丝虫属的致病性蠕虫，东部马脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，LaCrosse脑病病毒，西部马脑炎病毒，Pappataci病毒或其任何组合。
在涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法中，在任何杀虫或杀螨组合物中，或在任何昆虫喷雾器中，外孢壁片段可包含来源于天然表达杀虫毒素(例如Cry蛋白)、杀螨毒素或其组合的蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段。
对于涉及杀死病原体的昆虫或蜘蛛纲动物载体的任何方法，该方法可以进一步包括施用来源于天然表达杀虫毒素(例如Cry蛋白)、杀螨毒素或其组合的蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段。
在任何杀虫或杀螨组合物中，或在任何昆虫喷雾器中，组合物或昆虫喷雾器可进一步包含来源于天然表达杀虫毒素(例如Cry蛋白)、杀螨毒素或其组合的蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段。
在涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法中，该方法可以进一步包括施用杀虫毒素(例如Cry蛋白)、杀螨毒素或其组合或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种杀虫毒素(例如Cry蛋白)或杀螨毒素以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在任何杀虫或杀螨组合物中，或在任何昆虫喷雾器中，组合物或昆虫喷雾器可进一步包含杀虫毒素(例如Cry蛋白)、杀螨毒素或其组合或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种杀虫毒素(例如Cry蛋白)或杀螨毒素以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
在涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法中，该方法可包括使昆虫或螨虫载体或昆虫载体的幼虫与外孢壁片段或孢子接触，包括将包含外孢壁片段或孢子的组合物喷雾到昆虫或幼虫的环境中，将包含外孢壁片段或孢子的组合物施用于水体或昆虫繁殖场，将外孢壁片段或孢子施用于病原体宿主，或其任何组合。
将包含外孢壁片段或孢子的组合物喷雾到环境中可包括使用喷雾器。
在涉及杀死病原体的昆虫或螨虫载体的任何方法中，该方法可包括通过用包含外孢壁片段或孢子的组合物喷雾宿主以将外孢壁片段或孢子施用于宿主病原体，将宿主浸入包含外孢壁片段或孢子或其组合的组合物中。
VI.用于在动物中产生免疫应答的方法
提供了一种在动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括将上述第IV.B部分中描述的任何疫苗组合物施用于动物。
还提供了在水生动物中产生免疫原性应答的方法。
提供了一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括将外孢壁片段施用于水生动物。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。通过将水生动物浸入包含外孢壁片段的溶液中，将外孢壁片段施用于水生动物。
可选地或另外地，该方法包括向水生动物施用孢子。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。通过将水生动物浸入包含孢子的溶液中，将孢子施用于水生动物。
提供了另一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括将外孢壁片段施用于水生动物。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。水生动物选自鱼类，两栖动物，甲壳类动物，软体动物及其任何组合。
在用于在水生动物中产生免疫原性应答的任何方法中，将外孢壁片段施用于水生动物可导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌，鱼孢霉及其组合。
提供了另一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法。该方法包括将外孢壁片段施用于水生动物。外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，并包含融合蛋白。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。向水生动物施用外孢壁片段导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌，鱼孢霉及其任何组合。
可选地或另外地，该方法包括向水生动物施用孢子。孢子是表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。向水生动物施用孢子导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌，鱼孢霉及其任何组合。
在用于在水生动物中产生免疫原性应答的任何方法中，该方法优选包括施用外孢壁片段。
当目标蛋白质或肽是抗原或免疫原时，在孢子外部或外孢壁片段上展示抗原或免疫原提供免疫系统反应以实现针对各种病原体或疾病的疫苗接种。合适的抗原或小分子是已知或预期会产生所需免疫应答的那些，当在蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外部表达或展示在外孢壁片段上时，所述免疫应答足以产生治疗或保护作用。一旦将重组抗原掺入外孢壁中，大部分的适合性将通过三维结构中的折叠来确定，即重组分子的抗原部分必须可用于免疫系统的检测。
抗原或免疫原可包含热休克蛋白，外壳蛋白，荚膜蛋白，外膜蛋白，细胞壁蛋白，鞭毛蛋白，菌毛蛋白，纤毛蛋白，睫状蛋白，蛋白质毒素，i抗原或其任何组合。
通过将水生动物浸入包含外孢壁片段或孢子的溶液中，通过将外孢壁片段或孢子喂给水生动物，通过将外孢壁片段或孢子注射到水生动物中，或其任何组合，可以将外孢壁片段或孢子施用于水生动物。
注射可包括肌内注射。
通过将水生动物浸入包含外孢壁片段、孢子或其组合的溶液中，可以将外孢壁片段或孢子施用于水生动物。
外孢壁片段或孢子可以包含载体和外孢壁片段、孢子或其组合的组合物施用。
该组合物可进一步包含佐剂。在上文第IV.B.3部分中描述了与在水生动物中产生免疫原性应答有关的合适佐剂。
水生动物可选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物或其任何组合。
例如，水生动物可选自鱼类，甲壳类动物或其组合。
当水生动物包括鱼类时，鱼类可包括爱好鱼，鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼，鲟鱼，或其任何组合。
当水生动物包含甲壳类动物时，甲壳类动物可包括河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹，小龙虾或其任何组合。
当水生动物包括软体动物时，软体动物可包括贻贝，蛤，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼，章鱼或其任何组合。
该方法可包括将外孢壁片段施用于水生动物的卵。
VII.施用途径
在本文所述的任何方法中，其中将组合物、外孢壁片段或孢子施用于动物，可通过局部，口服，腹膜内，动脉内，静脉内，肌肉内，皮下，胸膜内，鼻内，直肠，皮内，吸入，透皮或经上皮施用，或通过将动物浸入包含外孢壁片段或孢子的溶液中，以将外孢壁片段或孢子施用于动物。
也可以使用任何这些施用途径的组合。
当施用包括口服施用时，可将组合物、外孢壁片段或孢子加入食物或水中，其中食物或水然后被动物食用。
VIII.使用前灭活孢子
在本文所述的任何方法中，包括使用重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，该方法可以进一步包括在该方法中使用前灭活孢子。
因此，该方法可以包括在将疫苗组合物施用于动物之前，在将孢子施用于动物之前，在将孢子施用于动物环境之前，在将孢子施用于病原体之前，在将孢子引入水产养殖系统之前，在将昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫与孢子接触之前，或在将孢子施用于水生动物之前，灭活重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
本文所述的任何重组蜡状芽孢杆菌家族成员可以是孢子的形式，其中孢子是灭活的。
在包含孢子的任何组合物，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带或昆虫雾化器中，孢子可以是灭活的。
例如，孢子可以物理或化学灭活，例如通过热处理，γ辐射，X射线辐射，UV-A辐射，UV-B辐射，或用溶剂如戊二醛，甲醛处理，过氧化氢，乙酸，漂白剂，氯仿或苯酚，或其任何组合。可选地，通过引入导致孢子完全或部分失活的突变，可以使孢子遗传失活。
已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1.使用各种靶向序列以在苏云金芽孢杆菌的表面上表达脂肪酶
与BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)具有高度同源性的广泛多种靶向序列可用于在蜡样芽孢杆菌家族成员表面上呈现酶、蛋白质、以及肽。若干靶向序列是通过制备含有与枯草芽孢杆菌脂肪酶连接的靶向序列的融合蛋白来比较。使用靶向序列的天然启动子合成融合构建体，克隆到复制质粒pMK4中，并且引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。苏云金芽孢杆菌BT013A于2014年3月10日保藏于美国农业部(USDA)农业研究服务中心(ARS)，地址为1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，并指定NRRL保藏号B-50924。苏云金芽孢杆菌BT013A也称为苏云金芽孢杆菌4Q7。
通过在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的营养琼脂板上温育3天将菌株用于孢子形成中。将孢子收集，洗涤，并且以1×108/ml的比率再悬浮于PBS中。将每种融合构建体孢子的1×105个孢子悬浮在400μl dH2O中。将反应与反应组分一起温至所需反应温度(40℃)。添加200μl工作缓冲液(9：1溶液A：溶液B)。溶液A是50mM Tris pH 10和13.6mM脱氧胆酸且溶液B是3mg/ml于异丙醇中的对硝基苯基棕榈酸。将反应物在40℃下温育10分钟并置于冰上，离心以除去孢子，并且记录在420nm下的吸光率。结果显示于以下表4中。根据包含融合至枯草芽孢杆菌脂肪酶的SEQ ID NO：1的氨基酸1-35的对照融合蛋白对活性进行归一化。
表4.
| 菌株 | 靶向序列 | 酶 | 相对活性 |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:1的氨基酸1–35 | 脂肪酶 | 100％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:3的氨基酸1–27 | 脂肪酶 | 92.5％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:7的氨基酸1–28 | 脂肪酶 | 13.5％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:9的氨基酸1–24 | 脂肪酶 | 24.8％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:13的氨基酸1–33 | 脂肪酶 | 98.5％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:21的氨基酸1–33 | 脂肪酶 | 107.8％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:96 | 脂肪酶 | 137.1％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:98 | 脂肪酶 | 146.3％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:100 | 脂肪酶 | 115.7％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:104 | 脂肪酶 | 81.5％ |
与脂肪酶连接的若干靶向序列在孢子表面上产生更高的表达水平和酶活性。具体地，SEQ ID NO：96、98以及100(各自含有较短的靶向序列)在BEMD孢子表面上产生增加的融合表达。所有含有测试的靶向序列的融合蛋白都导致脂肪酶的表面呈现。
实施例2.使用各种外孢壁序列以在苏云金芽孢杆菌表面上表达脂肪酶并且论证融合蛋白在外孢壁表面上的定位
广泛多种外孢壁蛋白可用于在蜡样芽孢杆菌家族成员表面上呈现酶、蛋白质、以及肽。若干不同的外孢壁蛋白是通过如实施例1中所述制备含有与枯草芽孢杆菌脂肪酶连接的外孢壁蛋白的融合蛋白来比较。使用以下表5中所示外孢壁蛋白的天然启动子合成融合构建体，克隆到复制质粒pMK4中，并且引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。呈现各种外孢壁蛋白-枯草芽孢杆菌168脂肪酶融合体的孢子通过使转化的细菌在脑心浸液肉汤中在来自10μg/ml氯霉素的选择压力下生长，铺于营养琼脂板上，并且在30℃下温育3天来制备。3天之后，将孢子从板上洗下来，通过离心纯化，并且以1×108个CFU/ml再悬浮于PBS中。
将每种融合构建体的1×105个孢子再悬浮在400μl dH2O中。将反应与反应组分一起温至所需反应温度(40℃)。添加200μl工作缓冲液(9：1溶液A：溶液B)。溶液A是50mM TrispH 10和13.6mM脱氧胆酸，溶液B是异丙醇中的3mg/ml对硝基苯基棕榈酸。将反应物在40℃下温育10分钟并置于冰上，离心以除去孢子，并且记录在420nm下的吸光率。结果显示于以下表5中。根据与脂肪酶连接的SEQ ID NO：109对活性进行归一化。
表5.
| 菌株 | 外孢壁蛋白 | 酶 | 相对活性 |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:109 | 脂肪酶 | 100％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:110 | 脂肪酶 | 134.5％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:113 | 脂肪酶 | 17.8％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:117 | 脂肪酶 | 19.8％ |
| 苏云金芽孢杆菌BT013A | SEQ ID NO:118 | 脂肪酶 | 8.2％ |
使用SEQ ID NO.109和110的外孢壁蛋白在孢子上产生最高酶活性。所有含有外孢壁蛋白的融合蛋白都产生活性枯草芽孢杆菌168脂肪酶的表面呈现，但是在不同水平下。
使用荧光报道基因mCherry证明另外的外孢壁蛋白使融合蛋白靶向外孢壁。产生含有与mCherry报道子连接的SEQ ID NO：111、120以及110的外孢壁蛋白的融合构建体。孢子生长1.5天，收集，并且如上所述再悬浮。将7μl的荧光孢子置于Nikon E1000显微镜下并且在晚期孢子形成期间成像。环中的圆形定位指示外部孢子层定位，且外观与外孢壁蛋白的相匹配。荧光显微镜结果显示于图2中。图2A、2B以及2C是孢子的荧光显微镜图像，其分别表达包含SEQ ID NO：111、120以及110的外孢壁蛋白和mCherry报道基因的融合蛋白。所有三个融合体都显示高水平的荧光和外孢壁定位，表明其对在外孢壁表面上表达外源蛋白的潜在效用。
实施例3.使用各种靶向序列在蜡状芽孢杆菌家族成员孢子表面上表达内切葡聚糖酶
通过使BclA启动子、起始密码子和BclA的的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)与枯草芽胞杆菌168内切葡聚糖酶框内融合的同源重组克隆PCR产生的片段，从而修饰pSUPER质粒(pSUPER-BclA 20-35-Endo)(如以下实施例8所述)。产生PCR片段，其含有与枯草芽孢杆菌168内切葡聚糖酶框内融合的BclA启动子(SEQ ID NO：149)、起始密码子和BclA的氨基酸20-35。用XhoI消化这些PCR片段并连接到pSUPER质粒的SalI位点以产生质粒pSUPER-BclA 20-35-内切葡聚糖酶。然后将该质粒进行反向PCR以扩增整个质粒骨架，但不扩增对应于BclA的氨基酸20-35的序列。将该反向PCR产物与扩增来自SEQ ID NO：5、15、25、81、85、87或SEQ ID NO：1的氨基酸20-33中每一个的等同区域的PCR产物组合。因此，构建了包含以下与枯草芽胞杆菌168内切葡聚糖酶框内融合的每个下列靶向序列的构建体：(1)SEQ ID NO：1的氨基酸20-35；(2)SEQ ID NO：5的氨基酸23-38；(3)SEQ ID NO：15的氨基酸28-43；(4)SEQ ID NO：25的氨基酸9-24；(5)SEQ ID NO：81的氨基酸23-38；(6)SEQ ID NO：85的氨基酸13-28；(7)SEQ ID NO：87的氨基酸13-28和(8)SEQ ID NO：1的氨基酸20-33。每个构建体含有野生型BclA启动子和起始密码子处的甲硫氨酸，随后是与枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因框内融合的靶向序列。将这些构建体中的每一个转化到大肠杆菌中并铺板，以在加入氨苄青霉素(100μg/ml)的Luria平板上获得单个菌落。将来自每个单个菌落的质粒在加入氨苄青霉素的Luria肉汤过夜培养物中生长，并使用WIZARD SV微量制备试剂盒纯化，并通过Sanger测序验证序列。还通过分光光度法定量DNA，并将DNA引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。另外，将pSUPER-BclA-20-35Endo构建体引入到通过同源重组从其基因组中除去天然BclA蛋白(BclA敲除“BclA KO”)的苏云金芽孢杆菌BT013A中。通过在含有抗生素(四环素10μg/ml)的营养肉汤板上铺板来筛选正确的菌落。使每个阳性菌落在脑心脏输注肉汤(含有抗生素)在30℃下以300rpm生长，纯化基因组DNA并再次测序以获得基因纯度。使经验证的菌落在具有10μg/ml四环素的脑心脏输液肉汤中生长过夜，并通过基于酵母提取物的培养基中的孢子形成诱导形成孢子。
在孢子生产后48小时收集基于酵母提取物的培养基中的每个生产运行，并对所得孢子进行酶比较。通过使用羧基甲基纤维素(CMC)底物和二硝基水杨酸(DNS试剂)测定纤维素酶活性，进行内切葡聚糖酶活性的测定。使用商业来源的纤维素酶在50mM柠檬酸缓冲液(pH4.8)中制备标准品。在50mM柠檬酸缓冲液(pH4.8)中制备1％CMC(羧甲基纤维素钠盐)，以用作反应底物。将250μl孢子制剂沉淀，并将孢子重悬于150μL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.8)中。用1％DNS、1％NaOH、0.05％Na2SO4、0.2％苯酚和18.2％罗谢尔盐组成的试剂进行该反应。将150μl样品与250μl 1％CMC底物混合，并在50℃的水浴中温育15分钟。加入300μl DNS试剂，并将样品在100℃下煮沸10分钟，然后在冰上冷却。将溶液以14000×g离心5分钟以从吸光度读数中除去孢子。使用IMPLEN纳米分光光度计型号P330在540nm测定吸光度。样品一式三份进行，每次反应一份空白。酶读数的结果示于下表6中。
表6.酶水平
AA＝氨基酸
ND＝未测定
上面数据显示，使用不同的靶向序列允许控制在孢子外部的酶的表达水平。使用SEQ ID NO：1的氨基酸20-35或SEQ ID NO：85的氨基酸13-28作为靶向序列导致产生最高水平的酶。考虑到这些靶向序列之间的低度同一性(靶向序列的全长具有43.8％的同一性)，这是令人惊讶的。使用SEQ ID NO：15的氨基酸28-43或SEQ ID NO：25的氨基酸9-24导致两种植物类型中最大的植物应答。在BT013A BclA KO宿主中表达含有SEQ ID NO：1的氨基酸20-25作为靶向序列的融合蛋白导致与野生型菌株中表达相同融合蛋白相比，在孢子表面上的酶活性大量增加(263.8％)。
实施例4.使用多种靶向序列和外孢壁蛋白在蜡样芽胞杆菌家族成员孢子表面上表达磷脂酶、脂肪酶和内切葡聚糖酶
通过如上面实施例3所述，通过克隆PCR产生的片段(XhoI消化和连接)，从而修饰pSUPER质粒，所述克隆使BclA启动子、起始密码子和BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)、随后的六丙氨酸接头序列与苏云金芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C基因(PC-PLC)(pSUPER-BclA 20-35-PL)或枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA(pSUPER-BclA-20-35-脂肪酶)或枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶eglS(pSUPER-BclA-20-35-Endo)框内融合。然后将这些质粒进行反向PCR以扩增整个质粒骨架，但不扩增对应于BclA的氨基酸20-35的序列。将该反向PCR产物与扩增来自SEQ ID NO：5(即SEQ ID NO：5的氨基酸23-38)、15(即SEQ ID NO：15的氨基酸28-43)和25(即SEQ ID NO：25的氨基酸9-24)中每一个的等同区域；SEQ ID NO：120、111、121、104和114的全长外孢壁蛋白；或者SEQ ID NO：1的氨基酸20-33、20-31、21-33、23-33或23-31的PCR产物组合。这些构建体的每一个含有野生型BclA启动子、起始密码子处的甲硫氨酸，随后是与苏云金芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、枯草芽胞杆菌168脂肪酶LipA或枯草芽胞杆菌168eglS内切葡聚糖酶基因框内融合的靶向序列或外孢壁蛋白。如上述实施例3所述对这些构建体的每一个筛选正确的转化体。
在生成孢子后48小时收集基于酵母提取物的培养基中的每个生产运行，并对所得孢子进行酶比较。如上面实施例3所述进行内切葡聚糖酶的酶数据的测定。对于磷脂酶C酶测定，将1ml重组孢子以10000×g沉淀3分钟，除去上清液并弃去。然后将孢子沉淀重悬于500μl反应缓冲液(0.25mM Tris-HCL，60％甘油，20mM邻硝基苯基磷酸胆碱，pH7.2)中。酶测定的阴性对照含有无酶表达的BT013A孢子。将每个样品在37℃下温育18小时，再次离心以除去孢子，以1:1在水中稀释，并使用分光光度计读取Abs540。将其与商业购买的磷脂酶和脂肪酶对照的标准曲线进行比较，以确定U/ml活性。酶读数的结果示于表7和表8中。
表7.内切葡聚糖酶的酶水平
| 靶向序列，实验#1 | 内切葡聚糖酶水平(mU/ml) |
| 对照(H<sub>2</sub>O) | 0mU/ml |
| AA 20–35SEQ ID NO:1 | 38.2 |
| SEQ ID NO:120 | 25.7 |
| SEQ ID NO:111 | 29.7 |
| SEQ ID NO:121 | 24.4 |
| SEQ ID NO:108 | 24.0 |
| SEQ ID NO:114 | 11.0 |
| SEQ ID NO:1的AA 20–33 | 30.5 |
| 靶向序列，实验#2 | 内切葡聚糖酶水平(mU/ml) |
| SEQ ID NO:1的AA 20–31 | 48.22 |
| SEQ ID NO:1的AA 21–33 | 60.86 |
| SEQ ID NO:1的AA 23–33 | 19.93 |
| SEQ ID NO:1的AA 23–31 | 45.31 |
| SEQ ID NO:1的AA 20–35 | 54.1 |
AA＝氨基酸
许多靶向序列和外孢壁蛋白能够在孢子表面上呈现大量的活性酶，包括SEQ IDNO：108、111、114、120和121。SEQ ID NO：1的氨基酸20-31、21-33和23-31提供了与SEQ IDNO：1的氨基酸20-35类似的酶表达水平，表明较小的片段足以在孢子表面上呈现酶。只有SEQ ID NO：1的氨基酸23-33在孢子上表现出酶水平降低。
表8.磷脂酶的酶水平
AA＝氨基酸
类似于上述表7中所示的结果，当使用SEQ ID NO：1的氨基酸20-35、SEQ ID NO：5的氨基酸23-38或SEQ ID NO：120的外孢壁蛋白序列时，观察到在孢子表面上最高水平的磷脂酶或脂肪酶。
实施例5.通过使用增强的或替代的启动子元件增强BEMD系统上融合构建体的表达。
使用本文所述的一个或多个靶向序列，BEMD系统可以呈现广泛范围的蛋白质、肽以及酶。这些靶向序列中的一些对外孢壁具有高亲和力，这将对融合蛋白表达有益，但其低融合蛋白表达水平限制其在BEMD系统上的使用。对于此类融合蛋白和序列，可使用替代的高表达孢子形成启动子来代替天然启动子。
例如，SEQ ID NO:13(韦氏芽孢杆菌KBAB4基因3572的氨基酸1-39)提供非常有效的N端序列以用于将蛋白质递送给蜡样芽孢杆菌家族成员的外孢壁，如以下表9中所示。合成如本文所述的所有基因的完整形式(包括启动子区域和编码融合蛋白的区域)。当韦氏芽孢杆菌KBAB4基因3572(SEQ ID NO:177)的天然启动子元件用于表达包含融合至β-半乳糖苷酶(来自大肠杆菌)的SEQ ID NO:13的靶向序列的融合蛋白时，表达低水平的融合蛋白，从而导致孢子表面上酶活性的降低。酶活性是通过10分钟内0.5M邻硝基苯基半乳糖苷在溶液中的转化来测量。用分光光度计在ABS540下测量酶转化。用SEQ ID NO:157(炭疽杆菌BetA/BAS3290)或SEQ ID NO:178(韦氏芽孢杆菌KBAB4 YVTNβ-螺旋桨蛋白)的高表达启动子代替韦氏芽孢杆菌KBAB4基因3572的天然启动子元件导致孢子酶促活性的显著提高。另一方面，用产自于炭疽杆菌Sterne BAS1882(SEQ ID NO:176)的启动子代替韦氏芽孢杆菌KBAB4基因3572的天然启动子元件导致孢子酶促活性的下降。融合至β-半乳糖苷酶的SEQID NO:13的靶向序列的表达水平在由BAS1882的启动子(SEQ ID NO:176)驱动时要低得多(0.38X)，并且在由BetA启动子(SEQ ID NO:197)或YVTN蛋白启动子(SEQ ID NO:178)驱动时得到极大的改善。
表9.
实施例6.使用各种含有σ-K的启动子的融合蛋白的表达水平。
如以上实施例5中所示，替代靶向序列、外孢壁蛋白、或外孢壁蛋白片段的天然启动子可极大地影响在蜡样芽孢杆菌家族孢子外孢壁上表达的融合蛋白的水平。举例来说，用BclB启动子替代天然的BclA启动子极大地降低蜡样芽孢杆菌家族成员孢子表面上的融合蛋白水平。或者，用BclA启动子替代天然的BclB启动子显著地提高外孢壁上的融合蛋白水平。
各种外孢壁蛋白在其天然孢子形成启动子控制下的相对启动子表达水平是从来自Bergman等人,2008的微阵列数据处获得。在晚期孢子形成时间里(实验开始之后300分钟)测定相对表达水平，此时σ-K启动子的活性最大。σ-K启动子是外孢壁定位基因及相关蛋白表达的关键启动子。相对表达是在所有给定时间时基因表达水平与染色体所有其他基因的平均值相比的增加。以下表10显示在蜡样芽孢杆菌家族成员中多种σ-K驱动基因的相对表达水平。
表10.
实施例7.从包括敲除CotE基因的重组蜡状芽孢杆菌家族成员制备外孢壁片段。
构建质粒pUCpE，其含有能够在大肠杆菌中复制的pUC19骨架以及来自pE194的红霉素抗性盒复制起始位点。该构建体能够在大肠杆菌和杆菌菌株中复制。从炭疽杆菌ΔSterne中PCR扩增相应于CotE基因上游区域的1kb DNA区域和相应于基因CotE下游区域的1kb区域。然后利用剪接通过重叠延伸经由对应于相对PCR扩增子的15bp同源悬端将两个1kb区域剪接到一起。将该2kb片段用XhoI(外部引物中)消化并连接到pUCpE的SalI位点。通过消化和DNA测序证实该质粒构建体。将革兰氏阳性ω-卡那霉素抗性基因用BamHI消化并置于两个1-kb区域之间。对最终的构建体再次进行PCR验证和测序，并将最终的质粒引入到炭疽杆菌ΔSterne中。通过寻找红霉素抗性和卡那霉素抗性来筛选正确的克隆。
在卡那霉素(25μg/ml)存在下，在脑心脏输液肉汤中在高温(40℃)下传代克隆，并常规地将其分离到含有卡那霉素的LB琼脂平板上，并在30℃下生长。将单个菌落用牙签挑到含有5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上，并在30℃下生长。保持卡那霉素抗性但失去红霉素抗性(意味着质粒的损失，但是CotE基因的重组和除去)的克隆在脑心脏输注肉汤加卡那霉素中生长，并使用Qiagen染色体DNA分离试剂盒分离染色体DNA。通过CotE基因区域的PCR扩增和CotE的损失以及卡那霉素抗性盒的获得来确定CotE基因的适宜缺失。
制备构建体(pHP13-AcpC-eGFP)，其编码与荧光报告基因蛋白eGFP(增强型绿色荧光蛋白)读码框融合的外孢壁蛋白AcpC(酸性磷酸酶)。pHP13-Acp-eGFP构建体包括天然的AcpC启动子、核糖体结合位点和与eGFP(来自pGFPuv)读码框融合的AcpC(来自炭疽杆菌ΔSterne)的编码序列。该构建体通过使用包含相对于替代扩增子的15bp重叠区域的相应引物进行单个AcpC和eGFP基因的PCR扩增产生。然后纯化两种PCR扩增子，并结合使用含有XhoI位点的外部引物进行第二次PCR反应。两种扩增子与其相容的末端相互引导，产生融合PCR扩增子，纯化并在37℃下用XhoI消化1小时。将剪接的PCR产物克隆到pHP13的SalI位点，并将正确克隆进行序列验证并转化到SCS110大肠杆菌中，随后从大肠杆菌中分离出质粒DNA，并引入到如上所述制备的炭疽杆菌ΔSterneCotE::Kan中，其在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的脑心脏输液肉汤中培养过夜。将1毫升该培养物接种于有挡板的烧瓶中的营养肉汤(50ml)中，并在30℃下培养3天。通过10000×g离心5分钟收集孢子，通过100000Da膜过滤器过滤上清液(含有破碎的外孢壁片段)，得到含有融合蛋白的纯化外孢壁片段。
图3中示出了CotE敲除孢子的透射电子显微照片。封闭的箭头表示已经从孢子分离的外孢壁的片段，而开放的箭头表示已经从外孢壁去除的孢子。
外孢壁片段的纯化如下进行：将CotE::kan孢子在30℃下在脑心脏输注肉汤中培养过夜，涂抹到营养琼脂平板上，并在30℃下生长3天。3天后，通过用PBS润湿的棉签擦拭板，收集孢子，并在微量离心管中重新悬浮于1ml PBS中。通过离心从培养物中分离孢子，并通过0.22μM过滤器过滤含有外孢壁片段的上清液以除去残留的孢子。然后将滤液通过100kDa过滤器过滤以收集外孢壁片段，但允许freE蛋白通过过滤器。洗涤100kDa的过滤器，将收集的外孢壁片段在SDS缓冲液中煮沸5分钟，并通过SDS-PAGE电泳分离。图4提供了SDS-PAGE凝胶的照片，显示纯化的外孢壁片段(泳道2)和蛋白标记物标准物(泳道1)。泳道2中所示的外孢壁片段代表构成外孢壁片段的个体蛋白。在整个孢子SDS-PAGE制备物中通常看到的条带的仅仅一部分是明显的。
在磷酸酶分析中测试含有AcpC-eGFP融合蛋白的10微升外孢壁片段制备物对pNPP(对硝基苯基多磷酸酯)的活性。通过分光光度法，基于通过磷酸酶活性而导致的对硝基苯酚从磷酸盐的释放而检测酸性磷酸酶活性。简言之，将1ml pH6.0的磷酸盐缓冲液中的10mMpNPP与外孢壁片段在1ml微量离心管中孵育，并使其在37℃下孵育10分钟。10分钟后，将管离心1分钟以除去过量的孢子，并将上清液在分光光度计上在420nm下读取，得到游离的对硝基苯酚。发现纯化的外孢壁片段能够有效地从pNPP中释放磷酸酯基团，表明AcpC存在于外孢壁片段中。该测定的结果示于图5。在图5中，“CotE对照孢子”是指仅CotE敲除孢子(不表达AcpC-eGFP融合蛋白)，“CotE Acp-eGFP”是指表达AcpC-eGFP融合蛋白的CotE敲除孢子，“CotE AcpC-eGFP片段”是指如上所述从表达AcpC-eGFP融合蛋白的CotE敲除孢子中获得的外孢壁片段。
这些结果证实了破坏外孢壁的突变，例如CotE基因敲除突变，可以用于产生基本上没有孢子的外孢壁片段，并且证明这些外孢壁片段含有靶向外孢壁的融合蛋白。
实施例8.产生显示卵清蛋白或炭疽芽孢杆菌保护性抗原的重组蜡状芽孢杆菌家族成员。
使用下表11中所示的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来自GenScript ORF克隆OGa28271C的Gallus gallus卵清蛋白基因和炭疽芽孢杆菌保护性抗原(pagA)基因。由卵清蛋白基因编码的氨基酸序列以SEQ ID NO：217提供，由pagA基因编码的氨基酸序列以SEQID NO：218提供。
表11.
使用通过重叠延伸(SOE)技术的剪接将所得PCR片段克隆到三种表达质粒之一(pSUPER-BclA-FL，pSUPER-BclA 20-35或pSUPER-AcpC)中。通过将含有框内融合的BclA启动子(SEQ ID NO：149)、起始密码子和全长(FL)BclA的编码序列的PCR片段融合到pSUPER质粒中以产生pSUPER-BclA-FL质粒。通过将含有框内融合的BclA启动子(SEQ ID NO：149)、起始密码子和BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)的编码序列的PCR片段融合到pSUPER质粒中以产生pSUPER-BclA-20-35质粒。通过将包含框内融合的天然AcpC启动子(SEQ ID NO：141)、核糖体结合位点和AcpC(来自苏云金芽孢杆菌BT013A；SEQ ID NO：120)的编码序列的PCR片段融合到pSUPER质粒中以产生pSUPER-AcpC质粒。通过将pUC57质粒(含有氨苄青霉素抗性盒)与来自芽孢杆菌(含有四环素抗性)的pBC16-1质粒融合以产生pSUPER质粒。该5.5kbp质粒可在大肠杆菌和芽孢杆菌属中复制。
使用这些方法产生的pSUPER-BclA-FL-OVAL构建体编码包含全长BclA和卵清蛋白的融合蛋白，并且pSUPER-BclA-FL-PAG编码包含全长BclA和炭疽杆菌保护性抗原的融合蛋白。将这些构建体转化到大肠杆菌菌株中并在其中繁殖。通过DNA测序验证质粒的序列。
为了除去pSUPER质粒的大肠杆菌来源部分并产生用于在芽孢杆菌中表达的较小质粒，用扩增质粒骨架的芽孢杆菌来源区段的引物扩增序列验证的pSUPER构建体。将所得PCR产物自连接以产生pBC质粒(pBC-BclA-FL-OVAL质粒和pBC-BclA-FL-PAG)，其用于在下面的实施例中转化各种芽孢杆菌菌株。
实施例9：外孢壁片段的制备和纯化
敲除(KO)突变体：为了制备苏云金芽孢杆菌BT013A的exsY和cotE敲除(KO)突变菌株，构建了质粒pKOKI穿梭和整合载体，其含有能够在大肠杆菌中复制的pUC57骨架，以及来自pE194的红霉素抗性盒复制起始位点。该构建体能够在大肠杆菌和杆菌菌株中复制。从苏云金芽孢杆菌BT013A中PCR扩增对应于cotE基因的上游区域的1kb DNA区域和对应于基因cotE的下游区域的1kb区域。制备了第二个构建体，其包含对应于exsY基因的上游区域的1kb DNA区域和对应于基因exsY的下游区域的1kb区域，两者均从苏云金芽孢杆菌BT013A中PCR扩增得到。对于每个构建体，然后使用pKOKI质粒重叠区域的同源重组将两个1kb区域剪接在一起。通过消化和DNA测序证实质粒构建体。通过寻找红霉素抗性筛选克隆。
克隆在脑心浸液(BHI)肉汤中在高温(40℃)下传代。将单个菌落用牙签挑在含有5μg/ml的红霉素的LB琼脂平板上，在30℃下生长，并通过菌落PCR筛选作为游离质粒的pKOKI质粒的存在。继续传代发生整合事件的菌落，以筛选失去红霉素抗性的单个菌落(表示质粒损失，但重组和除去了exsY或cotE基因)。通过PCR扩增和染色体靶区域的测序来确认验证的缺失。将pBC-BclA-FL-OVAL质粒转化到exsY敲除突变体中，并将pBC-BclA-FL-PAG质粒转化到cotE KO突变体中。pBC-BclA-FL-OVAL和pBC-BclA-FL-PAG质粒在上面实施例8中描述。
外孢壁片段的产生：对于两种KO突变体的每一种，使过夜培养物在含有抗生素选择的挡板烧瓶中在30℃、300rpm下在BHI培养基中生长。将1毫升该过夜培养物接种到挡板烧瓶中的酵母提取物介质(50ml)中，并在30℃下生长3天。除去一部分孢子，加入1％吐温，涡旋搅拌1分钟以振荡孢子。通过10000×g离心5分钟收集孢子，将含有外孢壁片段的上清液过滤通过0.22μM的过滤器，以去除任何残留的孢子。将上清液(含有外孢壁片段)过滤通过100000Da膜过滤器，得到含有融合蛋白的经纯化的外孢壁片段。传达通过100kDa过滤器，去除较小分子重量的蛋白质。在上清液的滤液或渗出物中没有发现孢子。
透射电子显微照片如图6所示，其显示了由附着的外孢壁包围的苏云金芽孢杆菌BT013A的完整孢子(图A)，苏云金芽孢杆菌BT013A ExsY敲除突变体的孢子(图B)，以及苏云金芽孢杆菌BT013A CotE敲除突变体的孢子(其中外孢壁已经脱离)(图C)。图6的图A中的箭头表示完整BT013A孢子的外孢壁层，而图6的图B和C中的箭头表示已经与CotE和ExsY突变体两者中的孢子分离的外孢壁。在JEOL JEM 1400透射电子显微镜上拍摄图像。当表达融合蛋白的对照孢子(CotE未敲除的表达BclA-FL-OVAL融合蛋白的苏云金芽孢杆菌BT013A，数据未显示)进行上述相同的离心和过滤步骤时，未观察到可见的外孢壁片段。
在CotE和ExsY敲除突变体中收集的外孢壁片段中存在BclA-FL-OVAL或BclA-FL-PAG保护性抗原：如上所述从含有pBC-BclA-FL-OVAL或pBC-BclA-FL-PAG质粒的孢子产生和纯化外孢壁片段。这些孢子产生含有融合蛋白的外孢壁，所述融合蛋白包含全长BclA和卵清蛋白或保护性抗原A。含有这些构建体的外孢壁片段由cotE敲除突变体孢子和exsY敲除突变体孢子产生。通过斑点印迹测定卵清蛋白或保护性抗原A蛋白质浓度。下表12总结了与纯化蛋白质相比的斑点印迹结果。简而言之，将如上所述产生的富含外孢壁片段部分、全细胞肉汤或纯化的卵清蛋白或保护性抗原印迹到硝酸纤维素上，然后用市售的针对全长卵清蛋白或炭疽芽孢杆菌保护性抗原的兔多克隆抗体进行探测。如上文实施例9中所述从过夜培养物中取出全细胞肉汤，并且不进行任何涡旋、过滤或离心步骤。然后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗发展印迹。卵清蛋白和保护性抗原抗体通过Western印迹验证大小和特异性。使用纯化的卵清蛋白和保护性抗原蛋白进行蛋白质印迹。卵清蛋白和保护性抗原抗体识别正确大小的条带，并且不与来自苏云金芽孢杆菌BT013A的未转化的全细胞肉汤交叉反应。
斑点印迹结果显示在下表12中。结果显示目标蛋白质(OVAL或PAG)存在于全细胞肉汤和富含外孢壁片段的级分中。大多数感兴趣的蛋白质保留在富含外孢壁的片段中，证明目标蛋白质存在于外孢壁片段上。
表12：由多克隆抗体检测的PAG和OVAL表达
实施例10.从CotE和ExsY敲除和CotO显性负性突变体收集的外孢壁片段中存在BclA 20-35-内切葡聚糖酶
为了进一步证明可以使用CotE敲除和ExsY敲除菌株产生含有融合蛋白的外孢壁片段，并且为了证明可以使用CotO显性负性菌株产生外孢壁片段，产生含有与枯草芽孢杆菌168内切葡聚糖酶框内融合的BclA启动子(SEQ ID NO：149)、起始密码子和BclA的氨基酸20-35的PCR片段。用XhoI消化这些PCR片段并连接到pSUPER质粒的SalI位点以产生质粒pSUPER-BclA 20-35-内切葡聚糖酶。
如上文实施例9中所述产生CotE和ExsY敲除突变体。
显性负性突变体：为了产生显性负性突变体，对CotO(SEQ ID NO：199)的N-末端一半和C-末端一半进行PCR扩增，分别含有1-81和81-199氨基酸。使用同源重组将这些片段克隆到pHP13大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体中。通过Sanger测序验证正确的克隆。将两种CotO显性负性突变体中的每一种引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。
如实施例9中所述，从含有pSUPER BclA 20-35-Endo质粒的孢子中产生和纯化外孢壁片段。这些孢子产生外孢壁，其显示包含与内切葡聚糖酶连接的全长BclA的融合蛋白。含有该构建体的外孢壁片段由cotE敲除突变体孢子、exsY敲除突变体孢子、CotO N末端显性负性突变体孢子或CotO C末端显性负性突变体孢子产生。在这些实验的每一个中，外孢壁片段上内切葡聚糖酶的活性量被定量为总酶水平的百分比。将这些结果与使用不含任何突变但确实含有pSUPER BclA 20-35-Endo质粒的野生型苏云金芽孢杆菌BT013A产生的结果进行比较。结果如下表13所示。
表13：外孢壁片段的酶活性
这些结果表明，破坏外孢壁的突变，例如cotE或exsY基因中的敲除突变或CotO蛋白中的显性负性突变，可以用于产生基本上不含孢子的外孢壁片段，并且表明这些外孢壁片段含有靶向外孢壁的融合蛋白。这些片段可以用于促进植物生长和其他应用中。无突变并且表达BclA 20-35 Endo构建体(BT013A BclA 20-35 Endo)的BT013菌株的外孢壁片段制备物中具有少量的背景内切葡聚糖酶活性。这是意想不到的，其可能代表低水平的不稳定的外孢壁从孢子释放并在外孢壁片段收集过程中被捕获。CotE和ExsY KO菌株在外孢壁片段级分中含有最高量的酶。表达融合蛋白的CotO显性负性突变体在外孢壁片段级分中也具有升高的酶水平。
实施例11：使用外孢壁片段接种鱼类并同时产生针对两种抗原的保护。
使用含有与抗原蛋白连接的全长BclA的外孢壁片段接种鱼，并用于同时产生针对两种不同抗原的免疫：如上文实施例9中所述，与卵清蛋白连接的全长BclA(pBC-BclA-FL-OVAL)在exsY KO突变体中表达，与保护性抗原连接的全长BclA(pBC-BclA-FL-PAG)在cotEKO突变体中表达。如上文实施例9中所述制备纯化的外孢壁片段。
将纯化的外孢壁片段稀释到无内毒素的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，使终浓度为1mg/ml蛋白质。在有和没有弗氏完全佐剂(FCA)下，将两种类型的纯化的外孢壁片段(来自含有BclA-FL-OVAL融合蛋白的exsY KO突变体的片段和来自含有BclA-FL-PAG融合蛋白的cotE KO突变体的片段)共注射或喂食给成年斑马鱼。收集肾组织并检查抗体反应(通过斑点印迹)和特异性抗体(ELISA)的检测。
使用两种不同的免疫方法：肌内注射和饲料免疫。对于通过肌内注射免疫，用0.168mg/ml三卡因(3-氨基苯甲酸乙酯)麻醉鱼。成年斑马鱼肌肉注射在背鳍和侧线之间，用5μl外孢壁片段溶液(含有两种类型的外孢壁片段)和带有36G针头的精细Hamilton注射器，以防止递送的负面影响。
还进行了饲料免疫。给斑马鱼提供免疫食物混合物，其含有1:10比例的在肝糊中携带BclA-抗原融合蛋白的纯化的外孢壁片段，其通过口服液体手动喂入每只动物的储存罐中以确保摄入总量。
对于任一免疫方法均未进行加强免疫。
通过斑点印迹分析和ELISA检测注射或喂食含有BclA-抗原融合蛋白的外孢壁片段的鱼中的抗体：通过肌内注射免疫的鱼中OVAL特异性抗体、PAG特异性抗体和记忆抗体的产生是在免疫接种后14天，在每组8只动物中测量肾脏。通过浸入冰中使斑马鱼安乐死。从每条鱼中取出肾脏并在冰上合并成一组，均质化，并离心以沉淀细胞碎片。测定含有可溶性蛋白质的上清液的活性。
在饲养测定中，在免疫后3、5和7天处死动物，每组3只动物，并测定免疫应答的产生。以与上述通过注射免疫的动物相同的方式收集血清和肾脏。下表14显示了在该饲养测定中通过斑点印迹分析对斑马鱼免疫细胞测定的免疫应答。为了检测斑马鱼IgM(zIgM)，将肾裂解物连续稀释并将2μL置于硝酸纤维素膜上并使其干燥。将膜用PBST(具有TWEEN去污剂的磷酸盐缓冲盐水)洗涤三次，然后用PBST中的5％(w/v)脱脂乳封闭2小时。用PBST洗涤后，将单克隆小鼠抗zIgM与膜一起温育2小时。来自未免疫斑马鱼的裂解物作为阴性对照。在进一步洗涤步骤后，将膜与抗小鼠HRP连接的抗体以1：3000的稀释度作为第二抗体温育1小时。最后，通过用PIERCE Fast Western Blot Kit Enhanced Chemiluminescense(ECL)底物(过氧化物酶底物)显色来观察膜。结果显示在下表14中。使用GENESYS图像采集软件量化图像。
表14：通过肾脏免疫细胞生成评估的斑马鱼对外孢壁片段喂养的免疫反应
对于通过肌内注射免疫的斑马鱼，还通过酶联免疫吸附测定(ELISA)用NUNCIMMUNO板(用于ELISA测定的96孔板)测定靶特异性抗体的产生。简而言之，在免疫后从斑马鱼中收集样品以检测zIgM免疫细胞是否将与由兔产生的多克隆OVAL抗体交叉反应。通过与zIgM温育过夜来包被平板。将肾裂解物连续稀释并使其与zIgM包被的板结合以从样品中回收所有免疫球蛋白。然后使卵的兔多克隆抗体与特异性鱼免疫球蛋白结合。然后将辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗兔用作缀合物以开发ELISA。用BIO-TEK酶标仪和GEN5软件定量结果。
为了通过斑点印迹检测zIgM，将肾细胞裂解物连续稀释并置于固相PVDF膜上并使其干燥。将膜用PBST(具有TWEEN去污剂的磷酸盐缓冲盐水)洗涤三次，然后用PBST中的5％(w/v)脱脂乳封闭2小时。用PBST洗涤后，将单克隆小鼠抗zIgM与膜一起温育2小时。来自未免疫斑马鱼的裂解物作为阴性对照。在进一步洗涤步骤后，将膜与抗小鼠HRP连接的抗体以1：3000的稀释度作为第二抗体温育1小时。最后，通过用PIERCE Fast Western Blot KitEnhanced Chemiluminescense(ECL)底物(过氧化物酶底物)显色来观察膜。结果显示在下表15中。*表示与阴性对照(注射盐水)相比，配对学生t检验的统计学显著性结果。“肽OVA/PAG”是指纯化的卵清蛋白和保护性抗原A的混合物。“exsY K/O，cotE K/O”是指来源于exsYKO和cotE KO突变体的外孢壁片段的混合物，其未经BclA-FL-OVAL或BclA-FL-PAG构建体转化。表示来源于未转化突变体的外孢壁片段的结果代表总抗体。
表15：在注射外孢壁片段后14天斑马鱼对共递送的两种抗原的免疫反应，由肾脏免疫细胞的产生和特异性反应评估
实施例12：使用来源于鱼类病原体的抗原蛋白质将外孢壁片段用于接种鱼类。
在蜡状芽孢杆菌家族成员突变体中含有全长BclA和抗原蛋白的融合蛋白的表达允许收集游离的外孢壁。鱼类病原体的蛋白质可用作开发鱼类疫苗的抗原。下表16描述了编码融合蛋白的构建体，所述融合蛋白包含与来自鱼类病原体的各种抗原蛋白连接的BclA。将这些构建体中的每一种克隆到具有上述实施例9和10中所述突变之一的蜡状芽孢杆菌家族成员中，其允许收集外孢壁片段(苏云金芽孢杆菌BT013A的exsY和CotE敲除和CotO显性负性突变株)。如上文实施例9中所述从这些菌株中纯化出孢子片段，并如上所述进行鱼免疫。
针对两种已知的感染性微生物(柱状黄杆菌和鮰爱德华菌)的疫苗接种将用作实例。使用的抗原总结在表16中。编码脂多糖(LPS)(革兰氏阴性细菌的必需组分)的遗传序列将克隆到pBC-BclA-FL载体中(使用上文实施例8中描述的方法)。编码DNAk的核苷酸序列将被克隆到同一载体中，所述DNAk是用于感染性黄杆菌的蛋白质折叠的细胞伴侣系统中的蛋白质。FlgD是迟钝爱德华菌的可溶性支架鞭毛基底体棒修饰蛋白，是鞭毛钩组装所必需的。EseD是鮰爱德华菌的III型分泌系统(T3SS)中的重要基因，它是导致鱼类发病的关键毒力因子，也将被克隆到同一表达载体中。EseD蛋白是几种可能的易位蛋白之一，其在宿主膜中形成孔，其可以表达为来自疫苗的抗原。
表16：用于保护免于特定病原体的抗原蛋白
| 质粒 | 外孢壁蛋白 | 抗原 | 病原体 |
| pBC | 全长BclA | O-PS(LPS O-多糖) | 柱状黄杆菌 |
| pBC | 全长BclA | DNAk(伴侣) | 柱状黄杆菌 |
| pBC | 全长BclA | FlgD | 鮰爱德华菌 |
| pBC | 全长BclA | EseD | 鮰爱德华菌 |
在用含有BclA-抗原融合蛋白的外孢壁片段注射、喂养或沐浴的鱼中通过斑点印迹分析检测抗体。如上文实施例8中所述，pSUPER-BclA-OVAL质粒编码与BclA序列融合的卵清蛋白。pSUPER-BclA-O-PS，pSUPER-BclA-DNAk，pSUPER-BclA-LPS/FlgD和pSUPER-BclA-EseD质粒分别编码融合到BclA序列的LPS O-多糖，DNAk，LPS/FlgD和EseD抗原。来源于表达BclA-O-PS，BclA-DNAk，BclA-LPS/FlgD或BclA-EseD融合蛋白的苏云金芽孢杆菌BT013AexsY敲除、CotE敲除或CotO显性负性突变体菌株的纯化的外孢壁片段将溶解于不含氯化钙或氯化镁的无内毒素的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，或溶于含0.15M NaCl的去离子蒸馏水中，终浓度为0.001mg/ml至5mg/ml蛋白质。
将使用三种不同的免疫方法：肌内注射，饲料免疫和浸没免疫。对于通过肌内注射进行的免疫，首先将鱼用0.168mg/ml三卡因(3-氨基苯甲酸乙酯)在水中麻醉，或者在注射前将鱼放在冰上30-60秒。斑马鱼将用10μl的外孢壁片段溶液肌内注射到背鳍和侧线之间。
还将进行饲料免疫。将给斑马鱼提供免疫食物混合物，其含有1：4比例的携带BclA-抗原融合蛋白的纯化的外孢壁片段：补充有氨苄青霉素的TetraMin鱼食物(终浓度40mg/g)。在第一次免疫后10天给予加强免疫。
为了通过浸泡免疫，将成年斑马鱼浸入含有外孢壁片段(500μg/mL)的罐中30分钟，然后返回到清水箱中。在第一次免疫后10天给予加强免疫。
在最终免疫后2.5天，将在抗血清、肌肉和鳃中测量针对鱼病原体抗原的抗体的产生。斑马鱼将被浸入冰中杀死。首先收集血清，然后在冰上除去鱼的肌肉和鳃，均质化，并离心以沉淀细胞碎片。测定含有可溶性蛋白质的上清液的活性。
通过斑点印迹分析筛选多克隆抗体。简而言之，在免疫后从斑马鱼中收集样品以使用斑点印迹检测斑马鱼IgM(zIgM)免疫交叉是否与鱼病原体抗原交叉反应。首先，将重组蛋白(例如重组EseD)(50至500ng)在PVDF膜上固相化并干燥过夜。将膜用PBST(含有TWEEN洗涤剂的磷酸盐缓冲盐水)洗涤三次，然后用PBST中的5％(w/v)脱脂乳封闭2小时。用PBST洗涤后，将10-μl斑马鱼抗血清以1：100的稀释度与膜一起温育2小时。未免疫的斑马鱼血清将作为阴性对照。在进一步洗涤步骤后，将膜与抗斑马鱼IgM HRP连接的抗体以1：3000的稀释度作为第二抗体温育1小时。最后，通过用Pierce Fast Western Blot Kit ECLSubstrate显影来观察膜。
预期通过肌内注射，进食或浸泡用外孢壁片段免疫后将产生针对鱼病原体抗原的抗体。
用外孢壁片段免疫的鱼对感染病原体的免疫性。在整个研究中将使用细菌分离株柱状黄杆菌(ATCC 23463)和鮰爱德华菌(ATCC 33202)。所有分离物将从储存在-80℃的冷冻甘油储液中回收并划线到柱状黄杆菌生长培养基(FCGM)上；或含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂(ThermoFisher，Waltham，MA)上。在28℃生长48小时后，使用无菌环将分离物从琼脂上移出并接种到50mL FCGM或脑心浸液培养基(Becton Dickinson，Sparks，MD)中，并在28℃的肉汤中温育。24小时。在进行细菌攻击之前，将收获细菌细胞并计数。
细菌攻击：用4mg/L高锰酸钾预防治疗斑马鱼30分钟。在适应环境之后和细菌攻击之前，将随机选择两只斑马鱼并进行常规诊断程序。将从显微镜观察来自多个部位和鳃夹的外部皮肤刮屑以确定是否存在外部细菌或寄生虫。最后一次免疫后三天，将用细菌接种鱼。将斑马鱼组(每组20只)分别浸入浓度为2.4×104菌落形成单位(CFU)/mL，2.4×105CFU/mL和2.4×106CFU/mL的柱状黄杆菌或鮰爱德华菌，浓度为2.4×106CFU/mL的大肠杆菌或PBS，持续5小时。然后将这八组保存在五个独立的3-L水族箱中，观察21天。
相对存活率百分比实验：每天监测鱼类，并遵循国家道德委员会建议的人道终点标准。如果他们出现以下任何迹象，将用过量麻醉剂对鱼进行安乐死：游泳异常，喘气，可观察到的肿胀或消瘦，组织损伤或对触摸的反应不足。
感染鱼中的细菌计数：来自每组的斑马鱼将被采样回收在其死亡时的柱状黄杆菌或鮰爱德华菌。将吸出腹水并将伤口、肝脏和胰腺分别在10mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中匀浆。将腹水和均质组织涂布在头孢哌酮MacConkey琼脂上，并在37℃下温育24小时。通过标准常规生化方法表型鉴定疑似细菌分离物。怀疑是柱状黄杆菌或鮰爱德华菌的分离物将进行部分16S rRNA鉴定。
实施例13：使用外孢壁片段接种小鼠以同时产生对两种抗原的保护。
施用含有全长BclA和抗原蛋白的融合蛋白的外孢壁片段以产生免疫应答。在有和没有佐剂(FCA)下，将如上文实施例9中所述的与exsY KO突变体中表达的卵清蛋白(pBC-BclA-FL-OVAL)连接的BclA和在cotE KO突变体中表达的保护性抗原(pBC-BclA-FL-PAG)皮下共同注射或鼻内共同施用于成年小鼠。对于通过皮下注射免疫，将六只BALB/c小鼠组以两周的间隔免疫两次。每剂抗原溶液是25μl两种类型的抗原外孢壁片段的混合物(12.5μl每种类型的外孢壁片段，如上文实施例9中所述制备；相当于108CFU/ml全细胞肉汤)，有或没有佐剂。对于鼻内免疫，将六只BALB/c小鼠组以两周的间隔免疫两次。每剂抗原溶液是25μl两种抗原外孢壁片段的混合物(12.5μl每种类型的外孢壁片段，如上文实施例9中所述制备；相当于108CFU/ml全细胞肉汤)。鼻小体保持仰卧位，头部朝下进行鼻内免疫，同时用微量吸管将抗原溶液缓慢地递送到鼻孔上，以便小鼠可以嗅探它。
收集血清并检查长期免疫的检测，如第一次注射后4周(加强注射后2周)通过特异性抗体(ELISA)评估的。在肝素化毛细管中从股外侧静脉获得血液，分离并储存在-20℃直至分析。
通过ELISA从注射含有BclA-抗原融合蛋白的外孢壁片段的小鼠中检测抗体。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)用COSTAR高结合测定板(用于ELISA测定的96孔板)测量针对OVAL和PAG的免疫球蛋白IgG和IgA抗体。简而言之，通过与OVAL或PAG蛋白一起温育，用100nM蛋白质包被平板。将血浆样品中和并稀释至50mg/mL，通过二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定法测定。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗小鼠IgG(γ链特异性)用作缀合物。结果显示在下表17中。“肽OVAL/PAG”是指如上所述注射的纯化卵清蛋白和保护性抗原A的混合物(0.05μg)。“exsY K/O，cotE K/O”是指来源于未用BclA-FL-OVAL或BclA-FL-PAG构建体转化的exsY KO和cotE KO突变体的外孢壁片段的混合物。从已知的纯化抗体产生每种蛋白质的标准曲线，并用于定量每只动物中产生的特异性抗体的ng/mL。表17中的值代表七只个体小鼠的平均值，包括标准偏差。从表17中可以看出，响应于皮下注射和鼻内施用，同时产生针对PAG和OVA的抗体。携带外孢壁的蛋白质的表现与单独的蛋白质相同或更好。使用佐剂(FCA)没有显著增加在外孢壁上表达的保护性抗体的产生，表明不必添加佐剂以达到与蛋白质类似的特异性抗体保护水平。
表17：产生鼻内或皮下施用于成年小鼠的外孢壁片段的多种抗体。
实施例14：使用展示蛋白酶或内酯酶的外孢壁片段保护动物免于病原体。
可以使用上文实施例8和9中描述的方法产生含有包含靶向序列或外孢壁蛋白(例如BclA)的融合蛋白和保护动物免于病原体的蛋白质或肽的外孢壁片段。例如，这些外孢壁片段可用于展示保护动物免于一种或多种病原体的蛋白酶或内酯酶。某些细菌病原体可通过细菌内酯高丝氨酸或相关信号分子的分泌在各个成员之间进行通信。细菌之间的这种信号传导导致细菌分泌毒素和毒力因子的上调。因此，对细菌内酯高丝氨酸信号分子特异的蛋白酶或内酯酶可通过破坏细菌之间的通讯来保护动物免于这些细菌病原体。对细菌内酯高丝氨酸信号分子特异的合适的蛋白酶包括内肽酶和外肽酶。含有对细菌内酯高丝氨酸信号分子特异的蛋白酶的融合蛋白可以在上述苏云金芽孢杆菌BT013A的exsY和CotE敲除和CotO显性负性突变株中表达。然后可以如上所述制备含有融合蛋白的外孢壁片段。
实施例15：使用含有内酯酶或蛋白酶融合蛋白的外孢壁片段来预防细菌生长和破坏生物膜形成。
N-酰化高丝氨酸内酯(AHL)内酯酶能够降解参与细菌群体感应的信号分子。因此，内酯酶可用于控制细菌感染。所有细菌细胞的正常生长和功能都需要精确调节蛋白质水平；蛋白质合成和降解速率的平衡保持了这一点。添加外部蛋白酶会破坏这种平衡。枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶对生物膜和细菌生长特别有效，因为它们能够在对细菌细胞外环境变化的适应性反应中影响蛋白质组。
将负责芽孢杆菌属(AiiA)中的AHL内酯酶活性或蛋白酶活性的基因克隆到pBC质粒中以产生编码融合蛋白的质粒，所述融合蛋白含有与靶向序列或外孢壁蛋白连接的AiiA或蛋白酶(氨基酸20-25的BclA或全长BclA)。然后使用上文实施例9中描述的方法在苏云金芽孢杆菌BT013A的exsY敲除菌株中表达融合蛋白。如实施例9中所述纯化外孢壁片段。在该实施例中描述的实验中使用的融合蛋白总结于下表18中。
表18：含有乳糖酶或蛋白酶的融合蛋白
确认群体猝灭活性。使用生物测定板进行AHL灭活测定。简而言之，将N-己酰基-L-高丝氨酸内酯(C6-HSL)的等分试样在37℃下与0、40或80μL全细胞肉汤或从表达融合蛋白的exsY KO突变体纯化的外孢壁片段一起温育2小时，所述融合蛋白包含内酯酶(苏云金芽孢杆菌B184AiiA)。将反应混合物接种到接种有生物报道分子紫色色杆菌CV026的LB琼脂上，并在30℃温育过夜。通过紫色色杆菌CV026响应C6-HSL产生的紫色色素的损失来评估混合物中C6-HSL的消失。结果总结于下表19中。*表示与对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。
报告菌株产生的紫色色素总面积的减少表明内酯被全细胞肉汤和表达内酯酶基因的纯化的外孢壁片段降解。重要的是，外孢壁片段在降解内酯方面比全细胞肉汤更有效。
表19：显示乳酸酶的外孢壁片段的内酯降解综述。
预防细菌生长。将紫色色杆菌，鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌的细菌培养物培养24小时至O.D.600为2.0。将这些培养物以1μL接种到500μL LB培养基中的平板测定中，使其在平板中生长4小时，然后加入外孢壁片段。然后加入展示蛋白酶或内酯酶(16％v/v)的外孢壁片段，然后将培养物在30℃下不振荡培养另外4小时。然后将XTT盐溶液加入每个孔中。细菌脱氢酶对XTT盐的切割是活性细胞的指示，并且在30℃温育3小时后测量490nm处的吸光度。结果显示在下表20中。
生物膜的预防和分散。将紫色色杆菌，鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌的细菌培养物培养24小时至O.D.600为2.0。将这些培养物以1μL接种到500μL LB培养基中的平板测定中，使其在平板中生长8小时，然后加入外孢壁片段。然后加入展示蛋白酶或内酯酶(16％v/v)的外孢壁片段，然后将培养物在30℃下不振荡培养另外8小时。
另外，评估鲍氏不动杆菌菌株破碎形成生物膜的能力。除了在接种后24小时加入外孢壁片段外，以与上述用于测定生物膜形成的预防相同的方式进行测定。温育期后，倒出细菌培养物，用XTT盐溶液染色孔。细菌脱氢酶对XTT盐的切割是活性细胞的读数，并且在30℃温育3小时后测量490nm处的吸光度。结果显示在下表20中。*表示与对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。
表20.在细菌物种上展示内酯酶或枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶(16％v/v)的外孢壁片段活性的概述。
实施例16：在养鱼场中使用含有内酯酶或蛋白酶融合蛋白的外孢壁片段以预防细菌感染。
预期通过补充鱼饲料或通过浸泡施用而口服施用含有上述实施例15中所述的AiiA或蛋白酶融合物的外孢壁片段将显著减弱斑马鱼中的嗜水气单胞菌感染。
将野生型斑马鱼(4月龄，平均体重～200mg，平均长度～2.5cm)随机分成试验组和对照组，并喂食在一定范围内补充有外孢壁片段的饮食，每克饲料加入(2-2×10-3U)并浸入含嗜水气单胞菌NJ-1的水中。可选地，将鱼浸入含有较低浓度的外孢壁片段的浴中，并置于含嗜水气单胞菌NJ-1的水中。将在每天记录25天实验期间的死亡率。每天将去除死鱼并检查细菌污染。还将每天检查含有嗜水气单胞菌NJ-1的水的细菌污染。为了测试细菌污染，将鱼体用75％乙醇灭菌，并在无菌条件下用注射器提取体液并划线到氨苄青霉素血琼脂平板上。将水样直接划线到同一板上。
实施例17：使用含有抗微生物肽融合蛋白的外孢壁片段来预防细菌生长和破坏生物膜形成。
构建含有抗微生物肽的融合蛋白和产生外孢壁片段。合成基因，其在BclA启动子(SEQ ID NO：149)的控制下编码两种抗微生物肽，与BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)连接的LfcinB(来源于牛乳铁蛋白，SEQ ID NO：212)和LysM(来源于鸡溶菌酶，SEQ ID NO：213)。将这些基因克隆到pBC质粒中以产生构建体pBC-BclA 20-35-LfcinB和pBC-BclA 20-35-LysM。这些构建体总结于下表21中。然后将构建体导入苏云金芽孢杆菌BT013A的exsY敲除突变体中，并使用上文实施例9中所述的方法制备外孢壁片段。
表21：含有LfcinB或LysM的抗菌融合蛋白
| 抗菌肽 | 靶向序列 |
| 牛乳铁蛋白酶(LfcinB)(SEQ ID NO:212) | BclA的氨基酸20–35(SEQ ID NO:1的氨基酸20–35) |
| 鸡溶菌酶(LysM)(SEQ ID NO:213) | BclA的氨基酸20–35(SEQ ID NO:1的氨基酸20–35) |
含有LysM或LfcinB融合蛋白的外孢壁片段的抗微生物和抗生物膜活性。使用上文实施例15中描述的方法，测定多种微生物的携带LysM或LfcinB的外孢壁片段防止细菌生长或生物膜形成的能力。结果显示在下表22中。*表示与对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。数据来自两个独立的实验。
表22.在细菌物种上展示LysM或LfcinB抗微生物肽(16％v/v)的活性外孢壁片段的概述。
实施例18：使用含有LfcinB或LysM融合蛋白的外孢壁片段来处理瘤胃臃肿。
预期含有上文实施例17中所述的含有LysM或LfcinB肽的融合蛋白的外孢壁片段将杀死大量的链球菌属细胞。预期这将直接转化为杀死瘤胃臃肿的反刍动物(例如奶牛，绵羊或马)的消化道中的细菌。当向饮食中添加大量淀粉时，会发生瘤胃臃肿(瘤胃酸中毒)。在这些条件下，牛链球菌的生长不再受到缺乏这种能源的限制，并且牛分枝杆菌的细菌种群比其它种类的瘤胃细菌生长得更快。牛链球菌产生乳酸，一种比乙酸、丙酸或丁酸强十倍的酸，其积累最终超过导致疾病的瘤胃液的缓冲能力。
实施例19：使用含有LfcinB或LysM融合蛋白的外孢壁片段来治疗牛的脚腐病。
绵羊和牛易于发生细菌蹄感染，这可能使人非常虚弱。趾间蜂窝织炎是脚爪之间软组织的感染，由两种厌氧菌，即坏死梭杆菌和黑色素原菌引起。使用上文实施例17中描述的外孢壁片段，使用源自苏云金芽孢杆菌BT013A突变体的LfcinB或LysM外孢壁片段抑制坏死梭杆菌和黑色素原菌培养物的生长。使用这些经过验证的外孢壁片段，具有急性趾间蜂窝织炎的临床症状(带有叉指间肿胀，趾间病变或两者的跛足)的一岁阉牛将被随机分配到治疗组：在有和没有防腐剂和收敛剂溶液(例如铜或硫酸锌[7％-10％在水中])下使用不同浓度的LfcinB或LysM外孢壁片段。这些组将通过足浴方法进行治疗。所有动物将治疗3天。如果动物在第4天不再跛足，则认为治疗是成功的。在每组治疗前收集活检标本并进行细菌培养和组织学检查。
实施例20：使用含有腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段抑制或阻止生物膜形成或促进水产养殖系统中表面的生物膜溶解。
生物膜可以在水产养殖系统内的表面上形成，例如管道，泵，过滤器和收集罐，或甚至在水产养殖系统中培养的鱼鳃。腺苷三磷酸双磷酸酶将ATP水解为AMP和无机磷酸盐，并已显示出降低生物膜生物量。使用实施例8和9中描述的方法产生含有腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白(含有由马铃薯的Rrop1基因或枯草芽孢杆菌的ytkD基因编码的腺苷三磷酸双磷酸酶)的外孢壁片段。这些构建体总结于下表23中。培养细菌菌株，然后在含有分离的含有BclA-腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段的新培养基中传代。然后测量腺苷三磷酸双磷酸酶外孢壁片段抑制生物膜形成或促进其溶解的能力。使用上文实施例15中描述的方法，测定多种微生物的外孢壁片段影响生物膜或微生物生长的能力。结果显示在下表24中。*表示与阴性对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO或cotE KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。
表23：含有腺苷三磷酸双磷酸酶的抗生物膜融合蛋白
表24：在细菌物种上展示腺苷三磷酸双磷酸酶(16％v/v)的外孢壁片段活性的概述。
实施例21：含有腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段对牛上皮细胞体外细胞培养模型中鲍曼不动杆菌初始生物膜粘附的影响。
生物膜也可在伤口内形成。为了显示含有腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段可以用于预防或抑制这种生物膜的形成，将进行几个实验。首先，对用或不用含有BclA-腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段(如实施例8和9中所述制备)处理的牛成纤维细胞进行体外细菌粘附测定。将牛上皮细胞系NBL-4(ATCC CCL-44；American TissueCulture Collection，Rockville，MD，USA)在培养皿中于37℃在DMEM培养基(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)中培养。在含有5％(v/v)CO2的潮湿气氛中补充青霉素G 100000U/L，链霉素50mg/L和5％(v/v)胎牛血清(Gibco BRL)。当成纤维细胞在培养皿底部达到约80％汇合时，将用0.25％胰蛋白酶-EDTA(1689649，MP Biomedicals，Solon Ohio)替换培养基，并将培养皿在37℃温育10分钟。使用细胞刮刀收集细胞，并通过以300×g离心3分钟用新鲜培养基洗涤三次。将洗过的细胞用新鲜培养基调节至1×105个细胞/mL的浓度，并将2mL细胞溶液转移到含有13mm直径塑料盖玻片的12孔板的每个孔中(Thermanox，Nunc，Rochester，纽约，美国)。将细胞在37℃温育约3天，直至细胞覆盖每个盖玻片的约90％，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。将在Luria Bertani(LB)培养基中生长过夜的鲍氏不动杆菌ATCC 17978收集并用新鲜培养基洗涤三次，通过以6000rpm离心3分钟。将细菌细胞调节至1×108CFU/mL的浓度，并与含有BclA-腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段混合。每个细胞单层将用1mL细菌悬浮液感染，并在37℃，5％(v/v)CO2气氛中温育60分钟。对于受损的细胞测定，在进行感染之前，使用刀尖会破坏塑料盖玻片中心区域中的成纤维细胞。用鲍曼不动杆菌感染后，用PBS缓冲液洗涤塑料盖玻片三次以除去非粘附细菌，然后在100％甲醇中固定20分钟，然后在Giemsa染色溶液中在室温下染色30分钟。将盖玻片风干，安装并在具有60X物镜的光学显微镜下观察。将确定粘附到100个细胞的细菌数量。每种处理将进行三次独立实验。
实施例22：在体内小鼠伤口感染模型中含有BclA-腺苷三磷酸双磷酸酶融合蛋白的外孢壁片段对鲍曼不动杆菌初始生物膜粘附的影响。
在所有实验中将使用12周龄，体重约20-23克的无雌性病原体的C57BL/6小鼠(Harlan，Indianapolis，Ind.)。将动物保持12小时光照周期，并在整个研究过程中随意提供啮齿动物饲料(LabDiet 5001，PMI Int'l，Richmond，Ind.)和饮水。将腹膜内施用(50mg/kg IP)戊巴比妥(Nembutal，Ovation Pharmaceuticals，Inc.，Deerfield，IL，由Hospira，Lake Forest，IL制造)用于麻醉。在研究期间，所有小鼠将被单独饲养并且将每天两次皮下(SQ)接受0.1mg/kg丁丙诺啡(Buprenex；Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.，Richmond，VA)用于烧伤后疼痛控制。使用35W型号5-55E电动剪毛器(Oyster-Golden A-S，头部编号80，刀片尺寸40)夹住腰骶部和背部区域上的皮肤。将脱毛膏(乳液)涂抹约1.5分钟，然后用湿纸巾擦拭。将皮肤在温水中漂洗，然后吸干。第一次丁丙诺啡剂量(67μl/20g，83μl/25g小鼠或0.1μg/g)将在上背部皮肤下施用SQ。
为了产生烧伤，将麻醉的小鼠置于绝缘定制的模具中，该模具仅暴露腰骶部和背部区域，其约为总体部区域的30％。通过将皮肤暴露于60℃水中18秒来实现部分厚度烧伤。
收获过夜生长的鲍曼不动杆菌培养物并用0.9％盐水洗涤三次。用0.9％盐水将最终细胞浓度调节至1×106CFU/ml并用于接种。将对照(仅细菌)或处理(具有BclA-腺苷三磷酸双磷酸酶外孢壁片段的细菌)应用于每次烧伤。TEGADERM伤口敷料将用MASTISOL液体粘合胶涂在烧伤上，注意不要在伤口上涂上MASTISOL。
在组织收获的时间点(24和48小时)，给予小鼠戊巴比妥(150mg/kg)的致死IP注射，并收集皮肤样品用于细菌计数和用于载玻片/染色。用手术刀和剪刀将皮肤取出。将一小块皮肤置于5mL PBS缓冲液中并均化1分钟。将混合物连续稀释10倍，将50μl各稀释液置于LB琼脂平板上进行细菌计数。
实施例23：使用含有抗真菌酶融合蛋白的外孢壁片段来防止真菌生长。
使用上文实施例9中描述的方法制备含有抗真菌酶的融合蛋白。这些构建体总结于下表25中。构建体在BclA启动子(SEQ ID NO：149)的控制下含有全长BclA或BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)。将这些构建体引入苏云金芽孢杆菌BT013A的ExsY和CotE敲除突变体中。根据上文实施例9中描述的方法制备外孢壁片段。
使用透明96孔平底聚苯乙烯组织培养板(BD-Falcon，USA)进行杀真菌测定。来自黑曲霉、烟曲霉和产黄青霉的真菌孢子在含有氯霉素和金霉素(PDCC)倾斜的马铃薯葡萄糖琼脂上生长，并使其在30℃下形成孢子。通过在PBS中涡旋，从斜面收集孢子。通过血细胞计数器计数悬浮的孢子并稀释至106CFU/mL。然后将悬浮的孢子在96孔板中的营养肉汤中连续稀释，加入不同浓度的含有融合蛋白的外孢壁片段，并将板在30℃温育以抑制真菌孢子生长。通过向板的每个孔中加入XTT 3小时来定量真菌生长，并如上文实施例15中所述在A490nm处读数。结果显示在下表26中。*表示与阴性对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO或cotE KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。
表25：含有抗真菌酶的融合蛋白
表26：外孢壁片段对真菌生长的影响
ND＝未测定
实施例24：使用展示抗真菌酶融合蛋白的外孢壁片段来保护水产养殖中的病原体。
世界虾类水产养殖现在产生超过400万公吨的虾。这反映了东南亚白腿虾养殖的急剧增加。许多地区的虾产量受到各种各样疾病的影响。虾中的真菌感染是虾幼虫中最常见的疾病感染之一，通常发生在旱季。一些真菌攻击幼虫，而另一些则攻击生长的虾。
在虾的不同种类的真菌病原体中，最危险的是链壶菌属和离壶菌属。当游动孢子沉积在虾幼体上时，感染开始。然后孢子长成菌丝。菌丝穿透幼虫的体内并发育成菌丝体并开始以组织为食。菌丝体发育并最终侵入虾幼体的整个体内。
将如上文实施例23中所述的含有抗真菌融合蛋白的外孢壁片段在含有链壶菌的PBS中在37℃下振荡温育1小时。将肌链壶菌(ATCC 200325)培养物在By+肉汤中于37℃培养过夜。用于培养海洋微生物的典型培养基基于海水(例如，790By+培养基[酵母提取物1.0g，蛋白胨1.0g，D+葡萄糖5.0g，海水1L])。
然后将过夜培养物沉淀，在PBS中洗涤，并重悬于PBS中。将含有融合蛋白的外孢壁片段在含有链壶菌的PBS中在37℃下振荡温育1小时。链壶菌的对照样品将不进行处理(没有外孢壁片段)。温育3小时后，制备链壶菌的稀释平板并在37℃下温育过夜。链壶菌培养物将在第二天计数，并且杀死的百分比被量化。这可以转化为浸渍处理受感染的虾或处理整个虾池的真菌的方法。
实施例25：使用含有抗真菌酶融合蛋白的外孢壁片段来预防酵母生长。
乳制品动物的乳房炎是乳房的炎症反应。乳腺感染是乳制品行业中最常见和最昂贵的疾病。新型隐球菌和白色念珠菌是导致山羊乳腺炎的最常见的酵母种类，并且真菌性乳腺炎而不是细菌的趋势一直在增加。目前，当诊断出乳腺炎时，立即采取的行动是通过抗生素治疗。然而，如果生物体实际上是真菌，抗生素治疗是难治的。
如实施例23中所述制备的抗真菌外孢壁片段用于抑制酿酒酵母的生长，作为酵母的模型。结果显示在下表27中。*表示与阴性对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。这些数据表明，从外孢壁突变体制备的多种融合蛋白具有很强的抑制酵母生长的能力。
表27：外孢壁片段对酿酒酵母生长的影响
实施例26：使用含有抗真菌酶融合蛋白的外孢壁片段用于治疗奶牛动物的乳腺炎。
在实验开始之前，在彻底清洁的前提下将2-4岁的哺乳母山羊在观察下保持观察两周并且将被判定为健康的。选择用于该研究的所有动物将没有亚临床乳腺炎，并且不会从接种前的乳样品中分离出细菌或真菌。将使用从天然乳腺炎病例中分离的白色念珠菌菌株，并将分离物在含有0.03％氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)上生长。在37℃温育5-6天后，收获生长物并将悬浮液匀浆化并准备接种每只山羊的一半乳房。
用如上文实施例23中所述的含有抗真菌酶的外孢壁片段处理感染的乳房将进行3天。如上文实施例9中所述制备外孢壁片段。
将尝试从乳和乳房损伤中重新分离真菌。将分离物在沙氏右旋糖琼脂(SDA)斜面上于37℃培养2-7天。使用Grocott's methanamine silver(GMS)，Periodic acid schiff(PAS)和组合的GMS-H&E进行乳的印模涂片以及乳房组织和石蜡组织切片中真菌的检测。
实施例27：使用含有融合蛋白的外孢壁片段来保护动物免于昆虫或蠕虫病原体。
通过摄入将含有融合蛋白的外孢壁片段递送至蚊子幼虫。蚊子幼虫[2-4mm大小范围]购自Sachs Systems Aquaculture并在相对湿度为80％的房间中保持在27℃并喂食浮游生物。为了证明外孢壁片段可用于向蚊子幼虫递送蛋白质或肽，在BclA启动子(SEQ IDNO：149)的控制下构建融合蛋白，其含有与BclA的氨基酸20-35连接的具有杀虫和抗蠕虫特性的蛋白质(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)。这些构建体总结于下表28中。将构建体引入苏云金芽孢杆菌BT013A的ExsY和CotE敲除菌株中，并根据上文实施例9中所述的方法制备外孢壁片段。将10只蚊子幼虫的组转移至水中的15mL Falcon管并用浮游生物和含有融合蛋白的外孢壁片段的水悬浮液混合物处理。24小时后记录活幼虫。结果显示在下表29中。*表示与阴性对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。
表28：含有抗蠕虫和杀虫肽或蛋白质的融合蛋白
表29：蚊子幼虫在暴露于外孢壁片段后24和48小时的存活
N.D.＝未测定
实施例28：通过局部施用将含有杀虫性Mtx样毒素融合蛋白的外孢壁片段递送至马科动物以防止飞虫侵染。
通过局部施用将含有杀虫性Mtx样毒素融合蛋白的外孢壁片段递送至马科动物以防止飞虫侵染。在该研究中将使用五匹马，每组一匹马。对照组未经治疗。用含有上述实施例27中所述的BclA20-35-Mtx1融合蛋白的外孢壁片段的水悬浮液处理四组。外胚层片段在使用前将在水中稀释，并作为喷雾施用于每只马。通过将每个稀释的喷雾喷洒在背部和身体的每一侧(桶)从肩部到臀部，用加压喷雾装置处理每匹马。
在施加的喷雾干燥后，将6个未饲养稳定苍蝇的培养皿(每侧3个)和6个家蝇的培养皿笼(每侧3个)，每个包含10个成年苍蝇，每个培养皿将被放置在将绑在动物周围的筛选腰带下。培养皿的底部将具有网状物，其允许稳定苍蝇探测并获得血粉，并且家蝇通过他们的嘴部探测，两者都暴露于处理过的毛发和皮肤。培养皿中的苍蝇将暴露于每匹马的经处理表面20分钟，之后将板取出并送到实验室以评估暴露后4、8和24小时的杀死百分比。培养皿将在处理后立即定位在每个经处理的马上并且在处理后第1、3、5、7和14天再次暴露于其中以评估残留活性。
实施例29：通过摄入外孢壁片段将抗蠕虫肽递送至秀丽隐杆线虫。
野生型秀丽隐杆线虫购自Carolina Biological(北卡罗莱纳州)并在23℃下保持在线虫生长培养基(NGM)-Lite琼脂平板上，所述琼脂平板用OP50大肠杆菌包被食物。将上表28中描述的构建体转化到苏云金芽孢杆菌BT013A的ExsY和CotE敲除菌株中。
为了制备用于喂食线虫的浓缩孢子，通过高速离心浓缩1mL含有转化的ExsY KO和CotE KO菌株的无蛋白质培养基，并除去900μL培养基。为了将孢子喂给蠕虫，将10μL浓缩悬浮液加入到具有10μL PBS(磷酸盐缓冲盐水)的60mm NGM-lite琼脂平板中以帮助扩散。没有提供其它食物来源。在一个实验中，将20只不同年龄的野生型线虫立即转移到平板上。监测平板随时间的存活率并计算存活百分比。通过在显微镜下监测并记录线虫的死亡率来确定存活率。用针刺戳时没有移动的线虫在24小时被认为死亡。可生存性数据总结在下表30中(第3栏)。
在第二个实验中，将来自含有约300个蠕虫的野生型平板的琼脂塞置于处理过的平板中心。通过在转移后72小时计数距离板中心一定距离的一个视野中的活蠕虫数量来评估从转移插塞迁移的线虫数量。这些数据总结在下表30中(第4栏)。*表示与阴性对照(来自不表达融合蛋白的exsY KO或cotE KO孢子的外孢壁片段)相比，通过学生配对T检验测量的统计学显著降低。当携带Cry21a蛋白时，ExsY和CotE的外孢壁突变体等同地杀死线虫。
表30：外孢壁片段对秀丽隐杆线虫的驱虫活性
可以使用含有抗蠕虫几丁质酶融合蛋白的外孢壁片段来治疗扁平蠕虫(例如吸虫(吸虫类)和绦虫(绦虫类)以及圆虫(线虫类)的肠动物感染。感染牲畜和伴侣动物的寄生虫是重要的动物福利问题，给食物生产带来了重大的经济负担。
鉴于以上所述，可以看出，实现了本发明的几个目的并获得了其它有利的结果。
由于可以在不脱离本发明的范围的情况下对上述方法进行各种改变，所以包含在以上描述中并且在附图中示出的所有内容应当被解释为说明性的而不是限制性的。
实施方式
为了进一步说明，下文阐述了本公开的另外的非限制性实施方式。
实施方式1是融合蛋白，其包含：
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和
至少一种目标蛋白质或肽，目标蛋白质或肽包括抗体，抗体片段，组蛋白，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽，腺苷三磷酸双磷酸酶，藻酸盐裂解酶，分散素B，DNA酶，内切壳多糖酶，外切壳多糖酶，蛋白酶K，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，a Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白，Cyt1Aa蛋白，AiiA，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶或其任何组合
实施方式2是实施方式1的融合蛋白，其中DNA酶包含DNA酶I，其中内切壳多糖酶包含几丁质酶C，或其中外切壳多糖酶包含几丁质酶D.
实施方式3是实施方式1的融合蛋白，其中目的蛋白质或肽包含抗体，抗体片段，组蛋白，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽，腺苷三磷酸双磷酸酶，藻酸盐裂解酶，分散素B，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素或其任何组合。
实施方式4是实施方式1或3的融合蛋白，其中目标蛋白质或肽包含腺苷三磷酸双磷酸酶。
实施方式5是实施方式4的融合蛋白，其中腺苷三磷酸双磷酸酶包含与SEQ ID NO：204或205具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式6是实施方式5的融合蛋白，其中腺苷三磷酸双磷酸酶包含与SEQ ID NO：205具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式7是实施方式1的融合蛋白，其中目标蛋白质或肽包含分散素B。
实施方式8是实施方式1的融合蛋白，其中目标蛋白质或肽包含内切壳多糖酶，外切壳多糖酶或其组合。
实施方式9是实施方式8的融合蛋白，其中目标蛋白质或肽包含内切壳多糖酶，内切壳多糖酶包含与SEQ ID NO：206具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式10是实施方式1的融合蛋白，其中目标蛋白质或肽包含AiiA内酯酶。
实施方式11是实施方式10的融合蛋白，其中AiiA内酯酶包含与SEQ ID NO：207或208具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式12是实施方式1的融合蛋白，其中目标蛋白质或肽包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
实施方式13是实施方式12的融合蛋白，其中枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO：209具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式14是实施方式12的融合蛋白，其中枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO：210具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式15是融合蛋白，其包含：
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和
LfcinB，其中LfcinB包含与SEQ ID NO：212具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式16是融合蛋白，其包含：
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和
LysM，其中LysM包含与SEQ ID NO：213具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式17是融合蛋白，其包含：
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和
β-1,3-葡聚糖酶，其中β-1,3-葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：214或216具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式18是融合蛋白，其包含：
靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和
Cry21A，其中Cry21A包含与SEQ ID NO：215具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式19是重组蜡状芽孢杆菌家族成员，其表达实施方式1-18中任一个的融合蛋白。
实施方式20是来源于实施方式19的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段。
实施方式21是包含实施方式19的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子或实施方式20的外孢壁片段和载体的组合物。
实施方式22是实施方式21的组合物，其中组合物是药物组合物，并且载体包含药学上可接受的载体。
实施方式23是实施方式21的组合物，其中组合物是杀虫或杀螨组合物。
实施方式24是实施方式21或23的组合物，其中目标蛋白质或肽包含分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素，内切壳多糖酶，外切壳多糖酶，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白，Cyt1Aa蛋白或其任何组合。
实施方式25是实施方式1或3的融合蛋白，实施方式19的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，实施方式20的外孢壁片段或实施方式21的组合物，其中目标蛋白质或肽包含杀蚊毒素。
实施方式26是实施方式25的融合蛋白、重组蜡状芽孢杆菌家族成员、外孢壁片段或组合物，其中杀蚊毒素包含Mtx样杀蚊毒素或Bin样杀蚊毒素。
实施方式27是实施方式26的融合蛋白、重组蜡状芽孢杆菌家族成员、外孢壁片段或组合物，其中Mtx样杀蚊毒素包含Mtx1。
实施方式28是实施方式27的融合蛋白、重组蜡状芽孢杆菌家族成员、外孢壁片段或组合物，其中Mtx1包含与SEQ ID NO：211具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式29是实施方式21的组合物，其中组合物是杀蠕虫或杀线虫组合物。
实施方式30是实施方式29的组合物，其中目标蛋白质或肽包含几丁质酶C，几丁质酶D或其组合。
实施方式31是包含药学上可接受的载体和外孢壁片段的药物组合物，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式32是实施方式22或31的药物组合物，其中组合物适用于局部，口服，静脉内，动脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，胸膜内，鼻内，皮内，吸入，直肠，透皮，经上皮施用，通过将动物浸入药物组合物而施用于水生动物，或其任何组合。
实施方式33是实施方式32的药物组合物，其中组合物适于局部施用。
实施方式34是实施方式33的药物组合物，其中组合物是局部喷雾组合物的形式。
实施方式35是实施方式32的药物组合物，其中组合物适于口服施用。
实施方式36是实施方式35的药物组合物，其中将组合物配制成饲料添加剂。
实施方式37是疫苗组合物，其包含药学上可接受的载体和：
第一类外孢壁片段；
第二类外孢壁片段；
第二类外孢壁片段与第一类外孢壁片段不同；
其中第一和第二类外孢壁片段来源于包含突变或表达蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加，并且其中突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去；并且
其中第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段中的至少一个包含融合蛋白，融合蛋白包含抗原或免疫原，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式38是实施方式37的疫苗组合物，其中第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段均包含融合蛋白，融合蛋白包含抗原或免疫原，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式39是实施方式38的疫苗组合物，其中第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段包含彼此相同的融合蛋白。
实施方式40是实施方式38的疫苗组合物，其中第一类外孢壁片段和第二类外孢壁片段包含彼此不同的融合蛋白。
实施方式41是实施方式40的疫苗组合物，其中第一类外孢壁片段包含含有第一抗原或免疫原的融合蛋白，第二类外孢壁片段包含含有第二抗原或免疫原的融合蛋白，第一抗原或免疫原不同于第二抗原或免疫原。
实施方式42是实施方式40或41的疫苗组合物，其中第一类外孢壁片段包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，并且第二类外孢壁片段包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段不同于第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。
实施方式43是实施方式37-42中任一个的疫苗组合物，其中第一类外孢壁片段来源于蜡状芽孢杆菌家族中的第一种细菌的孢子，并且第二类外孢壁片段是来源于蜡状芽孢杆菌家族中第二种细菌的孢子，第二种细菌不同于第一种细菌。
实施方式44是实施方式43的疫苗组合物，其中第一种细菌包括苏云金芽孢杆菌，第二种细菌包括假蕈状芽孢杆菌。
实施方式46是实施方式37-44中任一个的疫苗组合物，其中：
第一类外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其包含第一突变，其中第一突变导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去；和
第二类外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其包含第二突变，其中第二突变导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去；
其中第一突变不同于第二突变。
实施方式46是实施方式45的疫苗组合物，其中第一突变和第二突变独立地选自：
(i)CotE基因的突变；
(ii)ExsY基因的突变；
(iii)CotY基因的突变；
(iv)ExsA基因的突变；和
(v)CotO基因的突变。
实施方式47是实施方式46的疫苗组合物，其中第一突变包括敲除CotE基因，第二突变包括敲除ExsY基因。
实施方式48是实施方式37-44中任一个的疫苗组合物，其中：
第一类外孢壁片段来源于表达第一蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族中第一蛋白质的表达相比，第一蛋白质的表达增加，并且其中第一蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去；和
第二类外孢壁片段来源于表达第二蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族中第二蛋白质的表达相比，第二蛋白质的表达增加，并且其中第二蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去；
其中第一蛋白质与第二蛋白质不同。
实施方式49是实施方式48的疫苗组合物，其中第一蛋白质和第二蛋白质独立地选自：
(i)ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签；
(ii)BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加；和
(iii)YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加。
实施方式50是实施方式37-44中任一个的疫苗组合物，其中：
第一类外孢壁片段来源于包含突变的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中突变导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去；和
第二类外孢壁片段来源于表达蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中的蛋白质表达相比，蛋白质的表达增加，并且其中蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去。
实施方式51是实施方式50的疫苗组合物，其中：
突变选自：
(i)CotE基因的突变；
(ii)ExsY基因的突变；
(iii)CotY基因的突变；
(iv)ExsA基因的突变；和
(v)CotO基因的突变；
并且其中蛋白质选自：
(i)ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签；
(ii)BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加；和
(iii)YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加。
实施方式52是疫苗组合物，其包含药学上可接受的载体和：
表达第一融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，第一融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使第一融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；和
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
实施方式53是疫苗组合物，其包含药学上可接受的载体和：
第一免疫原或抗原；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
实施方式54是实施方式52或53的疫苗组合物，其中外孢壁片段来源于包含突变或表达蛋白质的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加，并且其中突变或蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从孢子中除去。
实施方式55是实施方式52或54的疫苗组合物，其中外孢壁片段来源于表达第二融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，第二融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使第二融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式56是实施方式55的疫苗组合物，其中第一融合蛋白和第二蛋白彼此相同。
实施方式57是实施方式55的疫苗组合物，其中第一融合蛋白和第二融合蛋白彼此不同。
实施方式58是实施方式57的疫苗组合物，其中第一融合蛋白包含第一抗原或免疫原，第二融合蛋白包含第二抗原或免疫原，第一抗原或免疫原不同于第二抗原或免疫原。
实施方式59是实施方式57或58的疫苗组合物，其中第一融合物包含第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，第二融合蛋白包含第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。第一靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段不同于第二靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。
实施方式60是实施方式53或54的疫苗组合物，其中外孢壁片段来源于表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含第二抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式61是实施方式60的疫苗组合物，其中第一抗原或免疫原与第二抗原或免疫原相同。
实施方式62是实施方式61的疫苗组合物，其中第一抗原或免疫原和第二抗原或免疫原彼此不同。
实施方式63是实施方式37-62中任一个的疫苗组合物，其中组合物还包含佐剂。
实施方式64是用于在动物中产生免疫原性应答的方法，包括向动物施用实施方式37-63中任一个的疫苗组合物。
实施方式65是用于保护动物免于病原体的方法，包括向动物、动物环境或病原体施用：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合。
实施方式66是实施方式65的方法，其中方法包括向动物施用孢子、外孢壁片段或其组合。
实施方式67是实施方式65或66的方法，其中方法包括施用外孢壁片段。
实施方式68是实施方式31-36中任一个的组合物或实施方式65-67中任一个的方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
实施方式69是实施方式31-36和68中任一个的组合物或实施方式65-68中任一个的方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽不包含核酸结合蛋白质或肽。
实施方式70是实施方式31-36，68和69中任一个的组合物或实施方式64-69中任一个的方法，其中动物选自哺乳动物，鸟类，鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，昆虫，珊瑚和海绵。
实施方式71是实施方式70的组合物或方法，其中动物包括哺乳动物，哺乳动物选自人，猴，绵羊，山羊，奶牛，猪，鹿，羊驼，野牛，骆驼，驴，马，骡子，牦牛，驯鹿，骆驼，兔子，狗，猫，雪貂，沙鼠，豚鼠，仓鼠，小鼠，兔子和老鼠。
实施方式72是实施方式70的组合物或方法，其中动物包括鸟类，鸟类选自鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，鸽子，鸽子，鸵鸟，鸸鹋和野鸡。
实施方式73是实施方式70的组合物或方法，其中动物包括鱼类，鱼类选自爱好鱼，鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼和鲟鱼。
实施方式74是实施方式70的组合物或方法，其中动物包含两栖动物，两栖动物选自青蛙，蟾蜍，蝾螈和火蜥蜴。
实施方式75是实施方式70的组合物或方法，其中动物包括爬行动物，爬行动物选自蛇，蜥蜴，鬣蜥，鳄鱼，短吻鳄，乌龟和陆龟。
实施方式76是实施方式70的组合物或方法，其中动物包含甲壳类动物，甲壳类动物选自河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹和小龙虾。
实施方式77是实施方式72-76中任一个的方法，其中用于保护动物免于病原体的方法包括保护动物的卵免于病原体。
实施方式78是实施方式72-77中任一个的方法，其中方法包括将外孢壁片段或孢子施用于动物的卵。
实施方式79是实施方式70的组合物或方法，其中动物包含软体动物，软体动物选自贻贝，蛤，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼和章鱼。
实施方式80是实施方式70的组合物或方法，其中动物包含蠕虫，蠕虫选自蚯蚓，线虫，扁虫，蛔虫，绦虫和吸虫。
实施方式81是实施方式70的组合物或方法，其中动物包括昆虫，昆虫选自蜜蜂，瓢虫，蝴蝶，蚕，苍蝇，甲虫和其任何幼虫。
实施方式82是实施方式31-36，65-72和79-81中任一个的组合物或实施方式65-81中任一个的方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽具有抗菌活性，抗真菌活性，抗蠕虫活性，杀线虫活性，杀虫活性，杀螨活性，抑制昆虫或蠕虫繁殖，其任何组合。
实施方式83是实施方式82的组合物或方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽具有抗细菌活性，抗真菌活性或其组合。
实施方式84是实施方式82或83的组合物或方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含细菌素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，抗微生物肽，伴清蛋白，白蛋白，乳铁蛋白，乳铁蛋白肽，溶菌酶肽，TasA，防御素，抗体，抗体片段，酶，组蛋白或其任何组合。
实施方式85是实施方式84的组合物或方法，其中乳铁蛋白肽包含LfcinB；其中溶菌酶肽包含LysM；或者其中白蛋白包含卵清蛋白。
实施方式86是实施方式85的组合物或方法，其中抗微生物肽包含非核糖体抗菌肽，非核糖体抗真菌肽，天蚕素，对虾肽，牛抗菌肽，蓝蟹抗菌肽，贻贝抗菌肽，鲎肽素，被囊抗菌肽，amisgurin，拟鲽抗菌肽，鲶鱼抗菌肽，或其任何组合。
实施方式87是实施方式84的组合物或方法，其中酶包含核酸酶，蛋白酶，内酯酶，腺苷三磷酸双磷酸酶，糖苷水解酶，藻酸盐裂解酶，葡聚糖酶，壳聚糖酶，几丁质酶，壳聚糖酶样酶，裂解酶，变溶菌素，葡萄球菌溶血素或其任何组合。
实施方式88是实施方式87的组合物或方法，其中糖苷水解酶包含溶菌酶，分散素B或其组合；其中核酸酶包含DNA酶；或者其中几丁质酶包含内切壳多糖酶，外切壳多糖酶或其组合。
实施方式89是实施方式88的组合物或方法，其中DNA酶包含DNaseI；其中内切壳多糖酶包含几丁质酶C；或者其中外切壳多糖酶包含几丁质酶D。
实施方式90是实施方式84的组合物或方法，其中酶包含对细菌信号传导分子特异的酶。
实施方式91是实施方式90的组合物或方法，其中酶包含蛋白酶或内酯酶。
实施方式92是实施方式91的组合物或方法，其中内酯酶包含对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子特异的内酯酶。
实施方式93是实施方式87，91或92的组合物或方法，其中内酯酶包含1,4-内酯酶，2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶，3-氧代己二酸烯醇-内酯酶，放线菌素内酯酶，脱氧柠檬酸A-环内酯酶，葡糖酸内酯酶L-鼠李-1,4-内酯酶，柠檬苦素-D-环内酯酶，类固醇-内酯酶，三乙酸酯-内酯酶，木-1,4-内酯酶，或其任何组合。
实施方式94是实施方式84的组合物或方法，其中酶包含对细菌或真菌的细胞或细胞外组分特异的酶。
实施方式95是实施方式94的组合物或方法，其中酶包括葡聚糖酶，壳聚糖酶，几丁质酶，壳聚糖酶样酶，裂解酶，蛋白酶，变溶菌素，葡萄球菌溶血素，溶菌酶或任何其组合。
实施方式96是实施方式87或95的组合物或方法，其中葡聚糖酶包含纤维素酶，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,6-葡聚糖酶，或其任何组合。
实施方式97是实施方式87或95的组合物或方法，其中蛋白酶包含肽酶，蛋白酶或其组合。
实施方式98是实施方式97的组合物或方法，其中蛋白酶包含蛋白酶K；或者其中肽酶包含内肽酶或外肽酶。
实施方式99是实施方式87或95的组合物或方法，其中蛋白酶包括碱性蛋白酶，酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
实施方式100是实施方式87或95的组合物或方法，其中蛋白酶包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
实施方式101是实施方式100的组合物或方法，其中枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO：209或210具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式102是实施方式82的组合物或方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽具有抗蠕虫活性，杀线虫活性，杀虫活性，杀螨活性，抑制昆虫或蠕虫繁殖，或其任何组合。
实施方式103是实施方式102的组合物或方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包括杀虫细菌毒素，杀螨细菌毒素，内毒素，Cry毒素，蛋白酶抑制剂蛋白质或肽，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊子毒素，半胱氨酸蛋白酶，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，几丁质酶或其任何组合。
实施方式104是实施方式103的组合物或方法，其中杀虫细菌毒素包含VIP杀虫蛋白；其中Cry毒素包含来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素；其中蛋白酶抑制剂蛋白或肽包含胰蛋白酶抑制剂或箭头蛋白酶抑制剂；其中杀蚊毒素包括Mtx样杀蚊毒素，Bin样杀蚊毒素或其组合；或者其中内毒素包含δ内毒素。
实施方式105是实施方式104的组合物或方法，其中Mtx样杀蚊毒素包含Mtx1。
实施方式106是实施方式103或104的组合物或方法，其中Cry毒素包含Cry5B蛋白，Cry21A蛋白，Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，a Cry2Aa蛋白，Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白，Cyt1Aa蛋白或其任何组合。
实施方式107是实施方式31-36，68-76和79-106中任一个的组合物或实施方式65-106中任一个的方法，其中病原体包含细菌病原体，真菌病原体，致病性蠕虫，致病性昆虫，致病性螨虫，致病性原生生物或其任何组合。
实施方式108是实施方式107的组合物或方法，其中病原体包括细菌病原体，细菌病原体包括葡萄球菌属的细菌病原体，嗜血杆菌属的细菌病原体，假单胞菌属的细菌病原体，链球菌属的细菌病原体，分枝杆菌属的细菌病原体，梭菌属的病原体，肠杆菌属的细菌病原体，肠球菌属的细菌病原体，气单胞菌属的细菌病原体，不动杆菌属的细菌病原体，梭菌属的细菌病原体，普氏菌属的细菌病原体，黄杆菌属的细菌病原体，爱德华氏菌属的细菌病原体，无形体属的细菌病原体，芽孢杆菌属的细菌病原体，巴尔通体属的细菌病原体，博德特氏菌属的细菌病原体，包柔氏螺旋体属的细菌病原体，布鲁氏菌属的细菌病原体，伯克氏菌属的病原体，衣原体属的细菌病原体，柯克斯体属的细菌病原体，埃立克体属的细菌病原体，幽门螺杆菌属的细菌病原体，克雷伯菌属的细菌病原体，拉氏菌属的细菌病原体，钩端螺旋体属的细菌病原体，支原体属的细菌病原体，新立克次体属的细菌病原体，巴斯德氏菌属的细菌病原体，立克次体属的细菌病原体，沙门氏菌属的细菌病原体，或其任何组合。
实施方式109是实施方式108的组合物或方法，其中细菌病原体包括鲍曼不动杆菌，嗜水气单胞菌，嗜粒细胞无形体，嗜吞噬细胞无形体，扁平无形体，炭疽杆菌，汉氏巴尔通体，罗氏巴尔通体，韦氏巴尔通体伯格霍夫亚种，支气管败血性鲍特菌，泰累尔氏包柔氏螺旋体，伯氏包柔氏螺旋体，流产布氏杆菌，羊布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，鼻疽伯克霍尔德菌，假鼻疽伯克霍尔德菌，流产嗜性衣原体，猫衣原体，鹦鹉热衣原体，肉毒梭菌，艰难梭菌，产气荚膜梭菌，毛状梭菌，破伤风杆菌，贝氏柯克斯体，鮰爱德华氏菌，犬埃立克体，查菲埃立克体，埃氏埃立克体，反刍兽埃立克体，粪肠球菌，猪瘟病毒杆菌，黄杆菌菌株，坏死梭杆菌，流感嗜血杆菌，猫嗜血杆菌，肝炎螺杆菌，肺炎克雷伯菌，胞内劳森菌，波蒙那钩端螺旋体，秋令热钩端螺旋体，拜伦钩端螺旋体，犬型钩端螺旋体，感冒伤寒型钩端螺旋体，出血性黄疸钩端螺旋体，感染途径钩端端螺旋体，鸟支原体，牛支原体，偶发支原体，微小支原体，副结核支原体，结核支原体，无乳支原体，山羊支原体，山羊支原体亚种肺炎衣原体，猫支原体，蕈状山羊支原体，蕈状支原体亚种蕈状，腐败支原体，牛淤点热新立克次体，蠕虫新立克次体，里氏新立克次体，多杀性巴氏杆菌，绿浓杆菌，产黑色素普氏菌，普氏立克次体，地方性斑疹伤寒立克次体，非凡螺原体，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，鱼发酵葡萄球菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，牛链球菌，链球菌组A，链球菌组B，链球菌组C，链球菌组D，链球菌组G，马类亚种链球菌，兽疫亚种链球菌，马生殖道泰勒氏菌，或其任何组合。
实施方式110是实施方式107的组合物或方法，其中病原体包括真菌病原体，真菌病原体包括曲霉属的真菌病原体，小孢子菌属的真菌病原体，隐球菌属的真菌病原体，金孢子菌属的真菌病原体，脑炎的真菌病原体，真菌肠嗜血杆菌属的病原体，镰刀菌属的真菌病原体，横梗霉属的真菌病原体，马鞭草属的真菌病原体，毛癣菌属的真菌病原体，被孢霉属的真菌病原体，菌根属的真菌病原体，犁头霉属的真菌病原体，根霉属的真菌病原体，枝孢菌属的真菌病原体，帚霉属的真菌病原体，原壁菌属的真菌病原体，强雄腐霉属的真菌病原体，红酵母属的真菌病原体，葡萄状穗霉属的真菌病原体，链壶菌属的真菌病原体，离壶菌属的真菌病原体，念珠菌属的真菌病原体，或其任何组合。
实施方式111是实施方式107的组合物或方法，其中病原体包括真菌病原体，真菌病原体包括机会性的暗色性真菌病原体。
实施方式112是实施方式110的组合物或方法，其中真菌病原体包括短小金孢子菌，家兔脑胞内原虫，伞状毛霉菌，Lagenidium myophilum，沃尔夫被孢霉，纸葡萄穗霉，新型隐球菌，白念珠菌，疣状毛癣菌，马发癣菌，须毛癣菌，或其任何组合。
实施方式113是实施方式107的组合物或方法，其中病原体包括致病性蠕虫，致病性蠕虫包括线虫，蠕虫，蛔虫，蛲虫，鞭虫，蚯蚓，盲肠蠕虫，胃蠕虫，毛虫，螺纹蠕虫，吸虫，绦虫或其任何组合。
实施方式114是实施方式113的组合物或方法，其中致病性蠕虫包括猪蛔虫，旋毛虫，猪鞭虫，人蛔虫，蛔虫属，旋毛虫，奥斯特线虫，帕莱斯血矛线虫，肿孔古柏线虫，网尾线虫，肝片吸虫，捻转血矛线虫，巴特斯细颈线虫，类圆线虫属，犬钩虫，犬弓蛔虫，猫弓蛔虫，巨颈绦虫，或其任何组合。
实施方式115是实施方式107的组合物或方法，其中病原体包括致病性昆虫，致病性昆虫包括内寄生虫，外寄生虫或其组合。
实施方式116是实施方式115的组合物或方法，其中致病性昆虫包括内寄生虫和外寄生虫，其选自跳蚤，蜱，虱，螨，苍蝇，蚊子，其任何幼虫及其任何组合；或者其中致病性昆虫包括内寄生虫和外寄生虫，其选自踵蝇，皮蝇，肤蝇，胃蝇属，其任何幼虫，及其任何组合
实施方式117是实施方式107的组合物或方法，其中病原体包括病原体原生生物，病原体原生生物包括巴贝斯虫属的原生生物，新孢子虫属的原生生物，肉孢子虫属的原生生物，泰勒虫属的原生生物，锥虫属的原生生物，内阿米巴属的原生生物，贾第虫属的原生生物，隐孢子虫属的原生生物，毛滴虫属的原生生物，弓形虫属的原生生物，疟原虫属的原生生物，球虫属的原生生物，利什曼原虫属的原生生物，隐孢子虫属的原生生物，环孢子的原生生物，艾美球虫属的原生生物，纳氏虫属的原生生物，肉孢子虫属的原生生物，新孢子虫属的原生生物，芽囊原虫属的原生生物，微孢子虫属的原生生物，或其任何组合。
实施方式118是实施方式117的组合物或方法，其中病原体原生生物包括溶组织内阿米巴，牛巴贝虫，双芽巴贝虫，犬巴贝虫，巨型艾美球虫，柔嫩艾美耳球虫，兔贾第鞭毛虫，杜氏利什曼虫，犬新孢子虫，神经肉孢子虫，小泰累尔梨浆虫，环状泰累尔梨浆虫，羊泰累尔梨浆虫，刚地弓形虫，或其任何组合。
实施方式119是实施方式64-118中任一个的方法，其中疫苗组合物、外孢壁片段或孢子通过局部，口服，腹膜内，动脉内，静脉内，肌肉内，皮下，胸膜内，鼻内，直肠，皮内，吸入，透皮或经上皮施用，或通过将动物浸入包含外孢壁片段或孢子的溶液中而施用于动物。
实施方式120是包含可用于水产养殖和外孢壁片段的载体的组合物，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式121是实施方式120的组合物，其中载体包含疏水聚合物。
实施方式122是实施方式120或121的组合物，其中组合物为干粉或水分散性颗粒的形式。
实施方式123是实施方式120-122中任一个的组合物，其中保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽包括腺苷三磷酸双磷酸酶，分散素B或其组合。
实施方式124是用于保护水生生物免于病原体的方法，包括在水产养殖系统中培养水生生物并引入水产养殖系统：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽，以及靶向融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合；
其中水生生物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵，红藻，褐藻或其任何组合。
实施方式125是实施方式120-123中任一个的组合物或实施方式124的方法，其中保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽不包含抗原或免疫原。
实施方式126是实施方式120-123和125中任一个的组合物或实施方式124或125的方法，其中水生生物包含红藻，褐藻或其组合。
实施方式127是实施方式126的组合物或方法，其中褐藻包含海藻。
实施方式128是实施方式127的组合物或方法，其中海藻包含紫菜，海带或其组合。
实施方式129是实施方式65-119和124-128中任一个的方法，其中方法是用于保护水生动物免于病原体的方法，并且方法包括在水产养殖系统中培养水生动物并通过将孢子或外孢壁碎片引入水产养殖系统以将孢子或外孢壁片段施用于水生动物。
实施方式130是实施方式124-129中任一个的方法，其中方法包括将外孢壁片段引入水产养殖系统。
实施方式131是实施方式120-123和125中任一个的组合物或实施方式124-130中任一个的方法，其中水生生物或水生动物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物，蠕虫，珊瑚，海绵或其任何组合。
实施方式132是实施方式131的组合物或方法，其中水生生物或水生动物包括鱼类，鱼类选自鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼，鲟鱼或其任何组合。
实施方式133是实施方式131的组合物或方法，其中水生生物或水生动物包括两栖动物，两栖动物选自青蛙，蟾蜍，蝾螈，火蜥蜴或其任何组合；或者其中水生生物或水生动物包括爬行动物，爬行动物选自蛇，蜥蜴，鳄鱼，短吻鳄，乌龟，陆龟或其任何组合。
实施方式134是实施方式133的组合物或方法，其中水生生物或水生动物包括青蛙，蟾蜍，短吻鳄，乌龟或其任何组合。
实施方式135是实施方式131的组合物或方法，其中水生生物或水生动物包含甲壳类动物，甲壳类动物选自河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹，小龙虾及其任何组合。
实施方式136是实施方式131的组合物或方法，其中水生生物或水生动物包含软体动物，软体动物选自贻贝，蛤，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼，章鱼和其任何组合。
实施方式137是实施方式124-136中任一个的方法，其中方法预防或治疗由病原体引起的水生生物或水生动物的疾病。
实施方式138是实施方式124-137中任一个的方法，其中方法防止或抑制生物膜形成或促进生物膜在水产养殖系统内的表面上的溶解。
实施方式139是实施方式124-138中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子引入水产养殖系统包括将外孢壁片段或孢子添加到水产养殖系统中的水中。
实施方式140是实施方式124-139中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子引入水产养殖系统包括将外孢壁片段或孢子施用于水产养殖系统内的表面。
实施方式141是实施方式138或140的方法，其中表面包括管道，罐，泵，过滤器或其任何组合的表面。
实施方式142是实施方式124-141中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子引入水产养殖系统包括将水生生物或水生动物浸入包含外孢壁片段或孢子的溶液中。
实施方式143是实施方式124-142中任一个的方法，其中水产养殖系统是淡水水产养殖系统。
实施方式144是实施方式124-142中任一个的方法，其中水产养殖系统是盐水水产养殖系统。
实施方式145是实施方式124-142中任一个的方法，其中水产养殖系统是微咸水水产养殖系统。
实施方式146是实施方式124-145中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子以包含外孢壁片段或孢子和载体的组合物引入水产养殖系统。
实施方式147是实施方式120-122，125-128和131-136中任一个的组合物或实施方式124-146中任一个的方法，其中保护水生生物免于病原体的蛋白质或肽或保护动物免于病原体的蛋白质或肽包括腺苷三磷酸双磷酸酶，蛋白酶，几丁质酶，葡聚糖酶，抗微生物蛋白或肽，内酯酶或其任何组合。
实施方式148是实施方式147的组合物或方法，其中葡聚糖酶包含β-1,3-葡聚糖酶。
实施方式149是实施方式147的组合物或方法，其中蛋白酶包含枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。
实施方式150是实施方式149的组合物或方法，其中枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO：209或210具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式151是实施方式147的组合物或方法，其中抗微生物蛋白或肽包含乳铁蛋白肽。
实施方式152是实施方式151的组合物或方法，其中乳铁蛋白肽包含LfcinB。
实施方式153是实施方式120-123，125-128，131-136和147-152中任一个的组合物或实施方式124-152中任一个的方法，其中病原体包含链壶菌属的真菌病原体，离壶菌属的真菌病原体，嗜水气单胞菌，或其任何组合。
实施方式154是实施方式65-119中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子施用于动物包括将外孢壁片段或孢子施用于动物的伤口。
实施方式155是实施方式154的方法，其中方法包括将外孢壁片段施用于动物的伤口。
实施方式156是实施方式154或155的方法，其中方法预防或治疗伤口感染。
实施方式157是实施方式154-156中任一个的方法，其中该方法防止或抑制伤口中的生物膜形成或促进生物膜在伤口内的溶解。
实施方式158是实施方式154-157中任一个的方法，包括将外孢壁片段或孢子以包含外孢壁片段或孢子和药学上可接受的载体的药物组合物施用于伤口。
实施方式159是实施方式31的组合物或实施方式158的方法，其中组合物包含溶液，洗剂，乳膏，软膏，凝胶，泡沫，喷雾，浸渍或浴。
实施方式160是实施方式31或159的组合物，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含腺苷三磷酸双磷酸酶。
实施方式161是实施方式31或160的组合物或实施方式158的方法，其中组合物以粘合贴剂或伤口敷料提供。
实施方式162是包含药物组合物的粘合贴剂或伤口敷料，其中药物组合物包含药学上可接受的载体和：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合。
实施方式163是实施方式31和159-161中任一个的组合物、实施方式154-159和161中任一个的方法或实施方式162的粘合贴剂或伤口敷料，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包括酶，抗菌肽，内毒素，Cry蛋白，抗真菌肽或蛋白质，或其任何组合。
实施方式164是实施方式163的组合物，方法，粘合贴剂或伤口敷料，其中酶包括腺苷三磷酸双磷酸酶，内酯酶，蛋白酶，葡聚糖酶，几丁质酶或其任何组合；或者其中内毒素包含δ内毒素。
实施方式165是实施方式31和159-161，163和164中任一个的组合物、实施方式154-159，161，163和164中任一个的方法或实施方式162-164中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，其中病原体包含鲍氏不动杆菌。
实施方式166是实施方式31和159-161，163和164中任一个的组合物、实施方式154-159，161，163和164中任一个的方法或实施方式162-164中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，其中病原体包括链球菌属的细菌病原体，葡萄球菌属的细菌病原体，假单胞菌属的细菌病原体，肠球菌属的细菌病原体，或其任何组合。
实施方式167是实施方式65-119中任一个的方法，其中动物包括蹄动物，并且其中将外孢壁片段或孢子施用于动物包括将外孢壁片段或孢子施用于动物的一个或多个蹄。
实施方式168是实施方式167的方法，其中方法包括将外孢壁片段施用于动物的一个或多个蹄。
实施方式169是实施方式167或168的方法，其中方法预防或治疗影响动物蹄的感染性疾病。
实施方式170是实施方式169的方法，其中感染性疾病包括感染性皮肤病，钩端螺旋体病，鹅口疮，白线病，由密螺旋体属的细菌病原体引起的感染，由节瘤偶蹄形菌属的细菌病原体引起的感染，由梭菌属的细菌病原体引起的感染，由放线菌属的细菌病原体引起的感染，或其任何组合。
实施方式171是实施方式167-170中任一个的方法，其中蹄动物包括奶牛，绵羊，野牛，水牛，鹿，马，骡子，骆驼，猪或山羊。
实施方式172是实施方式167-171中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子施用于动物的一个或多个蹄包括使用足浴。
实施方式173是实施方式172的方法，其中方法包括使动物通过足浴，所述足浴含有包含外孢壁片段或孢子和载体的组合物。
实施方式174是实施方式173的方法，其中组合物在足浴中存在的深度足以使组合物在动物走过足浴时与动物蹄的感染区域接触。
实施方式175是实施方式31-33中任一个的组合物或实施方式173或174的方法，其中组合物包含液体，半固体，水分散性颗粒，可溶性粉末，泡沫，洗剂或凝胶。
实施方式176是实施方式31-33中任一个的组合物或实施方式173或174的方法，其中组合物是用于足浴的液体浓缩物或粉末。
实施例177是用于牲畜足浴的插入托盘，其中插入托盘包括：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合；
其中孢子或外孢壁片段固定在插入托盘的内表面上。
实施方式178是实施方式177的插入托盘，其中插入托盘包含外孢壁片段。
实施方式179是实施方式167-175中任一个的方法，其中将外孢壁片段或孢子施用于动物的一个或多个蹄包括使用包含组合物的蹄绷带，所述组合物包含外孢壁片段或孢子和载体。
实施方式180是包含药物组合物的蹄绷带，其中药物组合物包含药学上可接受的载体和：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护蹄动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合。
实施方式181是实施方式180的蹄绷带，其中孢子或外孢壁片段固定在绷带的与蹄动物的蹄接触的表面上。
实施方式182是实施方式180或181的蹄绷带，其中药物组合物包含外孢壁片段。
实施方式183是实施方式167-176和179中任一个的方法、实施方式175或176的组合物、实施方式177或178的插入托盘或实施方式180-182的蹄绷带，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包括乳铁蛋白，乳铁蛋白肽，溶菌酶，溶菌酶肽，蛋白酶，葡聚糖酶，抗微生物肽或蛋白质，腺苷三磷酸双磷酸酶，内酯酶或其任何组合。
实施方式184是实施方式183的方法，组合物，插入托盘或蹄绷带，其中乳铁蛋白肽包含LfcinB或其中溶菌酶肽包含LysM。
实施方式185是实施方式167-176，179，183和184中任一个的方法，实施方式175，176，183和184中任一个的组合物，实施方式177，178，183和184中任一个的插入托盘或实施方式180-184中任一个的蹄绷带，其中病原体包括坏死梭杆菌，普雷沃氏黑色素，金孢孢子虫属，钩端螺旋体的细菌病原体，放线菌属的细菌病原体，细菌密螺旋体属的病原体，梭菌属的细菌病原体，或其任何组合。
实施方式186是实施方式167-176，179和183-185中任一个的方法，实施方式175，176和183-185中任一个的组合物，实施方式177，178和183-185中任一个的插入托盘或实施方式180-185中任一个的蹄绷带，其中病原体包含两种或更多种病原体的混合物。
实施方式187是实施方式65-119中任一个的方法，其中动物包含反刍动物，并且方法包括将孢子或外孢壁片段口服施用于反刍动物。
实施方式188是实施方式187的方法，其中方法包括将外孢壁片段口服施用于反刍动物。
实施方式189是实施方式187或188的方法，其中将孢子或外孢壁片段口服施用于反刍动物包括将孢子或外孢壁片段喂食给反刍动物。
实施方式190是实施方式187-189中任一个的方法，其中反刍动物包括奶牛，绵羊，野牛，山羊，鹿或马。
实施方式191是实施方式187-190中任一个的方法，其中方法治疗或预防反刍动物的臃肿。
实施方式192是包含外孢壁片段的饲料或饲料添加剂，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种保护动物免于病原体的蛋白质或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式193是实施方式187-191中任一个的方法或实施方式192的饲料或饲料添加剂，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含乳铁蛋白，乳铁蛋白肽，溶菌酶或溶菌酶肽，抗微生物蛋白质或肽，酶或其任何组合。
实施方式194是实施方式193的方法，饲料或饲料添加剂，其中酶包括腺苷三磷酸双磷酸酶，蛋白酶，葡聚糖酶，内酯酶或其任何组合。
实施方式195是实施方式193的方法，饲料或饲料添加剂，其中乳铁蛋白肽包含LfcinB或其中溶菌酶包含LysM。
实施方式196是实施方式187-191，193-195中任一个的方法，或实施方式192-195中任一个的饲料或饲料添加剂，其中病原体包括牛链球菌，坏死梭杆菌或其组合。
实施方式197是实施方式65-119中任一个的方法，其中方法包括将外孢壁片段或孢子施用于动物以预防或治疗乳腺炎。
实施方式198是实施方式197的方法，其中方法包括施用外孢壁片段。
实施方式199是实施方式197或198的方法，其中动物包含乳品动物。
实施方式200是实施方式197或198的方法，其中动物包括山羊，奶牛，羊，水牛，骆驼，牦牛，马，驯鹿，人，狗，猫或驴。
实施方式201是实施方式197-200中任一个的方法，包括以包含外孢壁片段或孢子和药学上可接受的载体的组合物施用外孢壁片段或孢子。
实施方式202是实施方式201的方法，其中将组合物局部施用于动物的乳房或乳头。
实施方式203是实施方式202的方法，其中局部施用包括将动物的乳房或乳头浸入组合物中，将组合物喷雾到动物的乳房或乳头上，或其组合。
实施方式204是实施方式197-203中任一个的方法，其中乳腺炎包括真菌性乳腺炎。
实施方式205是实施方式204的方法，其中真菌性乳腺炎包括由新型隐球菌，白色念珠菌，原壁菌属的真菌病原体或其组合引起的真菌性乳腺炎。
实施方式206是实施方式197-205中任一个的方法，其中乳腺炎包括细菌性乳腺炎。
实施方式207是实施方式206的方法，其中细菌性乳腺炎包括由葡萄球菌属的细菌病原体，埃希氏菌属的细菌病原体或其组合引起的细菌性乳腺炎。
实施方式208是实施方式206或207的方法，其中方法进一步包括共同施用抗生素。
实施方式209是实施方式206或207的方法，其中方法不进一步包括共同施用抗生素。
实施方式210是实施方式33的组合物，其中局部组合物是乳头浸渍组合物的形式。
实施方式211是实施方式33，34和210中任一个的组合物，其中组合物不包含抗生素。
实施方式212是实施方式33，34和210中任一个的组合物，其中组合物还包含抗生素。
实施方式213是实施方式208的方法或实施方式212的组合物，其中抗生素包含β-内酰胺，林可酰胺或其组合。
实施方式214是实施方式213的方法或组合物，其中β-内酰胺包括阿莫西林，头孢噻呋，头孢匹林，clooxillin，海他西林，青霉素或其任何组合；或者其中林可酰胺包括吡利霉素。
实施方式215是实施方式197-209，213和214中任一个的方法或实施方式31-34和210-213中任一个的组合物，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包括葡聚糖酶，裂解酶，几丁质酶，腺苷三磷酸双磷酸酶，抗微生物肽或蛋白质，蛋白酶，乳铁蛋白或乳铁蛋白肽，溶菌酶或溶菌酶肽，内酯酶或其任何组合。
实施方式216是实施方式215的方法或组合物，其中葡聚糖酶包含β-1,3-葡聚糖酶；其中乳铁蛋白肽包含LfcinB；或其中溶菌酶肽包含LysM。
实施方式217是实施方式65-119中任一个的方法，其中方法包括预防或治疗昆虫，螨虫或线虫感染或侵染。
实施方式218是实施方式217的方法，其中动物包括家畜，人或伴侣动物。
实施方式219是实施方式218的方法，其中动物包括奶牛，马，绵羊，山羊，猪，野牛，骆驼，驴，骡子，牦牛，驯鹿，美洲驼，兔子，狗，猫，雪貂，沙鼠，豚鼠，仓鼠，老鼠，兔子，老鼠，火鸡，鸡，鹅或鸭子。
实施方式220是实施方式217-219中任一个的方法，其中方法预防或治疗苍蝇或苍蝇幼虫侵染。
实施方式221是实施方式220的方法，其中方法预防或治疗马或奶牛的苍蝇或苍蝇幼虫侵染。
实施方式222是实施方式217-219中任一个的方法，其中方法预防或治疗螨虫侵染。
实施方式223是实施方式222的方法，其中方法预防或治疗人类中的螨虫感染。
实施方式224是实施方式217-223中任一个的方法，其中方法包括将外孢壁片段或孢子局部施用于动物。
实施方式225是实施方式224的方法，其中所述方法包括通过局部喷雾剂，局部洗剂，局部乳膏，局部凝胶或其任何组合施用外孢壁片段或孢子。
实施方式226是实施方式31-34中任一个的组合物或实施方式217-225中任一个的方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含Mtx1，δ内毒素，Cry毒素，几丁质酶，分泌的杀虫(Sip)蛋白质，或其任何组合。
实施方式227是实施方式217-219中任一个的方法，其中方法包括预防或治疗线虫感染。
实施方式228是实施方式227的方法，其中方法包括将外孢壁片段或孢子喂食给线虫。
实施方式229是实施方式227或228的方法，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含杀线虫蛋白质或肽。
实施方式230是包含载体和外孢壁片段的杀线虫组合物，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种杀线虫蛋白或肽以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式231是实施方式229的方法或实施方式230的组合物，其中杀线虫蛋白或肽包含几丁质酶，Cry蛋白，δ内毒素或其任何组合。
实施方式232是实施方式231的方法或组合物，其中几丁质酶包含几丁质酶C，几丁质酶D或其组合；或其中Cry蛋白包含Cry5B蛋白，Cry21A蛋白或其任何组合。
实施方式233是实施方式227-229，231和232中任一个的方法或实施方式230-233中任一个的组合物，其中外孢壁片段包含来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达Cry毒素，杀线虫毒素，几丁质酶，蛋白酶抑制剂蛋白质或其任何组合。
实施方式234是实施方式227-229和231-233中任一个的方法或实施方式230-233中任一个的组合物，其中方法还包括施用来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达Cry毒素，杀线虫毒素，几丁质酶，蛋白酶抑制剂蛋白质或其组合，或其中组合物还包含来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达Cry毒素，杀线虫毒素，几丁质酶，a蛋白酶抑制剂蛋白质或其组合。
实施方式235是实施方式227-229和231-234中任一个的方法或实施方式230-234中任一个的组合物，其中方法还包括施用Cry蛋白或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种Cry蛋白以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；或其中组合物还包含Cry蛋白或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种Cry蛋白以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式236是通过杀死病原体的昆虫或螨虫载体来保护动物免于病原体的方法，其中方法包括使昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫接触：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合。
实施方式237是实施方式236的方法，其中方法包括使昆虫或螨虫或其幼虫或龄虫与外孢壁片段接触。
实施方式238是包含载体和外孢壁片段的杀虫或杀螨组合物，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家庭成员的外孢壁。
实施方式239是实施方式238的组合物，其中组合物适合于局部施用。
实施方式240是实施方式238或239的组合物，其中组合物为洗剂，凝胶，霜剂或洗剂的形式。
实施方式241是实施方式238或239的组合物，其中组合物为干粉，饼或水分散性颗粒的形式。
实施方式242是实施方式23-28，238和239中任一个的组合物，用于昆虫喷雾器。
实施方式243是包含组合物的昆虫雾化器，所述组合物包含载体和：
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种对动物病原体的昆虫或螨虫载体或昆虫载体的幼虫或龄虫具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合。
实施方式244是实施方式236或237的方法、实施方式238-242中任一个的组合物或实施方式243的昆虫喷雾器，其中具有杀虫或杀螨活性的蛋白质或肽不包含核酸结合蛋白或肽。
实施方式245是实施方式236，237和244中任一个的方法、实施方式238-242和244中任一个的组合物或实施方式243或244的昆虫喷雾器，其中具有杀虫剂的蛋白质或肽或杀螨活性包括杀虫细菌毒素，杀螨细菌毒素，内毒素，Cry毒素，蛋白酶抑制剂蛋白或肽，分泌的杀虫(Sip)蛋白，杀蚊毒素，半胱氨酸蛋白酶，枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，几丁质酶，或其任何组合。
实施方式246是实施方式245的方法，组合物或昆虫喷雾器，其中杀虫细菌毒素包含VIP杀虫蛋白；其中Cry毒素包含来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素；其中蛋白酶抑制剂蛋白或肽包含胰蛋白酶抑制剂或箭头蛋白酶抑制剂；其中杀蚊毒素包括Mtx样杀蚊毒素，Bin样杀蚊毒素或其组合；或其中内毒素包含δ内毒素。
实施方式247是实施方式246的方法，组合物或昆虫喷雾器，其中Mtx样杀蚊毒素包含Mtx1。
实施方式248是实施方式245或246的方法，组合物或昆虫喷雾器，其中Cry毒素包含Cry1Aa蛋白，Cry1Ab蛋白，Cry1Ac蛋白，Cry1Ca蛋白，Cry1Da蛋白，Cry2Aa蛋白，a Cry3Aa蛋白，Cry3Bb蛋白，Cry4Aa蛋白，Cry4Ab蛋白，Cry11Aa蛋白或Cyt1Aa蛋白。
实施方式249是实施方式236，237和244-250中任一个的方法、实施方式238-242和244-250中任一个的组合物或实施方式243-250中任一个的昆虫喷雾器，其中昆虫或螨虫载体包括跳蚤，苍蝇，蜱，螨，蚊子，刺客虫或其任何组合；或其中昆虫或螨虫载体的幼虫或龄虫包括跳蚤，苍蝇，蜱，螨，蚊子，刺客虫或其任何组合的幼虫。
实施方式250是实施方式249的方法，组合物或昆虫喷雾器，其中苍蝇包括白蛉或黑蝇，或其中幼虫或龄虫包括白蛉或黑蝇的幼虫或龄虫。
实施方式251是实施方式236，237和244-250中任一个的方法、实施方式238-242和244-250中任一个的组合物或实施方式243-250中任一个的昆虫喷雾器，其中病原体包括黄热病病毒，登革热病毒，耶尔森菌属的细菌病原体，盘尾丝虫属的致病性蠕虫，寨卡病毒，欧利希氏体属的细菌病原体，无形体属的细菌病原体，伯氏疏螺旋体属的细菌病原体，巴贝虫属的病原体，利什曼原虫属的病原性原生生物，锥虫属的病原性原生生物，血吸虫属的病原性原生生物，西尼罗河病毒，疟原虫属的病原性原生生物，立克次体属的细菌病原体，川崎病毒，基孔肯雅病毒，恶丝虫属的致病性蠕虫，东部马脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，LaCrosse脑病病毒，西部马脑炎病毒，Pappataci病毒或其任何组合。
实施方式252是实施方式236，237和244-251中任一个的方法、实施方式238-242和244-251中任一个的组合物或实施方式243-351中任一个的昆虫喷雾器，其中外孢壁片段包含来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达杀虫毒素，杀螨毒素或其组合。
实施方式253是实施方式236，237和244-252中任一个的方法、实施方式238-242和244-252中任一个的组合物或实施方式243-252中任一个的昆虫喷雾器，其中方法还包括施用来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达杀虫毒素，杀螨毒素或其组合；或其中组合物或昆虫喷雾器还包含来源于蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁片段，其天然表达杀虫毒素，杀螨毒素或其组合。
实施方式254是实施方式236，237和244-253中任一个的方法、实施方式238-242和244-253中任一个的组合物或实施方式243-253中任一个的昆虫喷雾器，其中方法还包括施用杀虫毒素，杀螨毒素或其组合或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种杀虫毒素或杀螨毒素以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；或其中组合物或昆虫雾化器还包含杀虫毒素，杀螨毒素或其组合或表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种杀虫毒素或杀螨毒素以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
实施方式255是实施方式251-254中任一个的方法，组合物或昆虫喷雾器，其中杀虫毒素包含Cry蛋白。
实施方式256是实施方式236，237和233-255中任一个的方法，其中使昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫与外孢壁片段或孢子接触包括将包含外孢壁片段或孢子的组合物喷洒到昆虫或幼虫的环境中，将包含外孢壁片段或孢子的组合物施用于水体或昆虫繁殖场，将外孢壁片段或孢子施用于病原体宿主，或其任何组合。
实施方式257是实施方式256的方法，其中将包含外孢壁片段或孢子的组合物喷雾到环境中包括使用喷雾器。
实施方式258是实施方式256的方法，其中将外孢壁片段或孢子施用于病原体宿主包括用包含外孢壁片段或孢子的组合物喷雾到宿主，将宿主浸入包含外孢壁片段或孢子的组合物中，或其组合。
实施方式259是实施方式31-36中任一个的药物组合物，其中保护动物免于病原体的蛋白质或肽包含抗原或免疫原。
实施方式260是实施方式259的药物组合物，其中所述抗原或免疫原来源于病原体，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌和鱼孢霉。
实施方式261是实施方式259或260的药物组合物，其中组合物是粉末或液体浓缩物的形式。
实施方式262是一种在水生动物中产生免疫原性应答的方法，包括向水生动物施用：
外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原，以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合；
并且其中通过将水生动物浸入包含外孢壁片段的溶液中以将外孢壁片段或孢子施用于水生动物。
实施方式263是在水生动物中产生免疫原性应答的方法，包括向水生动物施用外孢壁片段，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；其中水生动物选自鱼类，两栖动物，甲壳类动物，软体动物及其任何组合。
实施方式264是实施方式262或263的方法，其中将外孢壁片段或孢子施用于水生动物导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌，鱼孢霉及其任何组合。
实施方式265是用于在水生动物中产生免疫原性应答的方法，包括向水生动物施用：
外孢壁片段到水生动物，其中外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使融合蛋白靶向重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合；
并且其中将外孢壁片段或孢子施用于水生动物导致水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌，鲁氏耶尔森菌，鮰爱德华菌，柱状黄杆菌，绿色气球菌，杀鲑气单胞菌，嗜水气单胞菌，毛霉亮发菌，创伤弧菌，副溶血性弧菌，溶藻弧菌，希瓦氏菌属的细菌病原体，雕萎综合体，鲑鱼立克次氏体，水霉属的病原性原生生物，鲤鱼鳃霉菌，坏死鳃霉菌，鱼孢霉及其任何组合。
实施方式266是权利要求262，264和265中任一个的方法，其中方法包括施用外孢壁片段。
实施方式267是实施方式259-261中任一个的组合物或实施方式262-266中任一个的方法，其中抗原或免疫原包含热休克蛋白，外壳蛋白，荚膜蛋白，外膜蛋白，细胞壁蛋白，鞭毛蛋白，菌毛蛋白，纤毛蛋白，睫状蛋白，蛋白质毒素，i抗原或其任何组合。
实施方式268是实施方式263-267中任一个的方法，其中通过将水生动物浸入包含外孢壁片段或孢子的溶液中，通过向水生动物喂食外孢壁片段或孢子，通过将外孢壁或孢子片段注射到水生动物中，或其任何组合，以将外孢壁片段或孢子施用于水生动物。
实施方式269是实施方式268的方法，其中注射包括肌内注射。
实施方式270是实施方式268的方法，其中通过将水生动物浸入包含外孢壁片段，孢子或其组合的溶液中，以将外孢壁片段或孢子施用于水生动物。
实施方式271是实施方式262-270中任一个的方法，其中外孢壁片段或孢子以包含载体和外孢壁片段，孢子或其组合的组合物施用。
实施方式272是实施方式259-261和267中任一个的组合物或实施方式271的方法，其中组合物还包含佐剂。
实施方式273是实施方式259-261，267和272中任一个的组合物或实施方式262和264-272中任一个的方法，其中水生动物选自鱼类，两栖动物，爬行动物，甲壳类动物，软体动物或其任何组合。
实施方式274是实施方式263的方法或实施方式273的组合物或方法，其中水生动物选自鱼类，甲壳类动物或其组合。
实施方式275是实施方式263的方法或实施方式273的组合物或方法，其中水生动物包括鱼类，鱼类选自爱好鱼，鲑鱼，鳟鱼，大比目鱼，鲈鱼，鲷鱼，石斑鱼，鲻鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲶鱼，鲤鱼，鲟鱼及其任何组合。
实施方式276是实施方式263的方法或实施方式273的组合物或方法，其中水生动物包括甲壳类动物，甲壳类动物选自河虾，明虾，磷虾，龙虾，螃蟹，小龙虾及其任何组合。
实施方式277是实施方式263的方法或实施方式273的组合物或方法，其中水生动物包括软体动物，软体动物选自贻贝，蛤，牡蛎，扇贝，蜗牛，蛞蝓，鱿鱼，墨鱼，章鱼及其任何组合。
实施方式278是实施方式262-277中任一个的方法，其中该方法包括将外孢壁片段或孢子施用于水生动物的卵。
实施方式279是实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258和262-278中任一个的方法，其中方法包括在将疫苗组合物施用于动物之前，在将孢子施用于动物之前，在将孢子施用于动物环境之前，在将孢子施用于病原体之前，在将孢子引入水产养殖系统之前，在将昆虫或螨虫载体或昆虫或螨虫载体的幼虫与孢子接触之前，或在将孢子施用于水生动物之前，灭活重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子。
实施方式280是实施方式19和25-28中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员是孢子形式并且孢子是灭活的。
实施方式281是实施方式21-30，32-36，52，54-59，63，68-76，79-118，175，176，183-186，210-216，226，259-261和272-277中任一个的组合物、实施方式162-166中任一个的粘合贴剂或伤口敷料、实施方式177，178和183-186中任一个的插入托盘、实施方式180-185中任一个的蹄绷带或实施方式234-255中任一个的昆虫喷雾器，其中孢子是灭活的。
实施方式282是实施方式20和25-28中任一个的外孢壁片段、实施方式21-36，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261和272-277中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，164-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258和262-279中任一个的方法、实施方式162-166和281中任一个的粘合贴剂或伤口敷料、实施方式177，178，183-186和281中任一个的插入托盘、实施方式180-185和281中任一个的蹄绷带、实施方式192-196中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255中任一个的昆虫喷雾器，其中外孢壁片段来源于表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员还包含突变或表达蛋白质，其中蛋白质的表达与表达相比增加。在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中的蛋白质，并且其中突变或增加与野生型孢子的外孢壁相比，蛋白质的表达导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子具有更容易从孢子中去除的外孢壁。
实施方式283是实施方式282的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器、实施方式54-63中任一个的组合物或实施方式64的方法，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员：
(i)包含CotE基因的突变；
(ii)表达ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签；
(iii)表达BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加；
(iv)表达YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加；
(v)包含ExsY基因的突变；
(vi)包含CotY基因的突变；
(vii)包含ExsA基因的突变；或
(viii)包含CotO基因的突变。
实施方式284是实施方式282或283的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式46或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含CotE基因的突变。
实施方式285是实施方式284的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中CotE基因的突变部分或完全抑制CotE将外孢壁附着在孢子上的能力。
实施方式286是实施方式284或285的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中CotE基因的突变包括CotE基因的敲除或CotE基因的显性负性形式。
实施方式287是实施方式282-286中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或49或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达ExsY蛋白，其中与相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，ExsY蛋白的表达增加，并且其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签。
实施方式288是实施方式287的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中球状蛋白的分子量在25kDa和100kDa之间。
实施方式289是实施方式287或288的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中球状蛋白包含绿色荧光蛋白(GFP)或其变体。
实施方式290是实施方式287-289中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中ExsY蛋白的表达包含含有球状蛋白的羧基末端标签抑制ExsY蛋白与在外孢壁中的其靶标结合。
实施方式291是实施方式282-290中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式49或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，BclB蛋白的表达增加。
实施方式292是实施方式291的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中BclB蛋白的表达导致形成易碎外孢壁。
实施方式293是实施方式282-292中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式49或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员表达YjcB蛋白，其中与相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，YjcB蛋白的表达增加。
实施方式294是实施方式293的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中YjcB蛋白的表达导致外孢壁形成碎片而不是完整结构。
实施方式295是实施方式282-294中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式46或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含ExsY基因的突变。
实施方式296是实施方式295的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中ExsY基因的突变部分或完全抑制ExsY完成形成外孢壁或将外孢壁附接孢子的能力。
实施方式297是实施方式295或296的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中ExsY基因的突变包括ExsY基因的敲除。
实施方式298是实施方式282-297中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式V9或V14的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含CotY基因的突变。
实施方式299是实施方式298的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中CotY基因的突变包括CotY基因的敲除。
实施方式300是实施方式298或299的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中CotY基因的突变导致形成易碎外孢壁。
实施方式301是实施方式282-300中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式46或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含ExsA基因的突变。
实施方式302是实施方式301的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中ExsA基因的突变包括ExsA基因的敲除。
实施方式303是实施方式301或302的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中ExsA基因的突变导致形成易碎外孢壁。
实施方式304是实施方式282-303中任一个的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器或实施方式46或51的组合物，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含CotO基因的突变。
实施方式305是实施方式304的外孢壁片段，组合物，方法，粘合剂贴剂，伤口敷料，插入物托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中CotO基因中的突变包括敲除CotO基因或CotO基因的显性失活形式。
实施方式306是实施方式304或305的外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中CotO基因中的突变导致外孢壁菌。形成条状。
实施方式307是实施方式1-18和25-28中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28和280中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28和282-306中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-306中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-306中任一个的方法、实施方式162-166和281-306中任一个的粘合贴剂或伤口敷料、实施方式177，178，183-186和281-306中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-306中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-306中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-306中任一个的昆虫喷雾器，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段包含：
(1)靶向序列，其包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；
(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-35的靶向序列；
(3)包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-35的靶向序列；
(4)包含SEQ ID NO：1的靶向序列；
(5)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(6)包含SEQ ID NO：1的氨基酸2-35的靶向序列；
(7)包含SEQ ID NO：1的氨基酸5-35的靶向序列；
(8)包含SEQ ID NO：1的氨基酸8-35的靶向序列；
(9)包含SEQ ID NO：1的氨基酸10-35的靶向序列；
(10)包含SEQ ID NO：1的氨基酸15-35的靶向序列；
(11)包含SEQ ID NO：3的氨基酸1-27的靶向序列；
(12)包含SEQ ID NO：3的氨基酸12-27的靶向序列；
(13)包含SEQ ID NO：3的靶向序列；
(14)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：4具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(15)包含SEQ ID NO：3的氨基酸2-27的靶向序列；
(16)包含SEQ ID NO：3的氨基酸5-27的靶向序列；
(17)包含SEQ ID NO：3的氨基酸8-27的靶向序列；
(18)包含SEQ ID NO：3的氨基酸10-27的靶向序列；
(19)包含SEQ ID NO：5的氨基酸1-38的靶向序列；
(20)包含SEQ ID NO：5的氨基酸23-38的靶向序列；
(21)包含SEQ ID NO：5的靶向序列；
(22)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：6具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(23)包含SEQ ID NO：5的氨基酸2-38的靶向序列；
(24)包含SEQ ID NO：5的氨基酸5-38的靶向序列；
(25)包含SEQ ID NO：5的氨基酸8-38的靶向序列；
(26)包含SEQ ID NO：5的氨基酸10-38的靶向序列；
(27)包含SEQ ID NO：5的氨基酸15-38的靶向序列；
(28)包含SEQ ID NO：5的氨基酸20-38的靶向序列；
(29)包含SEQ ID NO：7的氨基酸1-28的靶向序列；
(30)包含SEQ ID NO：7的氨基酸13-28的靶向序列；
(31)包含SEQ ID NO：7的靶向序列；
(32)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：8具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(33)包含SEQ ID NO：7的氨基酸2-28的靶向序列；
(34)包含SEQ ID NO：7的氨基酸5-28的靶向序列；
(35)包含SEQ ID NO：7的氨基酸8-28的靶向序列；
(36)包含SEQ ID NO：7的氨基酸10-28的靶向序列；
(37)包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-24的靶向序列；
(38)包含SEQ ID NO：9的氨基酸9-24的靶向序列；
(39)包含SEQ ID NO：9的靶向序列；
(40)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：10具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(41)包含SEQ ID NO：9的氨基酸2-24的靶向序列；
(42)包含SEQ ID NO：9的氨基酸5-24的靶向序列；
(43)包含SEQ ID NO：9的氨基酸8-24的靶向序列；
(44)包含SEQ ID NO：11的氨基酸1-33的靶向序列；
(45)包含SEQ ID NO：11的氨基酸18-33的靶向序列；
(46)包含SEQ ID NO：11的靶向序列；
(47)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：12具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(48)包含SEQ ID NO：11的氨基酸2-33的靶向序列；
(49)包含SEQ ID NO：11的氨基酸5-33的靶向序列；
(50)包含SEQ ID NO：11的氨基酸8-33的靶向序列；
(51)包含SEQ ID NO：11的氨基酸10-33的靶向序列；
(52)包含SEQ ID NO：11的氨基酸15-33的靶向序列；
(53)包含SEQ ID NO：13的氨基酸1-33的靶向序列；
(54)包含SEQ ID NO：13的氨基酸18-33的靶向序列；
(55)包含SEQ ID NO：13的靶向序列；
(56)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：14具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(57)包含SEQ ID NO：13的氨基酸2-33的靶向序列；
(58)包含SEQ ID NO：13的氨基酸5-33的靶向序列；
(59)包含SEQ ID NO：13的氨基酸8-33的靶向序列；
(60)包含SEQ ID NO：13的氨基酸10-33的靶向序列；
(61)包含SEQ ID NO：13的氨基酸15-33的靶向序列；
(62)包含SEQ ID NO：15的氨基酸1-43的靶向序列；
(63)包含SEQ ID NO：15的氨基酸28-43的靶向序列；
(64)包含SEQ ID NO：15的靶向序列；
(65)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：16具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(66)包含SEQ ID NO：15的氨基酸2-43的靶向序列；
(67)包含SEQ ID NO：15的氨基酸5-43的靶向序列；
(68)包含SEQ ID NO：15的氨基酸8-43的靶向序列；
(69)包含SEQ ID NO：15的氨基酸10-43的靶向序列；
(70)包含SEQ ID NO：15的氨基酸15-43的靶向序列；
(71)包含SEQ ID NO：15的氨基酸20-43的靶向序列；
(72)包含SEQ ID NO：15的氨基酸25-43的靶向序列；
(73)包含SEQ ID NO：17的氨基酸1-27的靶向序列；
(74)包含SEQ ID NO：17的氨基酸12-27的靶向序列；
(75)包含SEQ ID NO：17的靶向序列；
(76)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：18具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(77)包含SEQ ID NO：17的氨基酸2-27的靶向序列；
(78)包含SEQ ID NO：17的氨基酸5-27的靶向序列；
(79)包含SEQ ID NO：17的氨基酸8-27的靶向序列；
(80)包含SEQ ID NO：17的氨基酸10-27的靶向序列；
(81)包含SEQ ID NO：19的氨基酸1-33的靶向序列；
(82)包含SEQ ID NO：19的氨基酸18-33的靶向序列；
(83)包含SEQ ID NO：19的靶向序列；
(84)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：20具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(85)包含SEQ ID NO：19的氨基酸2-33的靶向序列；
(86)包含SEQ ID NO：19的氨基酸5-33的靶向序列；
(87)包含SEQ ID NO：19的氨基酸8-33的靶向序列；
(88)包含SEQ ID NO：19的氨基酸10-33的靶向序列；
(89)包含SEQ ID NO：19的氨基酸15-33的靶向序列；
(90)包含SEQ ID NO：21的氨基酸1-33的靶向序列；
(91)包含SEQ ID NO：21的氨基酸18-33的靶向序列；
(92)包含SEQ ID NO：21的靶向序列；
(93)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：22具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(94)包含SEQ ID NO：21的氨基酸2-33的靶向序列；
(95)包含SEQ ID NO：21的氨基酸5-33的靶向序列；
(96)包含SEQ ID NO：21的氨基酸8-33的靶向序列；
(97)包含SEQ ID NO：21的氨基酸10-33的靶向序列；
(98)包含SEQ ID NO：21的氨基酸15-33的靶向序列；
(99)包含SEQ ID NO：23的氨基酸1-24的靶向序列；
(100)包含SEQ ID NO：23的氨基酸9-24的靶向序列；
(101)包含SEQ ID NO：23的靶向序列；
(102)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：24具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(103)包含SEQ ID NO：23的氨基酸2-24的靶向序列；
(104)包含SEQ ID NO：23的氨基酸5-24的靶向序列；
(105)包含SEQ ID NO：23的氨基酸8-24的靶向序列；
(106)包含SEQ ID NO：25的氨基酸1-24的靶向序列；
(107)包含SEQ ID NO：25的氨基酸9-24的靶向序列；
(108)包含SEQ ID NO：25的靶向序列；
(109)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：26具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(110)包含SEQ ID NO：25的氨基酸2-24的靶向序列；
(111)包含SEQ ID NO：25的氨基酸5-24的靶向序列；
(112)包含SEQ ID NO：25的氨基酸8-24的靶向序列；
(113)包含SEQ ID NO：27的氨基酸1-30的靶向序列；
(114)包含SEQ ID NO：27的氨基酸15-30的靶向序列；
(115)包含SEQ ID NO：27的靶向序列；
(116)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：28具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(117)包含SEQ ID NO：27的氨基酸2-30的靶向序列；
(118)包含SEQ ID NO：27的氨基酸5-30的靶向序列；
(119)包含SEQ ID NO：27的氨基酸8-30的靶向序列；
(120)包含SEQ ID NO：27的氨基酸10-30的靶向序列；
(121)包含SEQ ID NO：29的氨基酸1-33的靶向序列；
(122)包含SEQ ID NO：29的氨基酸18-33的靶向序列；
(123)包含SEQ ID NO：29的靶向序列；
(124)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：30具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(125)包含SEQ ID NO：29的氨基酸2-33的靶向序列；
(126)包含SEQ ID NO：29的氨基酸5-33的靶向序列；
(127)包含SEQ ID NO：29的氨基酸8-33的靶向序列；
(128)包含SEQ ID NO：29的氨基酸10-33的靶向序列；
(129)包含SEQ ID NO：29的氨基酸15-33的靶向序列；
(130)包含SEQ ID NO：31的氨基酸1-24的靶向序列；
(131)包含SEQ ID NO：31的氨基酸9-24的靶向序列；
(132)包含SEQ ID NO：31；
(133)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：32具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(134)包含SEQ ID NO：31的氨基酸2-24的靶向序列；
(135)包含SEQ ID NO：31的氨基酸5-24的靶向序列；
(136)包含SEQ ID NO：31的氨基酸8-24的靶向序列；
(137)包含SEQ ID NO：33的氨基酸1-15的靶向序列；
(138)包含SEQ ID NO：33的靶向序列；
(139)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：34具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(140)包含SEQ ID NO：35的氨基酸1-16的靶向序列；
(141)包含SEQ ID NO：35的靶向序列；
(142)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：36具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(143)包含SEQ ID NO：43的氨基酸1-29的靶向序列；
(144)包含SEQ ID NO：43的氨基酸14-29的靶向序列；
(145)包含SEQ ID NO：43的靶向序列；
(146)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：44具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(147)包含SEQ ID NO：43的氨基酸2-29的靶向序列；
(148)包含SEQ ID NO：43的氨基酸5-29的靶向序列；
(149)包含SEQ ID NO：43的氨基酸8-29的靶向序列；
(150)包含SEQ ID NO：43的氨基酸10-29的靶向序列；
(151)包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-35的靶向序列；
(152)包含SEQ ID NO：45的氨基酸20-35的靶向序列；
(153)包含SEQ ID NO：45的靶向序列；
(154)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：46具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(155)包含SEQ ID NO：45的氨基酸2-35的靶向序列；
(156)包含SEQ ID NO：45的氨基酸5-35的靶向序列；
(157)包含SEQ ID NO：45的氨基酸8-35的靶向序列；
(158)包含SEQ ID NO：45的氨基酸10-35的靶向序列；
(159)包含SEQ ID NO：45的氨基酸15-35的靶向序列；
(160)包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-43的靶向序列；
(161)包含SEQ ID NO：47的氨基酸28-43的靶向序列；
(162)包含SEQ ID NO：47的靶向序列；
(163)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：48具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(164)包含SEQ ID NO：47的氨基酸2-43的靶向序列；
(165)包含SEQ ID NO：47的氨基酸5-43的靶向序列；
(166)包含SEQ ID NO：47的氨基酸8-43的靶向序列；
(167)包含SEQ ID NO：47的氨基酸10-43的靶向序列；
(168)包含SEQ ID NO：47的氨基酸15-43的靶向序列；
(169)包含SEQ ID NO：47的氨基酸20-43的靶向序列；
(170)包含SEQ ID NO：47的氨基酸25-43的靶向序列；
(171)包含SEQ ID NO：49的氨基酸1-32的靶向序列；
(172)包含SEQ ID NO：49的氨基酸17-32的靶向序列；
(173)包含SEQ ID NO：49的靶向序列；
(174)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：50具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(175)包含SEQ ID NO：49的氨基酸2-32的靶向序列；
(176)包含SEQ ID NO：49的氨基酸5-32的靶向序列；
(177)包含SEQ ID NO：49的氨基酸8-32的靶向序列；
(178)包含SEQ ID NO：49的氨基酸10-32的靶向序列；
(179)包含SEQ ID NO：49的氨基酸15-32的靶向序列；
(180)包含SEQ ID NO：51的氨基酸1-33的靶向序列；
(181)包含SEQ ID NO：51的氨基酸18-33的靶向序列；
(182)包含SEQ ID NO：51的靶向序列；
(183)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：52具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(184)包含SEQ ID NO：51的氨基酸2-33的靶向序列；
(185)包含SEQ ID NO：51的氨基酸5-33的靶向序列；
(186)包含SEQ ID NO：51的氨基酸8-33的靶向序列；
(187)包含SEQ ID NO：51的氨基酸10-33的靶向序列；
(188)包含SEQ ID NO：51的氨基酸15-33的靶向序列；
(189)包含SEQ ID NO：53的氨基酸1-33的靶向序列；
(190)包含SEQ ID NO：53的氨基酸18-33的靶向序列；
(191)包含SEQ ID NO：53的靶向序列；
(192)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：54具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(193)包含SEQ ID NO：53的氨基酸2-33的靶向序列；
(194)包含SEQ ID NO：53的氨基酸5-33的靶向序列；
(195)包含SEQ ID NO：53的氨基酸8-33的靶向序列；
(196)包含SEQ ID NO：53的氨基酸10-33的靶向序列；
(197)包含SEQ ID NO：53的氨基酸15-33的靶向序列；
(198)包含SEQ ID NO：55的氨基酸1-30的靶向序列；
(199)包含SEQ ID NO：55的氨基酸15-30的靶向序列；
(200)包含SEQ ID NO：55的靶向序列；
(201)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：56具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(202)包含SEQ ID NO：55的氨基酸2-30的靶向序列；
(203)包含SEQ ID NO：55的氨基酸5-30的靶向序列；
(204)包含SEQ ID NO：55的氨基酸8-30的靶向序列；
(205)包含SEQ ID NO：55的氨基酸10-30的靶向序列；
(206)包含SEQ ID NO：57的氨基酸1-130的靶向序列；
(207)包含SEQ ID NO：57的氨基酸115-130的靶向序列；
(208)包含SEQ ID NO：57的靶向序列；
(209)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：58具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(210)包含SEQ ID NO：57的氨基酸2-130的靶向序列；
(211)包含SEQ ID NO：57的氨基酸5-130的靶向序列；
(212)包含SEQ ID NO：57的氨基酸10-130的靶向序列；
(213)包含SEQ ID NO：57的氨基酸20-130的靶向序列；
(214)包含SEQ ID NO：57的氨基酸30-130的靶向序列；
(215)包含SEQ ID NO：57的氨基酸40-130的靶向序列；
(216)包含SEQ ID NO：57的氨基酸50-130的靶向序列；
(217)包含SEQ ID NO：57的氨基酸60-130的靶向序列；
(218)包含SEQ ID NO：57的氨基酸70-130的靶向序列；
(219)包含SEQ ID NO：57的氨基酸80-130的靶向序列；
(220)包含SEQ ID NO：57的氨基酸90-130的靶向序列；
(221)包含SEQ ID NO：57的氨基酸100-130的靶向序列；
(222)包含SEQ ID NO：57的氨基酸110-130的靶向序列；
(223)外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：95具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(224)包含SEQ ID NO：96的靶向序列；
(225)包含SEQ ID NO：97的靶向序列；
(226)包含SEQ ID NO：98的靶向序列；
(227)包含SEQ ID NO：99的靶向序列；
(228)包含SEQ ID NO：100的靶向序列；
(229)包含SEQ ID NO：101的靶向序列；
(230)包含SEQ ID NO：102的靶向序列；
(231)包含SEQ ID NO：103的靶向序列；
(232)包含SEQ ID NO：104的靶向序列；
(233)包含SEQ ID NO：105的靶向序列；
(234)包含SEQ ID NO：106的靶向序列；
(235)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：108具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(236)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：109具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(237)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：110具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(238)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：111具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(239)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：112具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(240)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：113具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(241)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：114具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(242)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：115具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(243)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：116具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(244)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：117具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(245)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：118具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(246)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：119具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(247)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：120具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(248)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：121具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(249)包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-31的靶向序列；
(250)包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-33的靶向序列；
(251)包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-31的靶向序列；
(252)包含SEQ ID NO：3的氨基酸14-23的靶向序列；
(253)包含SEQ ID NO：3的氨基酸14-25的靶向序列；
(254)包含SEQ ID NO：3的氨基酸12-23的靶向序列；
(255)包含SEQ ID NO：59的氨基酸1-30的靶向序列；
(256)包含SEQ ID NO：59的靶向序列；
(257)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(258)包含SEQ ID NO：59的氨基酸2-30的靶向序列；
(259)包含SEQ ID NO：59的氨基酸4-30的靶向序列；
(260)包含SEQ ID NO：59的氨基酸6-30的靶向序列；
(261)包含SEQ ID NO：61的氨基酸1-33的靶向序列；
(262)包含SEQ ID NO：61的氨基酸18-33的靶向序列；
(263)包含SEQ ID NO：61的靶向序列；
(264)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：62具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(265)包含SEQ ID NO：61的氨基酸2-33的靶向序列；
(266)包含SEQ ID NO：61的氨基酸5-33的靶向序列；
(267)包含SEQ ID NO：61的氨基酸10-33的靶向序列；
(268)包含SEQ ID NO：61的氨基酸15-33的靶向序列；
(269)包含SEQ ID NO：63的氨基酸1-35的靶向序列；
(270)包含SEQ ID NO：63的靶向序列；
(271)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：64具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(272)包含SEQ ID NO：63的氨基酸2-35的靶向序列；
(273)含SEQ ID NO：63的氨基酸5-35的靶向序列；
(274)包含SEQ ID NO：63的氨基酸8-35的靶向序列；
(275)包含SEQ ID NO：63的氨基酸10-35的靶向序列；
(276)包含SEQ ID NO：63的氨基酸15-35的靶向序列；
(277)包含SEQ ID NO：65的氨基酸1-24的靶向序列；
(278)包含SEQ ID NO：65的氨基酸9-24的靶向序列；
(279)包含SEQ ID NO：65的靶向序列；
(280)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：66具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(281)包含SEQ ID NO：107的靶向序列；
(282)包含SEQ ID NO：65的氨基酸2-24的靶向序列；
(283)包含SEQ ID NO：65的氨基酸5-24的靶向序列；
(284)包含SEQ ID NO：67的氨基酸1-27的靶向序列；
(285)包含SEQ ID NO：67的氨基酸12-27的靶向序列；
(286)包含SEQ ID NO：67的靶向序列；
(287)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：68具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(288)包含SEQ ID NO：67的氨基酸2-27的靶向序列；
(289)包含SEQ ID NO：67的氨基酸5-27的靶向序列；
(290)包含SEQ ID NO：67的氨基酸10-27的靶向序列；
(291)包含SEQ ID NO：69的氨基酸1-38的靶向序列；
(292)包含SEQ ID NO：69的氨基酸23-38的靶向序列；
(293)包含SEQ ID NO：69的靶向序列；
(294)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：70具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(295)包含SEQ ID NO：69的氨基酸2-38的靶向序列；
(296)包含SEQ ID NO：69的氨基酸5-38的靶向序列；
(297)包含SEQ ID NO：69的氨基酸10-38的靶向序列；
(298)包含SEQ ID NO：69的氨基酸15-38的靶向序列；
(299)包含SEQ ID NO：72的外孢壁蛋白；
(300)包含SEQ ID NO：73的靶向序列；
(301)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：74具有至少95％同一性的氨基酸序列；
(302)包含SEQ ID NO：75的氨基酸1-42的靶向序列；
(303)包含SEQ ID NO：75的氨基酸27-42的靶向序列；
(304)包含SEQ ID NO：75的靶向序列；
(305)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：76具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(306)包含SEQ ID NO：75的氨基酸2-42的靶向序列；
(307)包含SEQ ID NO：75的氨基酸5-42的靶向序列；
(308)包含SEQ ID NO：75的氨基酸10-42的靶向序列；
(309)包含SEQ ID NO：75的氨基酸15-42的靶向序列；
(310)包含SEQ ID NO：75的氨基酸20-42的靶向序列；
(311)包含SEQ ID NO：75的氨基酸25-42的靶向序列；
(312)包含SEQ ID NO：7的氨基酸1-24的靶向序列；
(313)包含SEQ ID NO：7的氨基酸9-24的靶向序列；
(314)包含SEQ ID NO：77的靶向序列；
(315)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：78具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(316)包含SEQ ID NO：7的氨基酸2-24的靶向序列；
(317)包含SEQ ID NO：7的氨基酸5-24的靶向序列；
(318)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：80具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(319)包含SEQ ID NO：81的氨基酸1-38的靶向序列；
(320)包含SEQ ID NO：81的氨基酸23-38的靶向序列；
(321)包含SEQ ID NO：81的靶向序列；
(322)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：82具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(323)包含SEQ ID NO：81的氨基酸2-38的靶向序列；
(324)包含SEQ ID NO：81的氨基酸5-38的靶向序列；
(325)包含SEQ ID NO：81的氨基酸10-38的靶向序列；
(326)包含SEQ ID NO：81的氨基酸15-38的靶向序列；
(327)包含SEQ ID NO：81的氨基酸20-38的靶向序列；
(328)包含SEQ ID NO：83的氨基酸1-34的靶向序列；
(329)包含SEQ ID NO：83的靶向序列；
(330)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：84具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(331)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：86具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(332)包含SEQ ID NO：87的氨基酸1-28的靶向序列；
(333)包含SEQ ID NO：87的氨基酸13-28的靶向序列；
(334)包含SEQ ID NO：87的靶向序列；
(335)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：88具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(336)包含SEQ ID NO：87的氨基酸2-28的靶向序列；
(337)包含SEQ ID NO：87的氨基酸5-28的靶向序列；
(338)包含SEQ ID NO：87的氨基酸10-28的靶向序列；
(339)包含SEQ ID NO：89的氨基酸1-28的靶向序列；
(340)包含SEQ ID NO：89的靶向序列；
(341)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：90具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(342)包含SEQ ID NO：89的氨基酸2-28的靶向序列；
(343)包含SEQ ID NO：89的氨基酸5-28的靶向序列；
(344)包含SEQ ID NO：89的氨基酸10-28的靶向序列；
(345)包含SEQ ID NO：91的氨基酸1-93的靶向序列；
(346)包含SEQ ID NO：91的靶向序列；
(347)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：92具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(348)包含SEQ ID NO：91的氨基酸2-93的靶向序列；
(349)包含SEQ ID NO：91的氨基酸10-93的靶向序列；
(350)包含SEQ ID NO：91的氨基酸20-93的靶向序列；
(351)包含SEQ ID NO：91的氨基酸30-93的靶向序列；
(352)包含SEQ ID NO：91的氨基酸40-93的靶向序列；
(353)包含SEQ ID NO：91的氨基酸50-93的靶向序列；
(354)包含SEQ ID NO：91的氨基酸60-93的靶向序列；
(355)包含SEQ ID NO：93的氨基酸1-130的靶向序列；
(356)包含SEQ ID NO：93的靶向序列；
(357)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：94具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(358)包含SEQ ID NO：93的氨基酸2-130的靶向序列；
(359)包含SEQ ID NO：93的氨基酸10-130的靶向序列；
(360)包含SEQ ID NO：93的氨基酸20-130的靶向序列；
(361)包含SEQ ID NO：93的氨基酸30-130的靶向序列；
(362)外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：122具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(363)由SEQ ID NO：1的氨基酸20-33组成的靶向序列；
(364)由SEQ ID NO：1的氨基酸21-33组成的靶向序列；
(365)由SEQ ID NO：1的氨基酸23-31组成的靶向序列；
(366)由SEQ ID NO：96的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(367)由SEQ ID NO：96的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(368)由SEQ ID NO：3的氨基酸12-25组成的靶向序列；
(369)由SEQ ID NO：3的氨基酸13-25组成的靶向序列；
(370)由SEQ ID NO：3的氨基酸15-23组成的靶向序列；
(371)由SEQ ID NO：97的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(372)由SEQ ID NO：98的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(373)由SEQ ID NO：5的氨基酸23-36组成的靶向序列；
(374)由SEQ ID NO：5的氨基酸23-34组成的靶向序列；
(375)由SEQ ID NO：5的氨基酸24-36组成的靶向序列；
(376)由SEQ ID NO：5的氨基酸26-34组成的靶向序列；
(377)由SEQ ID NO：7的氨基酸13-26组成的靶向序列；
(378)由SEQ ID NO：7的氨基酸13-24组成的靶向序列；
(379)由SEQ ID NO：7的氨基酸14-26组成的靶向序列；
(380)由SEQ ID NO：7的氨基酸16-24组成的靶向序列；
(381)由SEQ ID NO：9的氨基酸9-22组成的靶向序列；
(382)由SEQ ID NO：9的氨基酸9-20组成的靶向序列；
(383)由SEQ ID NO：9的氨基酸10-22组成的靶向序列；
(384)由SEQ ID NO：9的氨基酸12-20组成的靶向序列；
(385)由SEQ ID NO：105的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(386)由SEQ ID NO：105的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(387)由SEQ ID NO：11的氨基酸18-31组成的靶向序列；
(388)由SEQ ID NO：11的氨基酸18-29组成的靶向序列；
(389)由SEQ ID NO：11的氨基酸19-31组成的靶向序列；
(390)由SEQ ID NO：98的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(391)由SEQ ID NO：98的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(392)由SEQ ID NO：13的氨基酸18-31组成的靶向序列；
(393)由SEQ ID NO：13的氨基酸18-29组成的靶向序列；
(394)由SEQ ID NO：13的氨基酸19-31组成的靶向序列；
(395)由SEQ ID NO：13的氨基酸21-29组成的靶向序列；
(396)由SEQ ID NO：99的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(397)由SEQ ID NO：99的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(398)由SEQ ID NO：15的氨基酸28-41组成的靶向序列；
(399)由SEQ ID NO：15的氨基酸28-39组成的靶向序列；
(400)由SEQ ID NO：15的氨基酸29-41组成的靶向序列；
(401)由SEQ ID NO：15的氨基酸31-39组成的靶向序列；
(402)由SEQ ID NO：17的氨基酸12-25组成的靶向序列；
(403)由SEQ ID NO：17的氨基酸13-25组成的靶向序列；
(404)由SEQ ID NO：100的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(405)由SEQ ID NO：19的氨基酸18-31组成的靶向序列；
(406)由SEQ ID NO：19的氨基酸18-29组成的靶向序列；
(407)由SEQ ID NO：19的氨基酸19-31组成的靶向序列；
(408)由SEQ ID NO：19的氨基酸21-29组成的靶向序列；
(409)由SEQ ID NO：21的氨基酸18-31组成的靶向序列；
(410)由SEQ ID NO：21的氨基酸18-29组成的靶向序列；
(411)由SEQ ID NO：21的氨基酸19-31组成的靶向序列；
(412)由SEQ ID NO：21的氨基酸21-29组成的靶向序列；
(413)由SEQ ID NO：101的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(414)由SEQ ID NO：101的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(415)由SEQ ID NO：23的氨基酸9-22组成的靶向序列；
(416)由SEQ ID NO：23的氨基酸9-20组成的靶向序列；
(417)由SEQ ID NO：23的氨基酸10-22组成的靶向序列；
(418)由SEQ ID NO：23的氨基酸12-20组成的靶向序列；
(419)由SEQ ID NO：102的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(420)由SEQ ID NO：102的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(421)由SEQ ID NO：25的氨基酸9-22组成的靶向序列；
(422)由SEQ ID NO：25的氨基酸9-20组成的靶向序列；
(423)由SEQ ID NO：25的氨基酸10-22组成的靶向序列；
(424)由SEQ ID NO：25的氨基酸12-20组成的靶向序列；
(425)由SEQ ID NO：103的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(426)由SEQ ID NO：103的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(427)由SEQ ID NO：27的氨基酸15-28组成的靶向序列；
(428)由SEQ ID NO：27的氨基酸15-26组成的靶向序列；
(429)由SEQ ID NO：27的氨基酸16-28组成的靶向序列；
(430)由SEQ ID NO：27的氨基酸18-26组成的靶向序列；
(431)由SEQ ID NO：104的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(432)由SEQ ID NO：104的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(433)由SEQ ID NO：33的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(434)由SEQ ID NO：33的氨基酸1-11组成的靶向序列；
(435)由SEQ ID NO：33的氨基酸3-11组成的靶向序列；
(436)由SEQ ID NO：35的氨基酸1-14组成的靶向序列；
(437)由SEQ ID NO：35的氨基酸1-12组成的靶向序列；
(438)由SEQ ID NO：35的氨基酸2-14组成的靶向序列；
(439)由SEQ ID NO：43的氨基酸14-27组成的靶向序列；
(440)由SEQ ID NO：43的氨基酸14-25组成的靶向序列；
(441)由SEQ ID NO：43的氨基酸15-27组成的靶向序列；
(442)由SEQ ID NO：45的氨基酸20-33组成的靶向序列；
(443)由SEQ ID NO：45的氨基酸20-31组成的靶向序列；
(444)由SEQ ID NO：45的氨基酸21-33组成的靶向序列；
(445)由SEQ ID NO：106的氨基酸1-15组成的靶向序列；
(446)由SEQ ID NO：106的氨基酸1-13组成的靶向序列；
(447)由SEQ ID NO：47的氨基酸28-41组成的靶向序列；
(448)由SEQ ID NO：47的氨基酸28-39组成的靶向序列；
(449)由SEQ ID NO：53的氨基酸18-31组成的靶向序列；
(450)由SEQ ID NO：53的氨基酸18-29组成的靶向序列；
(451)由SEQ ID NO：53的氨基酸19-31组成的靶向序列；
(452)包含SEQ ID NO：61的氨基酸18-31的靶向序列；
(453)包含SEQ ID NO：61的氨基酸18-29的靶向序列；
(454)包含SEQ ID NO：61的氨基酸19-31的靶向序列；
(455)包含SEQ ID NO：65的氨基酸9-22的靶向序列；
(456)包含SEQ ID NO：65的氨基酸9-20的靶向序列；
(457)包含SEQ ID NO：65的氨基酸10-22的靶向序列；
(458)包含SEQ ID NO：107的氨基酸1-15的靶向序列；
(459)包含SEQ ID NO：107的氨基酸1-13的靶向序列；
(460)包含SEQ ID NO：67的氨基酸12-25的靶向序列；
(461)包含SEQ ID NO：67的氨基酸12-23的靶向序列；
(462)包含SEQ ID NO：67的氨基酸13-25的靶向序列；
(463)包含SEQ ID NO：67的氨基酸15-23的靶向序列；
(464)包含SEQ ID NO：69的氨基酸23-36的靶向序列；
(465)包含SEQ ID NO：69的氨基酸23-34的靶向序列；
(466)包含SEQ ID NO：69的氨基酸24-36的靶向序列；
(467)包含SEQ ID NO：69的氨基酸26-34的靶向序列；
(468)包含SEQ ID NO：75的氨基酸27-40的靶向序列；
(469)包含SEQ ID NO：75的氨基酸27-38的靶向序列；
(470)包含SEQ ID NO：77的氨基酸9-22的靶向序列；
(471)包含SEQ ID NO：77的氨基酸9-20的靶向序列；
(472)包含SEQ ID NO：77的氨基酸10-22的靶向序列；
(473)包含SEQ ID NO：77的氨基酸12-20的靶向序列；
(474)包含SEQ ID NO：81的氨基酸23-36的靶向序列；
(475)包含SEQ ID NO：81的氨基酸23-34的靶向序列；
(476)包含SEQ ID NO：81的氨基酸24-36的靶向序列；
(477)包含SEQ ID NO：81的氨基酸26-34的靶向序列；
(478)包含SEQ ID NO：87的氨基酸13-26的靶向序列；
(479)包含SEQ ID NO：87的氨基酸13-24的靶向序列；或
(480)包含SEQ ID NO：87的氨基酸14-26的靶向序列。
实施方式308是实施方式307的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中靶向序列包括：
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％；
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。
实施方式309是实施方式307的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中靶向序列由以下组成：
(a)由16个氨基酸组成的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸1-35；
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸20-35；
(d)SEQ ID NO：1；
(e)SEQ ID NO：96；或
(f)SEQ ID NO：120。
实施方式310是实施方式308的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中靶向序列由氨基酸序列组成。
实施方式311是实施方式307的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中融合蛋白包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121和122具有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
实施方式312是实施方式307的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中融合蛋白包含外孢壁蛋白，其包含与SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
实施方式313是实施方式1-18，25-28和307-312中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28，280和307-312中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-312中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-312中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-312中任一个的方法、实施方式162-166和281-312中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-312中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-312中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-312中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-312中任一个的昆虫喷雾器，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X是任何氨基酸。
实施方式314是实施方式1-18，25-28和307-313中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28，280和307-313中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-313中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-313中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-313中任一个的方法、实施方式162-166和281-313中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-313中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-313中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-313中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-313中任一个的昆虫喷雾器，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残基。
实施方式315是实施方式1-18，25-28和307-314中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28，280和307-314中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-314中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-314中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-314中任一个的方法、实施方式162-166和281-314中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-314中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-314中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-314中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-314中任一个的昆虫喷雾器，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段在紧接靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一个氨基酸的氨基酸位置处或对应于SEQ IDNO：1的氨基酸20的靶向序列的位置处进一步包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
实施方式316是实施方式1-18，25-28和307-315中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28，280和307-315中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-315中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-315中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-315中任一个的方法、实施方式162-166和281-315中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-315中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-315中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-315中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-315中任一个的昆虫喷雾器，其中融合蛋白还包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段和目标蛋白质或肽之间的氨基酸接头。
实施方式317是实施方式316的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中接头包含聚丙氨酸接头，聚甘氨酸接头或包含丙氨酸和甘氨酸残基两者的混合物的接头。
实施方式318是实施方式316或317的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中接头包含蛋白酶识别位点。
实施方式319是实施方式1-18，25-28和307-318中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28，280和307-318中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-318中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-318中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-318中任一个的方法、实施方式162-166和281-318中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-318中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-318中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-318中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-318中任一个的昆虫喷雾器，其中融合蛋白在孢子形成启动子的控制下表达，所述启动子对融合蛋白或其部分的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段是天然的。
实施方式320是实施方式1-18，25-28和307-318中任一个的融合蛋白、实施方式19，25-28，280和307-318中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-318中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-318中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-318中任一个的方法、实施方式162-166和281-318中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-318中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-318中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-318中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-318中任一个的昆虫喷雾器，其中融合蛋白在高表达孢子形成启动子的控制下表达。
实施方式321是实施方式320的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中高表达孢子形成启动子包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
实施方式322是实施方式319-321中任一个的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中孢子形成启动子包含与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的核酸序列具有至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性的核酸序列。
实施方式323是实施方式319-321中任一个的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中启动子包含与SEQ ID NO：37，38，41，42，149，150，175，180，181，185，189或190具有至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的核酸序列。
实施方式324是实施方式319-323中任一个的融合蛋白，重组蜡状芽孢杆菌家族成员，外孢壁片段，组合物，方法，粘合贴剂，伤口敷料，插入托盘，蹄绷带，饲料，饲料添加剂或昆虫喷雾器，其中σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列或序列与SEQ ID NO：37-42和123-191中任一个的相应核酸具有100％同一性。
实施方式325是实施方式019，25-28，280和307-324中任一个的重组蜡状芽孢杆菌家族成员、实施方式20，25-28，282-306和307-324中任一个的外孢壁片段、实施方式21-52，55-63，68-76，79-118，120-123，125-128，131-136，147-153，159-161，163-166，175，176，183-186，210-216，226，230-235，238-242，244-255，259-261，267，272，278和281-324中任一个的组合物、实施方式64-119，124-159，161，163-176，179，183-191，193-209，213-229，231-237，244-258，262-279和282-324中任一个的方法、实施方式162-166和281-324中任一个的粘合贴剂或伤口敷料，实施方式177，178，183-186和282-324中任一个的插入托盘、实施方式180-186和281-324中任一个的蹄绷带、实施方式192-196和282-324中任一个的饲料或饲料添加剂或实施方式243-255和281-324中任一个的昆虫喷雾器，其中重组蜡状芽孢杆菌家族成员包括炭疽芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，蕈状芽胞杆菌，假蕈状芽孢杆菌，撒氏芽孢杆菌，盖氏芽孢杆菌，韦氏芽孢杆菌，托氏芽孢杆菌或其任何组合。
Claims (23)
1.一种用于在水生动物中产生免疫原性应答的方法，其包括将外孢壁片段施用于所述水生动物，其中所述外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使所述融合蛋白靶向所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；其中所述水生动物选自鱼类、两栖动物、甲壳类动物、软体动物及其任何组合。
2.一种用于在水生动物中产生免疫原性应答的方法，其包括向所述水生动物施用：
外孢壁片段，其中所述外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使所述融合蛋白靶向所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，所述融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使所述融合蛋白靶向所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合；
并且其中通过将所述水生动物浸入包含所述外孢壁片段的溶液中以将所述外孢壁片段或孢子施用于所述水生动物。
3.一种用于在水生动物中产生免疫原性应答的方法，其包括向所述水生动物施用：
外孢壁片段到所述水生动物，其中所述外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使所述融合蛋白靶向所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，所述融合蛋白包含至少一种抗原或免疫原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使所述融合蛋白靶向所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁；
或其组合；
并且其中将所述外孢壁片段或孢子施用于所述水生动物导致所述水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌、鲁氏耶尔森菌、鮰爱德华菌、柱状黄杆菌、绿色气球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、毛霉亮发菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、希瓦氏菌属的细菌病原体、雕萎综合体、鲑鱼立克次氏体、水霉属的病原性原生生物、鲤鱼鳃霉菌、坏死鳃霉菌、鱼孢霉及其任何组合。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，通过将所述水生动物浸入包含所述外孢壁片段或孢子的溶液中，通过将所述外孢壁片段或孢子喂食给所述水生动物，通过将所述外孢壁或孢子片注射到所述水生动物中，或其任何组合，以将所述外孢壁片段或孢子施用于所述水生动物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述注射包括肌内注射。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，通过将所述水生动物浸入包含所述外孢壁片段、所述孢子或其组合的溶液中，以将所述外孢壁片段或孢子施用于所述水生动物。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将所述外孢壁片段或孢子施用于所述水生动物导致所述水生动物针对病原体接种，所述病原体选自鲑肾杆菌、鲁氏耶尔森菌、鮰爱德华菌、柱状黄杆菌、绿色气球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、毛霉亮发菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、希瓦氏菌属的细菌病原体、雕萎综合体、鲑鱼立克次氏体、水霉属的病原性原生生物、鲤鱼鳃霉菌、坏死鳃霉菌、鱼孢霉及其任何组合。
8.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述方法包括施用所述外孢壁片段。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述抗原或免疫原包含热休克蛋白、外壳蛋白、荚膜蛋白、外膜蛋白、细胞壁蛋白、鞭毛蛋白、菌毛蛋白、纤毛蛋白、睫状蛋白、蛋白质毒素、i抗原或其任何组合。
10.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述水生动物选自鱼类、两栖动物、爬行动物、甲壳类动物、软体动物或其任何组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水生动物包括鱼类，所述鱼类选自爱好鱼、鲑鱼、鳟鱼、大比目鱼、鲈鱼、鲷鱼、石斑鱼、鲻鱼、罗非鱼、金枪鱼、鲶鱼、鲤鱼、鲟鱼及其任何组合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水生动物包括甲壳类动物，所述甲壳类动物选自河虾、明虾、磷虾、龙虾、螃蟹、小龙虾及其任何组合。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述外孢壁片段或孢子以包含载体和所述外孢壁片段、所述孢子或其组合的组合物施用。
14.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和外孢壁片段，其中所述外孢壁片段来源于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子并包含融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一种免疫原或抗原以及靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其使所述融合蛋白靶向所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述抗原或免疫原来源于病原体，所述病原体选自鲑肾杆菌、鲁氏耶尔森菌、鮰爱德华菌、柱状黄杆菌、绿色气球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、毛霉亮发菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、希瓦氏菌属的细菌病原体、雕萎综合体、鲑鱼立克次氏体、水霉属的病原性原生生物、鲤鱼鳃霉菌、坏死鳃霉菌和鱼孢霉。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中，所述组合物是粉末或液体浓缩物的形式。
17.根据权利要求13所述的方法，其中，所述组合物还包含佐剂。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述外孢壁片段来源于表达所述融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子，其中所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员还包含突变或表达蛋白质，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中蛋白质的表达相比，所述蛋白质的表达增加，并且其中所述突变或所述蛋白质的表达增加导致蜡状芽孢杆菌家族成员孢子所具有的外孢壁与野生型孢子的外孢壁相比更容易从所述孢子中除去。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员：
(i)包含CotE基因的突变；
(ii)表达ExsY蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达相比，所述ExsY蛋白的表达增加，并且其中所述ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基末端标签；
(iii)表达BclB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中BclB蛋白的表达相比，所述BclB蛋白的表达增加；
(iv)表达YjcB蛋白，其中与在相同条件下野生型蜡状芽孢杆菌家族成员中YjcB蛋白的表达相比，所述YjcB蛋白的表达增加；
(v)包含ExsY基因的突变；
(vi)包含CotY基因的突变；
(vii)包含ExsA基因的突变；或
(viii)包含CotO基因的突变。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含CotE基因的突变。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述CotE基因的突变包括所述CotE基因的敲除。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员包含ExsY基因的突变。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述ExsY基因的突变包括所述ExsY基因的敲除。
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