CN112029684B

CN112029684B - 一种适用于水下工程混凝土修复的矿化菌及其应用

Info

Publication number: CN112029684B
Application number: CN202010909849.6A
Authority: CN
Inventors: 徐建妙; 泮佳佳; 郑裕国; 王远山; 程峰; 贾东旭
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN112029684A

Abstract

本发明公开了一种适用于水下工程混凝土修复的矿化菌及其应用，属于微生物修复技术领域。本发明提供了一株具备高效的不溶性钙转化能力的矿化菌‑假蕈状芽孢杆菌ZJB20023，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020268。在模拟淡水与海水水下工程环境中，菌株ZJB20023可有效修复混凝土微裂缝。而且在负载剂的作用下，菌株ZJB20023能够发挥更高的不溶性钙转化能力，应用到水下工程混凝土裂缝修复时可以实现快速自主修复混凝土微裂缝。因此，假蕈状芽孢杆菌ZJB20023具有作为生物修复制剂进行水下工程混凝土裂缝自修复的潜力和应用前景。

Description

一种适用于水下工程混凝土修复的矿化菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物修复技术领域，具体涉及一种高效矿化菌及其在水下工程混凝土裂缝修复中的应用。

背景技术

混凝土因其抗压性能和耐久性能优良而成为应用最广泛的建筑工程材料之一。然而，由于水化过程中温度变化引起的胀缩现象、地基施工质量存在差异导致的稳定性差、钢筋锈蚀、外力撞击、荷载过大等多种不利因素均会使混凝土建筑产生干缩裂缝、温度裂缝、变形裂缝以及接茬缝。

我国的水利电力工程，40％以上存在着各种各样的病害和老化问题。如长期在水下运行的输水洞工程，大多都出现裂缝、脱落和钢筋锈蚀等，严重影响着其服役年限，亟待进行修复加固来增强其安全性与稳定性。

目前进行裂缝修复的方法包括结构补强法、外观修补法、裂缝灌浆法等，虽在一定程度上能填补裂缝，但通过使用化学材料进行填补，在实施过程中暴露出工艺要求高、操作复杂、成本高昂、破坏混凝土结构和功能等缺点。尤其是对于水下工程来说，依靠人力进行的修复操作难以实现且安全保障较低。此外，水下工程长时间浸泡于水中，裂缝的存在会加速水分和氯离子的进入，加速对钢筋混凝土的腐蚀。因此，寻找一种安全、自我感知、自我调节的修复方式有利于延长水下工程的服役年限。

经过探究，Ramachandran等人提出的一种环境友好的自我感知、自我调节、自我修复的裂缝愈合方式成为目前的研究热点，即将用矿化微生物自身的新陈代谢形成碳酸根离子，在环境中存在钙离子的情况下，析出碳酸钙结晶的生物矿化机制去愈合混凝土的微裂缝。

相比于包括氰基丙烯酸酯，环氧基树脂，丙烯酸树脂，硅酸钠，聚氨酯等化学类愈合剂，通过微生物自身代谢活动诱导碳酸钙沉淀使裂缝愈合的生物类愈合剂与混凝土基质具有较好的相容性，加上其独特的原位修复特性促使以微生物的代谢作用产生碳酸钙沉淀从而使裂缝愈合成为更为经济环保的一种智能化方式，而混凝土微生物自修复材料成为建筑与生物交叉领域的新兴探究材料。

因此，寻找到在水下环境中具有高效矿化能力的菌株对促进混凝土微生物自修复材料的研发并进行工程应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在水下环境高效利用钙离子的矿化细菌，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石，用于修复水下工程混凝土微裂缝，为混凝土微生物自修复材料的开发提供新的理论依据和技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明从浙江省杭州市西湖区灵隐古寺山坡上的土样中分离得到具有高矿化能力的菌株ZJB20023，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，ZJB20023与已知菌株Bacilluspseudomycoidesstrain NBRC 101232聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.09％，从而确定了ZJB20023在分类上属于假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)，将其命名为假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)ZJB20023。

本发明提供了一种假蕈状芽孢杆菌ZJB20023，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏日期：2020年7月2日，保藏编号：CCTCC NO:M 2020268。

研究表明，本发明提供的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023对不溶性钙转化率达57.02％，具备优异的矿化能力。

本发明提供了所述的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023在混凝土裂缝修复中的应用。

进一步地，所述混凝土裂缝为水下工程的混凝土裂缝。本发明提供的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023无论在淡水环境还是海水环境均具备主动修复混凝土微裂缝的能力。

所述应用可以为在混凝土制备过程中直接将芽孢混入，当出现裂缝时，芽孢被激活快速萌发成营养体完成对混凝土裂缝的自修复。具体地：将假蕈状芽孢杆菌ZJB20023芽孢与包含钙盐和尿素的营养液混合得到菌体混合液，再将菌体混合液代替混凝土制备过程中的水，拌制后经标准养护得到自修复混凝土。所述自修复混凝土应用于水下工程。

优选的，所述菌体混合液中假蕈状芽孢杆菌ZJB20023芽孢的浓度为1×10⁷～1×10⁹cfu/mL。

所述营养液成分包括：酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素，浓度分别为1～2g/L，2～3g/L，20～21g/L和9.5～10.5g/L。优选的，所述营养液中酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素的浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。

进一步地，所述应用还包括：往菌剂混合液中加入负载剂，静置使菌体和营养物质负载到负载剂上，取出负载剂并烘干，重复若干次得到菌剂；在混凝土制备过程中，将剩余的菌剂混合液代替水，菌剂代替20％～30％的标准砂。

在负载剂的保护作用下，菌株ZJB20023在水下环境中能够更好地发挥自主修复裂缝的效能。优选的，所述负载剂为陶粒、珍珠岩或硅藻土。

本发明还提供了一种混凝土裂缝自修复生物制剂，包括所述的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023。

本发明的有益效果为：

本发明提供的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023具备高效的不溶性钙转化能力，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石。在模拟淡水与海水水下工程环境中，菌株ZJB20023可有效修复混凝土微裂缝。此外，在负载剂陶粒和珍珠岩的作用下，菌株ZJB20023能够发挥更高的不溶性钙转化能力，应用到水下工程混凝土裂缝修复时可以快速自主修复混凝土微裂缝。因此，菌株ZJB20023具有作为生物修复制剂进行水下工程混凝土裂缝自修复的潜力和应用前景。

附图说明

图1为实施例3中模拟淡水环境下菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图2为实施例3中模拟淡水环境下未添加菌的混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图3为实施例4中模拟海水环境下菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图4为实施例4中模拟海水环境下未添加菌的混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图5为实施例5中陶粒作为负载剂时对菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图6为实施例6中珍珠岩作为负载剂时对菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图7为实施例7中硅藻土作为负载剂时对菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

图8为对比例1中未添加负载剂时对菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中A图为修复前，B图为修复后。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中培养基配方如下：

高效不溶性钙转化能力矿化菌筛选培养基成分为：蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，尿素2g/L，氯化钙22g/L，葡萄糖0.1g/L，酚红溶液(0.2％)4ml/L，20g/L琼脂，pH值为7。其中，尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌。

种子液培养基成分为：蛋白胨5g、牛肉膏3g、葡萄糖5g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。

各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌20min。

实施例1

一、高效不溶性钙转化能力矿化菌经富集和筛选纯化分离获得，具体步骤如下：

1)土样处理：取浙江省杭州市西湖区灵隐古寺山坡上的土样1g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和100mL无菌水的锥形瓶中，30℃，200r/min震荡30min后静置10min，去除底部沉淀物，得到土壤悬浮液。将土壤悬浮液置于100℃水中进行沸水浴加热3-5min，得到土壤样品原液。

2)分离培养：在超净台中进行土壤样品原液的梯度稀释，浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，吸取200μL各浓度的菌悬液接种于高效不溶性钙转化能力矿化菌筛选培养基平板上，用封口膜将平板封口后倒置，放于37℃恒温培养箱中培养24h。

3)挑菌纯化：在菌落数合适的平板上，通过观察菌落边缘白色固体颗粒的聚集程度，取白色颗粒多的典型菌落在新鲜的种子液固体培养基平板上划线纯化3次。

4)保存：将纯化获得的菌体一份接种至种子液固体斜面培养基中，4℃保存；另一份于30％的甘油中保藏于-80℃；同时另一份进行生理生化和分子生物学鉴定。

经过上述筛选纯化方式共获得17株菌株(先后筛选到，并非一次性筛选获得)。

二、高效不溶性钙转化能力矿化菌的鉴定

1)分子生物学鉴定：用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，细菌通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，

1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。产物由擎科生物技术有限公司进行PCR产物测序，将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立系统发育树，确定筛选获得菌株的种属。

2)生理生化鉴定：利用Biolog(GENⅢ)自动鉴定系统测定碳源利用情况以及对化学物质的敏感性，进一步确定微生物的种属。

选择高效不溶性钙转化能力矿化菌筛选固体培养基上菌落边缘白色颗粒最多的单菌落按照上述方式进行菌种鉴定，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，该菌株与已知菌株Bacilluspseudomycoidesstrain NBRC 101232聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达98％，从而确定了ZJB20023在分类上属于假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。因此对该菌株进行命名并保藏，命名为假蕈状芽孢杆菌Bacillus pseudomycoidesZJB20023，2020年7月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2020268，于2020年7月17日检测存活。

实施例2

菌株ZJB20023的矿化活性

1)菌体的富集

将实施例1中提及的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023与三株对照菌在种子液固体培养基平板上用接种环划线，37℃倒置培养12小时。用灼烧灭菌的接种环挑平板表面菌落接种于种子液培养液，培养液盛于容积为250ml的锥形瓶中，每瓶培养液体积为50ml，将接种过的锥形瓶置于恒温震荡培养箱中，37℃，150rpm培养12小时，之后进行培养体系扩大培养进行菌体的富集。将这种含有大量菌体的发酵液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后倾倒舍弃上清液，并向菌体沉淀中加去离子水震荡重悬芽孢，再次离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，重复以上操作洗涤菌体8-10次。菌体沉淀置于4℃冰箱保存备用。

2)玻璃反应器的清洗

选择容积为500ml的锥形瓶作为检测不同菌株矿化活性的培养容器，用于检测不同菌株的合成碳酸钙的能力。将玻璃试管置于2％稀盐酸中浸泡过夜，之后依次用自来水、去离子水分别冲洗4次和2次，将玻璃试管置于鼓风式烘干箱中烘干；将烘干后的玻璃试管浸没于95％乙醇中浸泡过夜，后用去离子水冲洗4次；将玻璃试管浸没于双氧水/浓硝酸洗液中浸泡过夜，该洗液为水、30％双氧水、65％浓硝酸以体积比1:1:1混合均匀；将玻璃试管取出，依次用自来水、去离子水分别冲洗4次和2次。用高压蒸汽灭菌锅于121℃灭菌20min，备用。

3)不溶性钙转化反应液的制备

1.2g尿素、2.2g氯化钙和100ml蒸馏水，混合完全溶解，用高压蒸汽灭菌锅于121℃灭菌20min，备用。

4)菌株不溶性钙转化能力的检测

采用灭菌的种子液培养基制备菌体悬浮液，并利用血球计数板检测悬浮液浓度，制备浓度约为1×10⁸个/ml的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023悬浮液。三株对照菌株悬浮液制备方式同上所述。上述锥形瓶中，每瓶加入50ml已灭菌的反应液、500μL浓度约为1×10⁸个/ml的菌体悬浮液和转子，同时设置反应液对照组(不添加菌株)，4个平行；将玻璃锥形瓶置于恒温水浴锅并设置转速为150rpm，37℃培养9小时。将9小时后的反应液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后倾倒舍弃上清液，并向菌体沉淀中加去离子水震荡沉淀物，再次离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，重复以上操作洗涤沉淀物8-10次。向沉淀物中加入过量浓度为1M的稀盐酸，稀盐酸与沉淀物中的碳酸钙反应形成可溶性钙离子。静置10分钟，随后继续添加稀盐酸至离心管中，反复颠倒，直至不产生气泡为止。再将离心管中的溶液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后保留上清液弃去沉淀。向上清液中加入稀盐酸体积一半的浓度为1M的碳酸钠溶液，碳酸钠与上清液中的可溶性钙离子反应形成不溶性碳酸钙。静置10分钟，随后继续添加碳酸钠溶液至离心管中，直至不产生沉淀为止。再将离心管中的溶液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后弃去上清液。将离心后得到的沉淀物置于鼓风式烘干箱中烘干，对其进行称重。结果如表1所示。

实验发现，反应液对照组无沉淀形成，与对照菌株相比，本发明自主筛选的矿化菌——假蕈状芽孢杆菌ZJB20023形成的碳酸钙最多，高达1.13g，不溶性钙转化率达57.02％。

表1不同菌株不溶性钙转化能力

菌株	碳酸钙干重(g)	不溶性钙转化率
			假蕈状芽孢杆菌	1.13	57.02％
嗜碱芽孢杆菌(对照菌1)	0.57	28.76％
			枯草芽孢杆菌(对照菌2)	0.26	13.12％
耐盐芽孢杆菌(对照菌3)	0.35	17.66％
			反应液对照组	0	0

实施例3

菌株ZJB20023芽孢主动修复混凝土微裂缝

分别称量离心的菌体芽孢(菌浓为4×10⁷cfu/ml)与混合营养成分混合均匀得到菌剂。其中所述的营养液成分为：酵母提取物，肌苷，乳酸钙和尿素，浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。

按照标准程序，将菌剂代替混凝土试件制备过程中的水，通过自制的裂缝压制法制备含有0.1-0.5mm微裂缝的标准混凝土试件，并用保鲜膜包裹好后静置于水中进行水化养护以达到模拟淡水下工程混凝土的目的，4个平行；同时设置对照组(不添加菌体)。

养护3天后，利用读数显微镜观察微裂缝愈合情况，结果如图1和图2所示。

结果显示，对照组的预制裂缝为0.25mm但未愈合，而菌株ZJB20023可以自主修复0.3-0.45mm之间的微裂缝，表明菌株ZJB20023具备在淡水下环境中主动修复混凝土微裂缝的能力。

实施例4

本实施例在实施例3的基础上，将水化养护的水替换成质量百分比浓度为1％的NaCl溶液，其他同实施例3，模拟海水下工程混凝土裂缝自修复。结果如图3和图4所示。

结果显示，对照组裂缝为0.25mm但未愈合，而菌株ZJB20023可以自主修复0.3-0.45mm之间的微裂缝，表明菌株ZJB20023具备在海水下环境中主动修复混凝土微裂缝的能力。

实施例5

菌株ZJB20023混凝土裂缝生物制剂的最优负载剂与负载方式的选择

为加强菌株ZJB20023在水下工程混凝土中的裂缝修复能力，选择不同的负载剂对菌株进行保护，并负载营养物质实现混凝土裂缝的高效修复效能。其具体操作如下：

分别称量离心的菌体芽孢(菌浓为4×10⁷cfu/ml)与混合营养成分混合均匀，其中所述的营养液成分为：酵母提取物，肌苷，乳酸钙和尿素，浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。采用浸烘循环法将菌体和营养物质负载至负载剂陶粒上。其具体实施步骤为：往菌体-营养物质混合液中加入称量好的负载剂陶粒，静置吸附2h，随后取出负载剂并置于37℃的培养间中烘干，随后再将吸附一部分菌体与营养物质的陶粒放回混合液中再次静置吸附15min并烘干，重复上述操作得到菌剂。

按照标准程序，将剩余混合液代替部分混凝土试件制备过程中的水，菌剂代替30％的标准砂，并通过自制的裂缝压制法制备含有0.1-0.5mm微裂缝的标准混凝土试件，并用保鲜膜包裹好后静置于水中进行水化养护以达到模拟水下工程混凝土的目的，4个平行。

水化养护2天后，利用读数显微镜观察微裂缝愈合情况，结果如图5和表2所示。

实施例6

本实施例采用珍珠岩作为负载剂，其他同实施例5，结果如图6和表2所示。

实施例7

本实施例采用硅藻土作为负载剂，其他同实施例5，结果如图7和表2所示。

对比例1

本对比例采用未添加负载剂的菌剂，其他同实施例5，结果如图8和表2所示。

表2

如表2所示，本发明提出的菌株ZJB20023的自主修复效果较好，且大大降低裂缝的渗水能力，且实施例5为最佳实施例。

图5-图8显示不同负载剂的保护作用下，菌株ZJB20023在水下环境中自主修复裂缝的效能不同，在陶粒与珍珠岩的负载下，菌株ZJB20023主动修复混凝土微裂缝的能力最强，硅藻土的效能略差，但优于空白不加负载剂的组别。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种适用于水下工程混凝土修复的矿化菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> 假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)

<400> 1

aggcggctgg ctccataaag gttaccccac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg 60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120

actagcgatt ccagcttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaacggtt 180

ttatgagatt agctccacct cgcggtcttg cagctctttg taccgtccat tgtagcacgt 240

gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300

gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac ttaatgatgg caactaagat caagggttgc 360

gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420

ctgtcactct gctcccgaag gagaagccct atctctaggg ttttcagagg atgtcaagac 480

ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg 600

cgttaacttc agcactaaag ggcggaaacc ctctaacact tagcactcat cgtttacggc 660

gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgcgcct cagtgtcagt 720

tacagaccag aaagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca tatctctacg catttcaccg 780

ctacacatgg aattccactt tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc caatgaccct 840

ccacggttga gccgtgggct ttcacatcag acttaagaaa ccacctgcgc gcgctttacg 900

cccaataatt ccggataacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960

agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtgccagct tattcaacta gcacttgttc 1020

ttccctaaca acagagtttt acgacccgaa agccttcatc actcacgcgg cgttgctccg 1080

tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg 1140

tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg ttgccttggt 1200

gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg acgcgggtcc atccataagt gacagccgaa 1260

gccgcctttc aatttcgaac catgcagttc aaaatattat ccggtattag ccccggtttc 1320

ccggagttat cccagtctta tgggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta 1380

acttcttgag agcaagctct caatccattc gctcgactgc atgtatag 1428

Claims

1.一种假蕈状芽孢杆菌ZJB20023，其特征在于，该菌株的保藏号为CCTCC NO:M2020268。

2.如权利要求1所述的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023在混凝土裂缝修复中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述混凝土裂缝为水下工程的混凝土裂缝。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：将假蕈状芽孢杆菌ZJB20023芽孢与包含钙盐和尿素的营养液混合得到菌体混合液，再将菌体混合液代替混凝土制备过程中的水，拌制后经标准养护得到自修复混凝土。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌体混合液中假蕈状芽孢杆菌ZJB20023芽孢的浓度为1×10⁷～1×10⁹cfu/mL。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述营养液成分包括：酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素，浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括：往菌体混合液中加入负载剂，静置使菌体和营养物质负载到负载剂上，取出负载剂并烘干，重复若干次得到菌剂；在混凝土制备过程中，将剩余的菌体混合液代替水，菌剂代替20％～30％的标准砂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述负载剂为陶粒、珍珠岩或硅藻土。

9.一种混凝土裂缝自修复生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的假蕈状芽孢杆菌ZJB20023。