CN110527648A - 低氮依赖性高效钙矿化芽孢杆菌及在混凝土修复上的应用 - Google Patents

低氮依赖性高效钙矿化芽孢杆菌及在混凝土修复上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明为低氮依赖性高效钙矿化芽孢杆菌及在混凝土修复上的应用，该高效钙矿化芽孢杆菌菌株拉丁名为Bacillus sp.B8，经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，于2019年7月17日在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC NO.18239；该菌在氮源浓度低至0.5g/L条件下仍然拥有高效钙离子沉积活性，在初始细胞浓度为1×108个/ml时，经过30天培养，在玻璃试管壁上形成碳酸钙产量高达38mmol/L，在强碱性环境中具有良好的繁殖能力和诱导碳酸钙沉积的能力，可用于混凝土裂缝的修复。

Description

低氮依赖性高效钙矿化芽孢杆菌及在混凝土修复上的应用
[技术领域]
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其在混凝土修复上的应用。
[背景技术]
作为目前全球范围内使用量最大的一种土木工程材料，混凝土因其结构牢固、耐久性强、原料丰富、价格低廉等特点被广泛应用于现代建筑工程。然而，随着使用年限的增加及各种环境条件，如大气、水等物理或化学侵蚀作用的影响，混凝土表层及内部会开始出现微裂缝。如果不及时采取有效处理措施，一旦裂缝扩大将腐蚀其内部钢筋结构，导致混凝土完整性破坏，耐久性能随之减弱(钢筋混凝土的环境侵蚀)。然而，有学者发现，自然界中某些微生物具有在细胞外沉积碳酸钙(方解石的主要组成成分)的能力，这一现象的发现为利用微生物修复混凝土裂缝的设想提供了理论依据。
利用矿化微生物修复混凝土裂缝具有修复效果好、处理费用低、无二次污染等特点，但该修复技术的关键之一是获得高效钙离子矿化细菌。深圳大学专利《一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用》公开了一株分离自红树林的嗜碱性芽孢杆菌Bacillus sp.H4在96孔板浅层培养条件下在诸多菌株中具有最佳的矿化能力。深圳大学专利申请号：CN201711329223.2《一株需氧型高效钙矿化芽孢杆菌及在混凝土修复上的应用》公开了一株在过氧化钙供氧条件下具有高矿化活性的菌株Bacillus sp.B6。然而，这两种细菌的高矿化活性都依赖较高的氮源浓度(如硝酸钠，2g/L)。在混凝土中如果提供大量氮源，氮源一旦释放入环境中，会增加水体氮浓度，危害环境健康和生态安全，所以有必要筛选能够适应低氮并在低氮条件下具有高效矿化活性的菌株。
[发明内容]
本发明目的是提供一种在低氮源浓度条件下能够高效进行钙离子矿化的芽孢杆菌及其用途。
本发明的高效钙矿化芽孢杆菌，其分类命名为：芽孢杆菌，拉丁名：Bacillussp.B8，已于2019年7月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号为：CGMCCNO.18239，碳酸钙产量Y30指在氮源浓度0.5g/L和细胞浓度为1×108个/ml条件下，经过30天培养，细菌将钙离子转化为碳酸钙的产量，上述菌株的矿化作用在20-37℃、pH 9.0-11.0下进行，碳酸钙产量Y30高达38mmol/L。
其16S rRNA基因核苷酸序列如本发明提供的序列表所示，该序列已上传NCBI，genebank登录号为MN173344。
上述菌株菌落特征如下：菌落边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，形成芽孢，运动；革兰氏染色阳性。
本发明的一个方面，提供该高效钙矿化芽孢杆菌的应用，使用上述矿化菌株Bacillus sp.B8促进钙离子沉积为碳酸钙，用于修复混凝土裂缝。
进一步地，所述钙离子沉积在20-40℃、pH 9.0-11.0下进行。
本发明中的芽孢杆菌B8为嗜碱芽孢杆菌，且该菌种能够在低氮源浓度下对钙离子进行高效转化为碳酸钙。
[附图说明]
图1为不同的21种菌株在低氮条件下钙矿化产量的比较图。
[具体实施方式]
以下将结合附图对本发明所涉及菌株的获取过程及菌株特点进行详细描述。
芽孢杆菌B8的分离、纯化及保存
所述钙离子矿化菌经富集和筛选纯化分离获得，具体步骤如下：
富集培养：将盐碱湖沉积物和红树林沉积物土样各1g分别加入到无氮LN-海水-碳酸钠培养液中，于30℃、150rpm摇床上振荡培养7天。
分离培养：吸取200μL富集培养液加于无氮LN-海水-碳酸钠固体培养基平板表面，用无菌涂布棒涂布均匀，接着用该涂布棒继续涂布3个无氮LN-海水-碳酸钠固体培养基平板，于30℃恒温培养箱中倒置培养14天。
挑菌纯化：用接种环挑无氮LN-海水-碳酸钠固体培养基平板生长的菌落在新鲜的无氮LN-海水-碳酸钠固体培养基平板上划线纯化3次。
保存：将纯化获得的菌体一份接种于LN-海水-碳酸钠固体斜面培养基中，4℃保存；同时另一份于15％甘油中保存于-80℃。
所述无氮LN-海水-碳酸钠培养基配方如下表：
A液和B液分开单独灭菌，灭菌后在超净工作台内无菌条件下将二者混匀即为无氮LN-海水-碳酸钠培养基。
所述微量元素的配方是ZnSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.03g，H3BO30.3g，CoCl2·6H2O0.2g，CuCl2·2H2O 0.01g,NiCl2·6H2O 0.02g,Na2MoO4·2H2O 0.03g，硫酸亚铁2g，水1000mL。
芽孢杆菌B8的鉴定
通过16S rDNA序列分析，确定菌株B8为芽孢杆菌。具体步骤如下：
采用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(宝生物工程有限公司)提取菌株DNA。选用细菌的16S rDNA通用引物由英潍捷基公司合成：
27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
扩增反应体系：
PCR反应程序如下：
采用试剂盒TaKaRa MiniBest DNAFragment Purification Kit Ver 3.0(宝生物工程有限公司)对PCR产物进行纯化，之后采用solution I将PCR产物与载体T-VectorpMDTM19(宝生物工程有限公司)连接并转化E.coli DH5a感受态细胞(宝生物工程有限公司)，通过蓝白斑筛选获得白色菌落送英潍捷基公司进行测序，测序结果在网站eztaxon-e.ezbiocloud.net核酸序列数据库中进行同源序列比较，与B8菌株16S rDNA序列同源性最高的模式菌株为Bacillusakibai 1139(T)，相似性为98.1％，确定B8为芽孢杆菌。
基于测序结果，该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已于2019年7月17日保藏在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号为：CGMCC NO.18239。其分类属于芽孢杆菌属，拉丁属名：Bacillus。
菌株B8优异的矿化活性
1)芽孢的制备。采用深圳大学专利《用于混凝土裂缝修复的三元微生物修复制剂及其制备方法》所公开的三元微生物制剂制备方法，对本专利实施例一所获得的18株嗜碱芽孢杆菌和3株对照菌(Bacillus cohnii DSM6307，Bacillus pseudofirmus DSM 8715，Bacillus pseudofirmus B1001)的钙离子矿化制备三元微生物制剂，并在该专利公开的矿化活性检测方法基础上进行改进，即将原CPM培养基中硝酸钠浓度降低至0.5g/L，称为低氮CPM培养基，检测上述21株细菌的矿化活性进行检测。
将上述若干菌株在碱性LB固体培养基平板上用接种环划线，30℃倒置培养16-20小时。用灼烧灭菌的接种环挑平板表面菌落接种于碱性LB培养液，培养液盛于容积为250ml的三角瓶中，每瓶培养液体积为50ml，将接种过的三角瓶置于恒温震荡培养箱中，30℃，150rpm培养16-20小时，之后用10ml微量移液器吸取8ml这种含有大量细菌的发酵液，加入MMN-1促芽孢形成培养液，该MMN-1培养液盛于容积为500ml的三角瓶中，每瓶培养液体积为100ml，将接种过的三角瓶置于恒温震荡培养箱中，30℃，150rpm培养5-7天，之后将这种含有大量芽孢的发酵液进行离心，离心转速为6000×g，离心时间为10分钟，离心后倾倒舍弃上清液，并向芽孢沉淀中加去离子水震荡重悬芽孢，再次离心，离心转速为6000×g，离心时间为10分钟，重复以上操作洗涤芽孢8-10次。芽孢沉淀置于4度冰箱保存备用。
本实施例所用碱性LB固体培养基的组成和制备方法如下：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠5.3g/L，碳酸氢钠4.2g/L，琼脂粉15g/L；按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉溶解于270ml水中；称量碳酸钠和碳酸氢钠溶解于30ml水中；两种溶液灭菌后于无菌超净工作台中趁热混匀，并倒入直径9cm的一次性无菌塑料培养皿中，每个培养皿20ml左右，冷却10-20分钟，待培养基凝固即可。
本实施例所用碱性LB培养液的组成和制备方法如下：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠5.3g/L，碳酸氢钠4.2g/L；按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中；两种溶液灭菌后于无菌超净工作台中混匀，分装于灭菌的250ml三角瓶中，每瓶50ml。
本实施例所用MMN培养基组分和制备方法如下，淀粉1g/L，酵母粉2g/L，硝酸钾3.75mM，氯化铵3.7mM，磷酸二氢钾0.15mM，氯化钙1.53mM，氯化钾2.68mM，氯化镁1mM，乳酸钠10mM，碳酸钠50mM，碳酸氢钠50mM。按以上浓度称量碳酸钠和碳酸氢钠溶解于100ml去离子水中，分装于15ml离心管中，每管10ml；称量其它成分溶解于900ml去离子水中，分装于500ml三角瓶中，每瓶90ml；灭菌后，取装有10ml的碳酸钠-碳酸氢钠溶液的离心管，将溶液倒入上述盛有90ml培养液的三角瓶中，每个三角瓶中加1个离心管碳酸钠-碳酸氢钠溶液，混匀即可。
2)释氧片剂制备。取过氧化钙粉、乳酸粉分别用研钵研磨，用100目的筛网过筛，收集漏过网眼的粉末备用。以9:1质量比将已过筛的过氧化钙粉与乳酸粉混合搅拌均匀，称为释氧剂粉。将凹模放在垫模上，称量释氧剂粉20mg加入压片机凹模的孔中，将盛有粉末的凹模和垫模放在压片机模托上，用力按压压片机杠杆使冲头进入凹模的孔中，将粉末压实并在模具中成片，取下凹模，将垫模翻转反面朝上放置于模托上，垫模背面的孔朝上，再将凹模放于垫模的孔上，再次用力按压压片机杠杆使冲头进入凹模的孔中，将片推出，片掉进垫模的孔中，将片放于干燥的棕色离心管中，放于4℃冰箱保存备用，该片称为释氧片剂。
3)玻璃试管的清洗。选择内径为7mm，外径为8.5mm，长度为12cm的玻璃试管作为检测由不同菌株制备的三元微生物片剂的培养容器，用于检测不同菌株的合成碳酸钙的能力。将玻璃试管置于2％稀盐酸中浸泡过夜，之后依次用自来水、去离子水分别冲洗4次和2次，将玻璃试管置于鼓风式烘干箱中烘干；将烘干后的玻璃试管浸没于95％乙醇中浸泡过夜，后用去离子水冲洗4次；将玻璃试管浸没于双氧水/浓硝酸洗液中浸泡过夜，该洗液为水、30％双氧水、65％浓硝酸以体积比1:1:1混合均匀；将玻璃试管取出，依次用自来水、去离子水分别冲洗4次和2次。用高压蒸汽灭菌锅于121℃灭菌20min，备用。
4)菌株不溶性钙转化能力的检测。采用灭菌的低氮CPM培养液配制芽孢悬浮液，并利用Helber细菌计数板和相差显微镜检测悬浮液浓度，制备浓度约为1×109个/ml的B8芽孢悬浮液。上述玻璃试管，每管加入1.8ml已灭菌的低氮CPM培养液和200μL浓度约为1×109个/ml的B8芽孢悬浮液，加入1个释氧片剂，向以上玻璃试管中加入已灭菌石蜡油500微升，4个平行；将玻璃试管置于96深孔板的孔中，保持竖直放置并放入恒温培养箱中，30℃培养30天。取一支带有标准配套针头的2ml注射器，将针头插入玻璃试管中石蜡油液面以下，拉动注射器活塞吸净石蜡油，再将玻璃试管中的培养液倒出。用20cm长的注射器针头插入玻璃试管底部，将粘附在底部的过氧化钙捣碎，再用去离子水冲洗玻璃试管内壁4-6次，通过洗涤去除捣碎的过氧化钙和残留的低氮CPM培养液成分。向玻璃试管中加入2ml浓度为1M的稀盐酸，稀盐酸与玻璃管内壁上形成的碳酸钙反应形成可溶性钙离子。用保鲜膜给玻璃管封口，静置1-2小时，再将玻璃管中的稀盐酸溶液倒入2ml离心管中，盖紧盖子，反复颠倒离心管，混匀备用。
将上述2ml离心管中的稀盐酸溶液稀释2-20倍，用量程为10μL的多通道移液枪吸取3.75μL上清液加入另一个新的透明微孔板中，用量程为300μL的多通道移液枪向加有待测样品的孔中加入300μL钙离子显色应用液，以1M盐酸溶液做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，根据标准曲线和稀释倍数计算不同玻璃管中不溶性钙的含量。
实验发现，如图1所示，21种菌株通过以上步骤检测，在玻璃试管壁上形成的碳酸钙含量结果见图1，培养30天后，与其它菌株相比，菌株B8在玻璃试管壁上形成的碳酸钙最多，高达38mmol/L。
上述显色应用液的配制：临用前，根据所需用量多少，将邻-甲酚酞络合酮(OCPC)显色剂与2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液等体积混合。混合后，吸取300μL显色应用液加入透明微孔板孔中，用酶标仪检测检测其对波长575nm光的光吸收值，若OD575在0.3以下，则表示该溶液合格，可以使用。
上述邻-甲酚酞络合酮(OCPC)显色剂的配制：称取8-羟基喹啉500mg置烧杯中，加浓盐酸5000μL，使其溶解并转入500ml容量瓶中，再加入邻-甲酚酞络合酮25mg，待完全溶解后，加1mL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)混匀，然后加去离子水至500ml，置聚乙烯瓶内4℃保存。
上述2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)碱性缓冲液的配制：于1L容量瓶中置去离子水500mL，加入AMP 89.14g，待完全溶解后加水至1L，置聚乙烯瓶中4℃保存。
标准曲线的制作：用1M稀盐酸在100mL容量瓶定容稀释钙原子光谱分析标准浓缩液(钙原子光谱分析标准浓缩液1.00g Ca，sigma公司产品)至10g/L(250mM)分装后于-20℃保存备用。用1M盐酸溶液配制梯度浓度钙离子溶液：0.25mM，0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM。用10μL的多通道移液枪吸取3.75μL各浓度钙离子溶液加入透明微孔板中，每个浓度加3个孔，用300μL的多通道移液枪向加有梯度浓度钙离子溶液的孔中加入300μL钙离子显色应用液混匀，以1M盐酸溶液做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，以钙离子浓度为横坐标，OD575值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的二元拟合方程为：y＝0.1009x-0.0006，R2＝0.9992。
上述低氮CPM培养基的组分和制备方法如下，硝酸钠0.1-0.5g/L，乳酸钠1-10g/L，磷酸二氢钾0.01-0.02g/L，氯化镁0.05--0.1g/L，CAPS 16-23g/L，氯化钠5-30g/L，硫酸钠3-4g/L，氯化钾0.677g/L，溴化钾0.05-0.15g/L，硼酸0.02-0.03g/L，氟化钠0.002-0.003g/L，氯化钙1-1.3g/L，氯化锶0.01-0.02g/L，去离子水1L，CAPS 11-22.13g/L，pH＝9.6-10.5，115-121℃高压湿热灭菌15-30min。配制方法：按照以上浓度称量氯化钙、氯化锶和氯化镁溶解于100-200ml水中；称量CAPS溶解于120-130ml水中，用6M氢氧化钠溶液将其pH调整至9.6-10.5；其他成分溶解于700-800ml水中；将以上3种溶液灭菌后在无菌超净工作台中混匀备用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施方式，凡是属于本发明原理的技术方案均属于本发明的保护范围。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理的前提下进行的若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一株需氧型高效钙矿化芽孢杆菌及在混凝土修复上的应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌种（Bacillus sp. B8）
<400> 1
caccccaatc atctgtccca ccttaggcgg ctaactcccg taagggttac cccaccgact 60
tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt 120
caccgcggca tgctgatccg cgattactag caattccggc ttcatgtagg cgagttgcag 180
cctacaatcc gaactgagaa tggctttatg agattggctc gacctcgcgg ttttgctgct 240
ctttgtacca tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga 300
cgtcgtcccc accttcctcc ggtttatcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactaaat 360
gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca 420
cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actttgtccc ccgaagggga aagtcctatc 480
tctagggttg tcaaaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa 540
ccacatgctc cactgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt 600
cgtactcccc aggcggagtg cttaatgtgt taacttcggc actaagggca tcgaaacccc 660
taacacctag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc 720
cccacgcttt cgcgcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt 780
tcctccacat atctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgtac 840
tcaagtctcc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact 900
taaaagaccg cctgcgcgcg ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg 960
tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt 1020
gccgccctat ttgaacgaca cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg aaccgaaatc 1080
cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac 1140
tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc 1200
aggtcggcta cgcatcgtcg ccttggtaag ccgttacctt accaactagc taatgcgccg 1260
cgggcccatc ccgtagtgat agccggagcc agcttttatt ctaagatcag gaggtctcag 1320
aaattatccg gtattagcac cgatttctcg atgttatccc gatctacagg gcaggttgcc 1380
cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaact tacgggagca agctcccatt ggttcgctcg 1440
acttgcatgt attaggcacg ccgccagcgt tcgtc 1475

Claims (3)

1.低氮依赖性高效钙矿化芽孢杆菌，其特征在于：芽孢杆菌菌株命名为Bacillussp.B8，该芽孢杆菌菌株能够在强碱性条件下高效地促进钙离子形成碳酸钙，菌种保藏编号为CGMCC NO.18239，2019年7月17日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，碳酸钙产量Y30是指在氮源浓度低至0.5g/L时，初始细胞浓度为1×108个/ml条件下，经过30天培养，细菌将钙离子转化为碳酸钙的产量，所述矿化菌株的矿化作用在20-37℃、pH 8.0-11.0下进行，碳酸钙产量Y30高达38mmol/L。
2.根据权利要求1所述高效钙矿化芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌菌株菌落特征为，边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，形成芽孢，运动；革兰氏染色阳性。
3.一种高效钙矿化芽孢杆菌的应用，其特征在于，使用如权利要求1的芽孢杆菌菌株Bacillus sp.B8促进钙离子沉积为碳酸钙，用于修复混凝土裂缝。
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