CN104403959B - 一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用，该芽孢杆菌芽孢杆菌H4已于2014年9月1日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心((简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC NO.9629。其分类命名为：芽孢杆菌，拉丁名：Bacillus sp.H4。本发明中的芽孢杆菌H4是一种常见的嗜碱芽孢杆菌，且该菌种能够在低细胞浓度下对钙离子进行转化。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用。
背景技术
混凝土因其具有牢固结实、耐久性高、价格相对低廉等特点成为应用最广泛的建筑材料。随着现代混凝土技术与我国经济的快速持续的发展，混凝土被广泛应用于港口、大坝、公路、桥梁、市政等现代化工程建设中。然而，钢筋混凝土结构由于受到物理、化学和生物等因素的综合作用，即使结构设计合理、施工正确，随着使用年限的增加，几乎所有混凝土建筑都会不可避免地出现微裂缝，其耐久性也随之受到影响而降低。如果不及时采取有效处理措施，裂缝可能会进一步扩大，使得水、氧气、二氧化碳及氯化物等有害物质更容易进入，从而造成材料由内至外的逐步劣化，最终导致混凝土内部的钢筋结构的腐蚀，使得整体结构往往未达到预期寿命而破坏，由此导致修补、维护等问题亦日益突出。
混凝土修复的方法主要分为化学法、物理法和生物法三大类。传统的物理和化学修复方法在一定程度上能有效修复微裂缝，但仍存在修复时间长、效果不佳、修复过程难以调控等诸多问题。近年来，利用微生物的矿化活性对混凝土裂缝进行修复逐渐成为新的研究热点。在碱性条件下,微生物细胞的细胞壁包含大量诸如羧基、羟基、磷酸根等官能团使得表层呈现负电荷，对溶液中的金属阳离子表现出极强的静电亲和力,细胞及细胞外聚物(EPS)充当晶体异相成核界面并螯合阳离子(如Ca2+、Mg2+等),有效降低晶体成核临界表层自由能,诱导晶体成核、生长及聚集。将抗逆性微生物休眠体(如芽孢)，固定或包覆于诸如硅藻土、粘土陶粒、硅胶及微胶囊等载体中并与营养物质一起掺入混凝土，一旦裂缝形成，水和空气进入裂缝诱导芽孢萌发形成营养细胞，活跃的细胞代谢利用营养物质产生二氧化碳并进一步形成碳酸根，碳酸根在细胞表面或胞外多聚物诱导作用下与钙离子形成碳酸钙。微生物诱导的碳酸钙形成已被证明能有效愈合混凝土裂缝、降低混凝土渗透性，强化混凝土强度，延缓钢筋锈蚀，提高混凝土的耐久性。相比传统混凝土修复技术而言，利用生物本身具有的矿化性能实现对混凝土的修复无疑是一种环境友好型的修复技术。
利用矿化微生物修复混凝土裂缝具有修复效果好、处理费用低、无二次污染等特点，但该修复技术的关键之一是获得高效钙离子矿化细菌。现在国内外学者已经逐步开始对微生物的混凝土裂缝修复活性进行研究和流程设计，但是迄今为止大多数研究所采用的菌株都是直接从菌种保藏机构购买，未经过严格的测试和筛选，因而矿化活性不高，难以有效应用于混凝土裂缝的修复。
发明内容
本发明目的是提供一种耐高碱性的高效钙离子矿化细菌的芽孢杆菌及其用途。
本发明的芽孢杆菌H4已于2014年9月1日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号为：CGMCC NO.9629。其分类命名为：芽孢杆菌，拉丁名：Bacillus sp.H4
所述钙离子矿化菌H4，其保藏登记号为CGMCC NO.9629，其16S rRNA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述钙离子矿化菌H4菌落特征如下：菌落边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，形成芽孢，运动；革兰氏染色阳性。
本发明的一个方面，钙离子矿化菌芽孢杆菌H4在促进钙离子沉积为碳酸钙的应用。
本发明的一个方面，钙离子矿化菌芽孢杆菌H4在修复混凝土裂缝中的应用。
所述钙离子沉积在20-37℃、pH 9.0-11.0下进行。
本发明中的芽孢杆菌H4是一种常见的嗜碱芽孢杆菌，且该菌种能够在低细胞浓度下对钙离子进行转化。
附图说明
图1为不同菌株钙矿化活性的比较示意图。
具体实施方法
以下将结合附图对本发明所涉及菌株的获取过程及菌株特点进行详细描述。
芽孢杆菌H4的分离、纯化及保存
所述钙离子矿化菌经富集和筛选纯化分离获得，具体步骤如下：富集培养：将红树林沉积物土样1g加入到LN-海水-碳酸钠培养液中，于30℃、150rpm摇床上振荡培养7天。
分离培养：吸取200μL富集培养液加于LN-海水-碳酸钠固体培养基平板表面，用无菌涂布棒涂布均匀，接着用该涂布棒继续涂布3个LN-海水-碳酸钠固体培养基平板，于30℃恒温培养箱中倒置培养7天。
挑菌纯化：用接种环挑LN-海水-碳酸钠固体培养基平板生长的菌落在新鲜的LN-海水-碳酸钠固体培养基平板上划线纯化3次。
保存：将纯化获得的菌体一份接种于LN-海水-碳酸钠固体斜面培养基中，4℃保存；同时另一份于15％甘油中保存于-80℃。
所述LN-海水-碳酸钠培养基配方如下表：
A液和B液分开单独灭菌，灭菌后在超净工作台内无菌条件下将二者混匀即为LN-海水-碳酸钠培养基。
所述微量元素的配方是ZnSO4〃7H2O 0.1g，MnCl2〃4H2O 0.03g，H3BO30.3g，CoCl2〃6H2O 0.2g，CuCl2〃2H2O 0.01g,NiCl2〃6H2O 0.02g,Na2MoO4〃2H2O 0.03g，硫酸亚铁2g，水1000mL。
芽孢杆菌H4的鉴定
通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株H4为芽孢杆菌。具体步骤如下：
采用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(宝生物工程有限公司)提取菌株DNA。选用细菌的16S rDNA通用引物由英潍捷基公司合成：
27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
扩增反应体系：
PCR反应程序如下：
采用试剂盒TaKaRaMiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0(宝生物工程有限公司)对PCR产物进行纯化，之后采用solution I将PCR产物与载体T-VectorpMDTM19(宝生物工程有限公司)连接并转化E.coliDH5a感受态细胞(宝生物工程有限公司)，通过蓝白斑筛选获得白色菌落送英潍捷基公司进行测序，测序结果在网站eztaxon-e.ezbiocloud.net核酸序列数据库中进行同源序列比较，确定其为芽孢杆菌。
基于测序结果，该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已于2014年9月1日保藏在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号为：CGMCC NO.9629。其分类属于芽孢杆菌属，拉丁属名：Bacillus
菌株H4优异的矿化活性
采用深圳大学专利《一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法》所公开的方法基础上进行了改进，对众多分离自盐碱湖和红树林沉积物的嗜碱芽孢杆菌的钙离子矿化活性进行检测。
将前述分离到的15株细菌保存于装有碱性LB固体培养基的96孔透明微孔板Ⅰ的孔中，30℃、倒置培养24-48h；每一孔中的菌株由该孔所在透明微孔板的编号、行号和列号组合命名。
其中，碱性LB固体培养基的组分和制备方法如下：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L，琼脂粉15g；按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中；两种溶液灭菌后于无菌超净工作台中趁热混匀并分装于96孔板孔中，每孔300μL)
将透明微孔板中的菌落用多通道移液器对应的接种于装有碱性LB液体发酵培养基的96孔板Ⅱ对应的孔中，于30℃静置培养16-24h；
其中，碱性LB液体培养基的组分和制备方法如下：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)11-22.13g/L；按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨溶解于900ml水中；称量CAPS溶解于100ml水中；两种溶液灭菌后冷却至室温，于无菌超净工作台中混匀并分装于96孔板孔中，每孔200μL)
将96孔板Ⅱ中的发酵液对应接种到装有ASWM4发酵培养基的96孔板Ⅲ对应的孔中，放于无二氧化碳培养体系中于30℃静置培养168h；将深孔板Ⅱ放置于深孔板离心机中，3000×g离心10min。深孔板Ⅱ孔中的上清液即为待测样品。
其中ASWM4发酵培养基的组分和制备方法如下，L-乳酸钠5-10g/L，硝酸钠1-2g/L，酵母粉0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.01-0.02g/L，氯化镁0.05--0.1g/L，CAPS 16-23g/L，氯化钠5-30g/L，硫酸钠3-4g/L，氯化钾0.677g/L，溴化钾0.05-0.15g/L，硼酸0.02-0.03g/L，氟化钠0.002-0.003g/L，氯化钙1-1.3g/L，氯化锶0.01-0.02g/L，去离子水1L，CAPS 11-22.13g/L，pH＝9.6-10.5，115-121℃高压湿热灭菌15-30min。配制方法：按照以上浓度称量氯化钙、氯化锶和氯化镁溶解于100-200ml水中；称量CAPS溶解于120-130ml水中，用6M氢氧化钠溶液将其pH调整至9.6-10.5；其他成分溶解于700-800ml水中；将以上3种溶液灭菌后在无菌超净工作台中混匀并用多通道移液器分装至96孔板中备用。
其中无二氧化碳培养体系的建立：将上海越磁公司的PC-3型塑料真空干燥器抽气阀打开，与真空泵连接，抽真空，直至真空表读数达到-0.1Mpa；关闭抽气阀后，再将进气阀与装有氮气和氧气混合气体(氮气：氧气＝78:21(v/v))的高压气瓶连接，打开真空干燥器进气阀和高压气瓶的阀门，向真空干燥器中充氮氧混合气体，直至真空干燥器真空表读数为-0Mp。打开真空干燥器盖子，继续充氮氧混合气体，同时将已经接种的96孔板Ⅲ放于已经充满氮氧混合气体的真空干燥器中，盖上真空干燥器盖子，关闭高压气瓶阀门。将真空泵连接真空干燥器抽气阀门，抽真空，真空干燥器内压强一旦达到接近-0.01Mp即可停止抽真空，不可低于-0.01Mp，既保证真空干燥器由于一定的真空度而保持密封，又不影响微生物生长。
将上清液稀释3-5倍，用量程为10μL的多通道移液枪吸取3.75μL上清液加入另一个新的透明微孔板中，用量程为300μL的多通道移液枪向加有待测样品的孔中加入300μL钙离子显色应用液，以不加氯化钙的ASWM4培养基做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，根据标准曲线和稀释倍数计算不同孔中上清液中钙离子浓度，进而根据样品体积再计算出不同孔中的钙离子浓度和钙矿化率。
钙矿化率＝(C0-C1)/C0；其中C0指培养基中的初始钙离子浓度，初始钙离子浓度即培养基中的钙离子浓度，由培养基的配方决定；C1指经过7天培养后发酵液中的残钙浓度。其中，如图1所示，钙矿化率最高的菌株为H4，钙矿化率高达96.4％。15株菌株的钙矿化率结果见图1。
邻-甲酚酞络合酮(OCPC)显色剂的配制：称取8-羟基喹啉500mg置烧杯中，加浓盐酸5000μL，使其溶解并转入500ml容量瓶中，再加入邻-甲酚酞络合酮25mg，待完全溶解后，加1mL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)混匀，然后加去离子水至500ml，置聚乙烯瓶内4℃保存。
2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)碱性缓冲液的配制：于1L容量瓶中置去离子水500mL，加入AMP 89.14g，待完全溶解后加水至1L，置聚乙烯瓶中4℃保存。
显色应用液的配制：临用前，根据所需用量多少，将OCPC显色剂与AMP缓冲液等体积混合。混合后，吸取300μL显色应用液加入透明微孔板孔中，用酶标仪检测检测其对波长575nm光的光吸收值，若OD575在0.3以下，则表示该溶液合格，可以使用。
标准曲线的制作：用100mL容量瓶定容稀释钙原子光谱分析标准浓缩液(钙原子光谱分析标准浓缩液1.00g Ca，sigma公司产品)至10g/L(250mM)分装后于-20℃保存备用。用去离子水配制梯度浓度钙离子溶液：0.25mM，0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM。用10μL的多通道移液枪吸取3.75μL各浓度钙离子溶液加入透明微孔板中，每个浓度加3个孔，用300μL的多通道移液枪向加有梯度浓度钙离子溶液的孔中加入300μL钙离子显色应用液混匀，以去离子水做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，以钙离子浓度为横坐标，OD575值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的二元拟合方程为：y＝0.1009x-0.0006，R2＝0.9992。
Claims (3)
1.一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)H4，其特征在于：该菌株能够在强碱性条件下高效地促进钙离子形成碳酸钙，菌种保藏编号为CGMCC No.9629，2014年9月1日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，钙矿化率＝(C0-C1)/C0；其中C0指培养基中的初始钙离子浓度，初始钙离子浓度即培养基中的钙离子浓度，由培养基的配方决定；C1指经过7天培养后发酵液中的残钙浓度，钙矿化率最高的菌株为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)H4，在细胞浓度为5×107个/ml时也能充分转化钙离子为碳酸钙，该菌株的矿化作用在20-37℃、pH 9.0-11.0下进行，钙矿化率高达96.4％。
2.根据权利要求1所述高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌H4，其特征在于，所述矿化菌株菌落特征为，边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，形成芽孢，运动；革兰氏染色阳性。
3.根据权利要求1-2任意权利要求所述的高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌H4的应用，其特征在于，所述菌株H4促进钙离子沉积为碳酸钙，用于修复混凝土裂缝。
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