CN106497809B

CN106497809B - 一种阴沟肠杆菌、含有该菌的菌剂及其应用和钝化汞的方法

Info

Publication number: CN106497809B
Application number: CN201510562917.5A
Authority: CN
Inventors: 林森; 李晓桐; 任立伟; 王培红
Original assignee: Lianghua Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Lianghua Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2035-09-07
Also published as: CN106497809A

Abstract

本发明涉及重金属汞污染的生物修复技术领域，公开了一种阴沟肠杆菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化汞的方法，其中，所述阴沟肠杆菌的保藏号为CGMCC NO：10850。本发明的钝化汞的方法包括：将保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌的菌剂与汞污染样品接触，以对汞污染样品中的汞进行钝化。本发明的阴沟肠杆菌对汞具有较高的降解能力，降解率高达85.5％，可耐受较高浓度的汞污染，操作简便，可在汞污染的土壤或含汞废水的生物修复过程中发挥重要作用。

Description

一种阴沟肠杆菌、含有该菌的菌剂及其应用和钝化汞的方法

技术领域

本发明涉及重金属汞污染的生物修复技术领域，具体地，涉及一种阴沟肠杆菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化汞的方法。

背景技术

汞(Hg)，又称水银，熔点仅有-38.87℃，是常温下唯一呈现液态并容易流动的金属。汞及其化合物是非常重要的工业原料，通常被用作催化剂或者原材料，大规模被应用于化工、油漆、制药、农业等行业。由于汞的大量使用，由人类活动造成的全球汞含量持续增加。《全球汞状况评估》指出，自工业革命以来，汞在全球的大气、水和土壤环境中的含量增加了近三倍。每年全球约6500吨汞释放到环境中，汞进入环境后不断迁移，威胁到整体生态环境安全。工业造成的含汞化合物废水排放成为最大污染源，农药等仅居其次，含汞的杀虫剂、杀菌剂、防腐剂和选种剂在农业上的应用对土壤造成严重污染。土壤对汞具有强烈地吸附作用，95％以上的汞进入土壤后会被迅速吸附或者固定，并在表层积累并不断迁移，对动植物的生长发育影响极大，并可导致生物体基因突变，随迁移过程，水体、大气环境都受到严重威胁。

目前汞污染治理方法主要有化学沉淀法、活性炭吸附法、金属还原法、离子交换法、电解法和膜技术分离法。这些方法主要集中并应用于含汞废水的治理，操作繁琐且运行费用较高，能耗大且易造成二次污染，而且并不能满足汞污染土壤修复的要求。因此，绿色钝化土壤中的汞是农业生产不可忽视的问题，筛选出一株高效汞钝化菌株是当前的主要任务。

发明内容

本发明的目的是为了克服汞污染生物修复中存在的上述缺陷，提供一种阴沟肠杆菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化汞的方法。本发明的阴沟肠杆菌，具有较高的汞钝化能力，可耐受较高浓度的汞污染，操作简便，可在汞污染的土壤或含汞废水的生物修复过程中发挥重要作用。

为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一种具有较高的汞钝化能力、可耐受较高浓度的汞污染的阴沟肠杆菌。因此，第一方面，本发明提供了一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，该阴沟肠杆菌的保藏号为CGMCC NO：10850。

第二方面，本发明提供了一种含有上述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的菌剂。

第三方面，本发明提供了上述阴沟肠杆菌和/或菌剂在钝化汞中的应用。

第四方面，本发明提供了一种钝化汞的方法，所述方法包括：将上述阴沟肠杆菌和/或上述菌剂与汞污染样品接触，以对汞污染样品中的汞进行钝化。

本发明的阴沟肠杆菌为重金属汞高效钝化菌株，对汞具有高耐受性与降解能力，可在较高汞含量下快速生长，能够有效降低汞在水相或土壤相中的生物可利用度，达到快速钝化效果。与现有技术相比，本发明的阴沟肠杆菌能够高效钝化土壤相或水相中的汞，降解率高达85.5％，可耐受较高浓度的汞污染(最大汞耐受量高达30mg/L)，操作简便，可在汞污染的土壤或含汞废水的生物修复过程中发挥重要作用，实现环保绿色修复的目的，经济高效，操作简单，环境友好。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1为不同Hg²⁺浓度下菌株的生长状况图。

生物保藏

本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC：10850。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，该阴沟肠杆菌的保藏号为CGMCC NO：10850。

本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌，为革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科肠杆菌属阴沟肠杆菌。该菌株来源于安徽宣城汞污染土壤，采用土壤环流方式筛选并通过稀释平板方法分离纯化得到。生物学特性为：粗短杆状、周生鞭毛、可分泌大量胞外分泌物；革兰氏染色实验、氧化酶试验、产H₂S实验阴性，明胶液化试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、淀粉酶实验阳性，可利用甘露糖。

其中，本发明的阴沟肠杆菌的分离过程可以包括：将100g土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流富集装置的上层，200ml LB培养基作为环流液置于下层。启动蠕动泵，富集过程中根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。富集结束后，取上层土壤与下层环流液，并将上清液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，吸取适量涂布于含有5、15、30、50、70mg/L Hg²⁺的LB固体培养基上，25-30℃培养3天后取菌株进行平板划线，分离单菌落。

本发明从筛选出的菌株中获得了一株对重金属汞耐抗性最强的菌株P7，对该菌株进行生理生化鉴定分析，其生物学特性为：粗短杆状、周生鞭毛、可分泌大量胞外分泌物；革兰氏染色实验、氧化酶试验、产H₂S实验阴性，明胶液化试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、淀粉酶实验阳性，可利用甘露糖。同时，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampbacteria DNA kit)步骤提取该菌株的DNA，进行16S rDNA基因序列分析，其16s rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，结果表明该菌为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。将该阴沟肠杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：10850。

本发明提供的阴沟肠杆菌经过培养能够产生大量阴沟肠杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述阴沟肠杆菌增殖即可，例如，可以按照10⁷ CFU/mL的接种量将阴沟肠杆菌的活菌体接种于LB培养基中，在25-38℃的温度下培养12-48小时后，得到培养液。

本发明中，对于阴沟肠杆菌的培养条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种培养条件，例如，培养时所用的LB液体培养基的组成可以为：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠，pH＝6.8-7.0。固体LB培养基中还含有2.5-3.0重量％的琼脂。培养时所用的无机盐培养基的组成可以为：0.8-1.2重量％KH₂PO₄，0.8-1.2重量％K₂HPO₄，1-1.5重量％NH₄NO₃，0.03-0.08重量％MgSO₄，0.001-0.003重量％CaCl₂，0.01-0.03重量％FeSO₄·7H₂O，pH＝6.0-7.5。

本发明可以进一步分离上述培养液中的阴沟肠杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

本发明还可以进一步从阴沟肠杆菌的活菌体中得到细胞内提取物，对于得到细胞内提取物的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为在冰浴条件下对菌体进行超声破碎，离心取上清。

第二方面，本发明提供了含有保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的菌剂。

本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，本发明的阴沟肠杆菌的死菌体和活菌体均能够有效对重金属汞进行钝化。因此，如上所述的阴沟肠杆菌的菌体可以为活菌体，也可以为死菌体，还可以为活菌体和死菌体的混合菌体，即菌剂含有所述阴沟肠杆菌的死菌体和/或活菌体。但更令人惊奇的是，本发明的发明人发现，本发明提供的阴沟肠杆菌的细胞内提取物，对重金属汞的钝化效果更佳，因此，优选情况下，菌剂含有所述阴沟肠杆菌的细胞内提取物。

根据本发明，对于以上死菌体的制备方法没有特别的限制，例如但不限于，可以通过自然裂解制备，也可以通过热致死制备，还可以通过冰浴条件下超声破碎制备，其中以冰浴条件下超声破碎制备效果最优。对于得到细胞内提取物的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为在冰浴条件下对菌体进行超声破碎，离心取上清。

本发明中，对菌剂中所述阴沟肠杆菌的浓度或细胞内提取物的量没有特别的限定，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。

第三方面，本发明提供了上述阴沟肠杆菌和/或菌剂在钝化汞中的应用。优选情况下，汞源为汞污染的土壤或含汞废水。

本发明中，“钝化汞”是指降低汞污染样品中重金属汞(Hg²⁺)的含量及其生物有效性，从而达到修复重金属汞污染的环境的目的。

第四方面，本发明提供了一种钝化汞的方法，该方法包括：将保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌的菌剂与汞污染样品接触，以对汞污染样品中的汞进行钝化。

本发明方法中，对于接触的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种的方法，例如可以在汞污染样品中加入保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌的菌剂，混合均匀。优选情况下，所述样品为土壤或含汞废水。

本发明方法中，对于加入至汞污染样品中的阴沟肠杆菌的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述阴沟肠杆菌能够在所述汞污染样品中起作用并且对重金属汞有效钝化即可，加入的所述阴沟肠杆菌的形式，例如，可以为培养至对数期的菌体或菌液，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉，还可以为其细胞内提取物。

本发明对加入的阴沟肠杆菌的数量和菌剂的量也没有特别的限制，这可以根据所述汞污染样品中的汞的含量以及钝化难易程度来决定，例如，当所述样品中的汞含量较高或较难钝化或对于所述阴沟肠杆菌的生存较不利时，可以提高所述阴沟肠杆菌的接种量和菌剂的加入量；当所述样品中的汞含量较低或较易钝化或对所述阴沟肠杆菌的生存的影响较小时，可以减少所述阴沟肠杆菌的接种量和菌剂的加入量。

根据本发明，当汞污染样品为土壤时，为了进一步促进本发明提供的阴沟肠杆菌对汞的钝化效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。

实施例

以下将通过实施例和对比例对本发明进行详细描述，但并不因此限制本发明。

以下实施例和对比例中的实验方法中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

汞降解率＝(处理前Hg²⁺含量-处理后Hg²⁺含量)/处理前Hg²⁺含量×100％。

冷原子吸收汞分析仪购自北京利曼科技有限公司，型号为Hydra AA Auto。

制备例

将本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌在LB液体培养基中活化2次，每次活化均在170 rpm、30±1℃下进行12小时，得到菌液，将得到的菌液以3体积％的接种量接种于300ml LB液体培养基中，在170rpm、30±1℃的培养条件下进行培养，4h进入对数期，20h到达稳定期，菌浓度OD₆₀₀约为1.4。

实施例1

本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌在水相中对汞的耐受性及钝化能力

在200ml的LB液体培养基中加入1体积％的制备例得到的菌液，并加入一定量的HgCl₂，使其最终浓度分别为5mg/L、15mg/L、30mg/L和50mg/L。在恒温振荡器中30℃、170rpm下培养，间隔一定时间段取样测定菌浓度OD₆₀₀、用冷原子吸收汞分析仪测定汞剩余量并计算汞降解率。48h时不同Hg²⁺浓度下汞去除率的结果如表1所示，不同Hg²⁺浓度下菌株的生长状况如图1所示。由表1可知，48h时，Hg²⁺浓度为30mg/L时达到最大降解率85.5％；由图1可知，本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌的最大汞耐受浓度高达30mg/L，高于此浓度此菌生长受到抑制。表明本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌能够耐受高达30mg/L浓度的汞污染，而且还有高达85.5％的汞降解能力。

表1

浓度(mg/L)	汞去除率(％)
		5	81.2
15	83.1
		30	85.5
50	60.1

实施例2

本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌在土壤中对汞的钝化效果

将100ml LB液体培养基在121℃下灭菌15min，然后接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。将前述菌液加入到1kg汞污染土壤(Hg²⁺含量为25mg/kg)中，并添加无菌去离子水，混合均匀，培养15天，并保证每天土壤的含水量为20％。15天后，取土壤样品在40℃下烘干，研磨呈均匀粉末状，采用冷原子吸收汞分析仪测定最终汞剩余量。结果显示，土壤中Hg²⁺由最初的25mg/kg降至5.47mg/kg，表明该菌株在土壤中能对Hg²⁺产生较强的降解作用，从而降低汞对土壤的危害性。

实施例3

本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌在水相中不同形态对汞的钝化效果

将100ml LB液体培养基在121℃下灭菌15min，然后接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。将菌液平均分成2份，一份4℃离心取上清，即为上清样品；另一份121℃灭菌15min，然后将菌液4℃离心取上清，即为高温灭菌样品。用10mmol/LTris-HCI缓冲液(pH 7.0)洗涤与上清样品对应的离心得到的菌体2次后重悬，然后在冰浴条件下超声破碎，超声频率为25KHz，超声时间为20min，4℃离心取上清，即为细胞内提取物样品。3份样品分别加入一定量的HgCl₂使Hg²⁺浓度为30mg/L。24h后离心并测定上清液中的Hg²⁺浓度，二价汞去除率结果如表2所示。

表2

项目	Hg<sup>2+</sup>去除率
		上清样品	23.6％
高温灭菌样品	12.9％
		细胞内提取物样品	88.3％

由表2可以看出，细胞内提取物样品对Hg²⁺去除率高达88.3％，远高于上清样品和高温灭菌样品，表明本发明的CGMCC NO：10850的阴沟肠杆菌的细胞内提取物样品能够更有效的钝化汞。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于，该阴沟肠杆菌的保藏号为CGMCC NO：10850。

2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其中，该菌剂含有所述阴沟肠杆菌的死菌体和/或活菌体。

4.根据权利要求2所述的菌剂，其中，该菌剂含有所述阴沟肠杆菌的细胞内提取物。

5.权利要求1所述的阴沟肠杆菌和/或权利要求2-4中任意一项所述的菌剂在钝化汞中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，汞源为汞污染的土壤或含汞废水。

7.一种钝化汞的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的阴沟肠杆菌，和/或权利要求2-4中任意一项所述的菌剂与汞污染样品接触，以对汞污染样品中的汞进行钝化。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述样品为土壤或含汞废水。