CN103710267A

CN103710267A - 一种长枝木霉m-04及其应用

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Publication number: CN103710267A
Application number: CN201310548061.7A
Authority: CN
Inventors: 欧杰; 董博; 马晨晨; 殷曦敏; 张皓文
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN103710267B

Abstract

本发明涉及微生物和水处理领域，公开了一种保藏号为CGMCC No.8331的长枝木霉M-04，这种微生物可用于还原或吸附Cr⁶⁺，用于处理含Cr⁶⁺的水体，对受污染水体有修复作用，可用于污水处理。本发明将上述微生物用于处理污水，工艺较简单，处理效率高，成本低，具有良好的应用前景。

Description

一种长枝木霉M-04及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和水处理领域，具体为一种可以还原水体中Cr⁶⁺的长枝木霉。

背景技术

目前重金属对水体污染越来越严重，而且重金属在水体中的浓度和种类大大增加。某些金属不仅由于价格昂贵，还会对生态环境、人体健康危害极其严重，因此如何有效地处理废水中的重金属已经越来越重要和急迫。

铬广泛存在于自然界中，例如岩石、土壤、植物体、动物体和火山等。铬污染主要由电镀，制革，冶金等生产过程中的废水造成的^[1,2]。铬离子主要以三价阳离子和六价阴离子形式存在。Cr(VI)可容，有剧毒和致癌；Cr(III)微溶，毒性较低，Cr(VI)比Cr(III)移动性强，所以Cr(VI)对人体和动物体危害更大，有文献报道Cr(VI)毒性是Cr(III)的100倍，而且还会影响植物的生长和改变其形态。

传统对重金属处理方法包括沉淀法、化学氧化还原法、离子交换法、电化学法等。但这些方法存在去除不彻底、操作繁琐、运行成本高、费用昂贵和造成二次污染等缺点。微生物处理法作为新型高效环保的重金属废水处理技术，已成为研究的热点。微生物吸附法利用微生物自身的特性来吸附溶于水体的重金属，具有原料来源丰富、品种多、成本低、在低浓度下处理效果好、吸附容量大、速度快、选择性好，同时吸附设备简单、易操作等优势。微生物吸附法主要以活微生物细胞和死微生物细胞两种形式来吸附重金属离子，虽然已经报道显示活细胞比死细胞更具有去除重金属离子的效果，但选择死细胞对处理重金属废水更加有利，因为死细胞不会受重金属毒性的影响，也不需要持续的营养物质，而且可以重复利用。

发明内容

本发明旨在提供一种可还原或吸附六价铬的霉菌。

本发明还将上述霉菌用于处理含六价铬或其他重金属离子的水体。

一种长枝木霉M-04，保藏号为CGMCC NO.8331（保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年10月12日），分类命名：长枝木霉Trichoderma longibrachinatum。并且，这种长枝木霉M-04的tef序列如SEQ ID.No.1所示。

本文从重金属污染的土壤分离筛选出具有高效吸附和还原能力的霉菌，以一定量死的细胞投放到Cr(VI)水溶液中，测定这些霉菌对Cr(VI)的修复能力，并对修复功能最好的霉菌进行鉴定，得到一种长枝木霉M-04。

上述长枝木霉M-04可用于还原或吸附Cr⁶⁺，用于处理含Cr⁶⁺的水体。

用上述长枝木霉M043处理含Cr⁶⁺水体的方法，步骤包括：将上述的长枝木霉M04的菌丝体干燥后，置于含Cr⁶⁺的水体中，25～30℃ 处理24～96小时。优选的，处理时以50～200rpm速度进行震荡处理。

干燥的菌丝体与所处理的水体用量比为5g/L～50g/L。更优选的，干燥的菌丝体与所处理的水体用量比为15g/L～25g/L。

这种长枝木霉M-04的培养方法为：用霉菌培养基，如马丁液体培养基、马铃薯液体培养基或查氏琼脂培养基（Czapek yeast autolysate agar），在25～35℃下培养72h。具体为：马铃薯琼脂培养基，在28℃下培养48h；马丁液体培养基，在28℃下培养72h；查氏琼脂培养基（Czapek yeast autolysate agar），在25℃下培养5d。.

结果显示，上述菌株干燥后得到的死细胞可将水体中的六价铬还原为三价铬，并且能吸附部分铬元素。

本发明获得了一种新型微生物，可以吸附和还原水体中的六价铬，对受污染水体有修复作用，可用于污水处理。本发明工艺较简单，处理效率高，成本低，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明霉菌M-04的形态图，图a和b分别表示M-04的孢子梗和孢子头

图2为本发明霉菌M-04与其他木霉家族的关系图

具体实施方式

实施例1

菌株来源

上海市某废弃钢铁厂地处亚热带季风气候区。于2012年9月在上海市某废弃钢铁厂内取土壤样品，放入无菌袋中。

培养基及试剂

重铬酸钾（优级纯），使用前110℃烘干2h。培养基所用的试剂(孟加拉红培养基、马丁式培养基）采购自国药；Taq DNA聚合酶、dNTP、购自大连TaKaRa公司；DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司；抗生素等购自英国OXOID公司；Milli-Q水。

霉菌菌株初分离

从采集的土样中称取25g，溶解到装有适量玻璃珠和225mL无菌水的采样杯中（已灭菌），摇匀，用0.9%的无菌生理盐水梯度稀释，分别稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4。涂布到孟加拉红培养基上（1*10⁵Pa,121℃灭菌20min），28℃培养2d，原位复制法复制到另一个平板中培养，重复4～5次，获得初筛纯培养菌株（根据《微生物学实验教程》操作，钱存柔、黄仪秀主编，北京大学出版社，1999）。霉菌菌株的耐受性

向发酵液添加Cr⁶⁺储备液，使培养液中的Cr⁶⁺终浓度分别为100、150、200、250、300、350；400，500，600，700mg/L，将斜面保存的耐Cr6+菌株在种子液活化24h，以1%接种量接入发酵液中，28℃，220r/min震荡培养72h，观察菌株生长情况，能够抑制菌株生长的最低浓度为菌株的最低抑制菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。（结果：对土壤中所分离筛选到的耐Cr⁶⁺霉菌经过逐步驯化，研究其对Cr⁶⁺的耐受能力。M-04的Cr⁶⁺最低抑制浓度可达到了 500mg/L。而其它大部分分离得到的菌株均在100mg/L不生长，5株菌最低抑制浓度在100mg/L以上，但此菌最低抑制浓度最高，即得到本发明保藏号为CGMCC NO.8331的长枝木霉菌株。

实施例2耐Cr⁶⁺霉菌还原六价铬离子

将斜面保存高耐受性的菌种M-04接种于未添加Cr⁶⁺的液体培养基中培养72h，收集菌丝，自然干燥4h，称取1.0g菌丝置于50ml100mg/L Cr⁶⁺水溶液中，28℃，150r/min震荡培养48h，过滤。用ICP-MS测定其滤液中铬离子的含量，重复3次，求平均值，以不接种但含有100mg/L Cr⁶⁺水溶液作为对照。选择处理效果最好的菌株，命名为M04并进行下一步鉴定。

ICP-MS检测根据以下文献记载的方法进行：

（1）Pitt JI.1979.The genus Penicillium and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces.London:Academic Press.

（2）N/T2210-2008保健食品中六价铬的测定离子色谱-电感耦合等离子体质谱法

（3）SN/T2208-2008水产品中钠、钠、镁、铝、钙、铬、铁、镍、铜、锌、砷、锶、钼、镉、铅、汞、硒的测定微波消解-电感耦合等离子体-质谱法

通过ICP-MS测定结果为：处理后的水体中，Cr⁶⁺的浓度测定值在检测以下，Cr³⁺为61.1mg/L。M-04能将初始浓度100mg/L的Cr⁶⁺水溶液还原成Cr³⁺，Cr³⁺比Cr⁶⁺流动性弱，所以Cr³⁺的毒性比Cr⁶⁺弱，从而降低其毒性。将这种霉菌应用处理重金属Cr⁶⁺污水中，可以降低其毒性。

将过滤后的菌丝，用去离子水冲洗3次后烘干，对其用原子吸收仪测定其总铬的含量，重复3次，求平均值。结果：菌丝含量铬量为0.54mg/g。（GB/T5009.123-2003，食品中铬的测定）。

实施例3还原Cr⁶⁺霉菌的鉴定

一、分子系统学鉴定

将筛选到高吸附性的耐Cr⁶⁺霉菌接种到培养基平板上，培养48h。取单菌落到液体培养基中摇床培养48h，采用石英砂研磨CTAB提取法(Scott et al.,2000,DNA heteroduplex fingerprinting in Penicillium.In:Samson RA,Pitt JI(eds).Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification.Amsterdam:Harwood Academic Publishers.p.225–236)，提取菌株的DNA为模板，进行PCR扩增。选用翻译延伸因子（tef1-alpha）基因(tef)，扩增引物为EF1T和EF2T(Bischoff et al.,2006.Metarhizium frigidum sp.nov.:a cryptic species of M.anisopliae and a member of the M.flavoviride complex.Mycologia,98:737–745)。

PCR扩增反应条件：先94℃加热3分钟使模板DNA变性，然后进入下列温度循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后在72℃延伸5分钟。

PCR产物检测和测序：PCR产物与100bp DNA ladder(MBI Fermentas)用2.0%的琼脂糖凝胶(agarose gel)在0.5×TBE电泳缓冲液中于80V电压下电泳20分钟，然后置于0.5μg/ml的溴乙锭(EB,ehidium bromide)溶液中染色15分钟，在波长365和254nm的紫外光下检测为明显单一条带的产物由擎科生物技术有限公司纯化后用ABI3700(Applied Biosystems)进行双向直通测序。检测结果，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

数据处理和统计学分析：原始序列用生物软件Bioedit7.0.9编辑后得到准确无误的序列，与GenBank下载的模式和权威菌株序列组成序列数据矩阵。对于序列矩阵，在Bioedit7.0.9下做必要的人工编辑和调整得到的新矩阵。将该矩阵用MEGA5.0(Tamura et al.,2011)进行邻居连接法（neighbor-joining,NJ)分析，推断出系统发育树，并用自展法(bootstrap)进行1000次重复评估各分支的可靠性。以菌株M-04的基因序列构建系统发育树如图2，展示了菌株Ｍ-04与其他木霉家族的关系，M-04与Trichoderma longibrachiatum聚成一簇，自举值为98%。因此，菌株M-04属于木霉属Trichoderma，分类为Trichoderma longibrachiatum。

二、形态学鉴定

将菌株M-04在Czapek yeast autolysate agar(CYA,Pitt1979)上25℃培养5天，然后进行形态学鉴定。

形态学鉴定结果为：菌株M4在Czapek yeast autolysate agar上25℃培养5天，菌落直径40-48mm，较薄，绒状；分生孢子较多，近于草绿色(Grass Green)；无色渗出液聚集成小滴状；无可溶性色素；菌落反面呈绿色，边缘较浅。瓶梗单生；瓶型，常弯曲；瓶梗颈明显； 7-9X3-4微米；分生孢子椭球形至胶囊型，壁光滑，3.5-7X2.5-3.5微米，如图1，其中图a和图b分别表示M-04的孢子梗和孢子头。

综合以上两种方式鉴定结果，可以将M-04鉴定为长枝木霉Tichoderma longibrachiatum M-04。

Claims

1.一种长枝木霉M-04，其特征在于，保藏号为CGMCCNO.8331。

2.权利要求1所述长枝木霉M-04，其特征在于，其tef序列如SEQ ID.No.1所示。

3.权利要求1或2所述长枝木霉M-04用于还原或吸附Cr⁶⁺。

4.权利要求1或2所述长枝木霉M-04用于处理含Cr⁶⁺的水体。

5.处理含Cr⁶⁺水体的方法，其特征在于，步骤包括：将权利要求1或2所述长枝木霉M04的菌丝体干燥后，置于含Cr⁶⁺的水体中，25～30℃处理24～96小时。

6.权利要求5所述处理含Cr⁶⁺水体的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述长枝木霉M04的菌丝体干燥后，置于含Cr⁶⁺的水体中，25～30℃下，50～200rpm震荡处理24～96小时。

7.权利要求5或6所述处理含Cr⁶⁺水体的方法，其特征在于，干燥的菌丝体与所处理的水体用量比为5g/L～50g/L。

8.权利要求7所述处理含Cr⁶⁺水体的方法，其特征在于，干燥的菌丝体与所处理的水体用量比为15g/L～25g/L。