CN105505794A - 一种裂褶菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及领域，特别涉及一种裂褶菌及其应用。一种裂褶菌，2015年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？NO.11604，保藏名称为裂褶菌(Schizophyllum)15R-5-F01。本发明提供的裂褶菌是由取自太平洋海底沉积物1923米深的褐煤层中经过分离纯化而得，经鉴定为一种新的菌株。综合形态学鉴定和核糖体RNA序列分析结果，菌株15R-5-F01鉴定为裂褶菌，属于担子菌门，伞菌目，裂褶菌属。本发明提供的裂褶菌具有非常显著的吸附煤粉的效果，并且还可以以褐煤为原料产生甲烷的效果。

Description

一种裂褶菌及其应用
技术领域
本发明涉及领域，具体而言，涉及一种裂褶菌及其应用。
背景技术
现在大气污染和水污染问题严重，尤其是PM2.5的含量，对空气能见度和人体健康造成了极大的威胁。PM2.5指大气中直径小于或等于2.5微米的颗粒物也称为可入肺颗粒物。化学成分主要包括有机碳(OC)、元素碳(EC)、硝酸盐、硫酸盐、铵盐、钠盐(Na+)等。其中煤矿等工程作业中产生了煤粉颗粒也是大气中PM2.5的来源之一，且作业过程中产生的废煤渣颗粒对土壤和水体的污染还没有行之有效的解决方法。
褐煤是煤化程度最低的矿产煤。一种介于泥炭与沥青煤之间的棕黑色、无光泽的低级煤。化学反应性强，在空气中容易风化，不易储存和远运，燃烧时对空气污染严重。然而，由于优质煤几乎被采空，褐煤如今已成为我国主要使用的煤。因此，将褐煤转化为清洁高效且对环境友好的高品质能源成为亟待解决的问题。
产甲烷菌是一类极端厌氧古菌，广泛存在于各类极端厌氧环境中，其能量代谢的终产物主要为甲烷气体。到目前为止，分离鉴定的产甲烷菌已有200多种。它们存在于沼泽、湖泊、海洋沉积物及瘤胃动物的胃液等自然生态系统中，也存在于废水处理、堆肥和污泥消化等非自然的生态系统中。产甲烷菌是一种自养型微生物，因此在产甲烷菌中发现了许多无机物进入细胞的通道，如Na、K、Ca等无机离子或磷酸、硫酸、硝酸等无机酸。产甲烷菌还具有运输乳酸，六碳三羧酸等有机物的通道蛋白。此外，产甲烷菌还可以吸收环境中的硫酸根，通过一系列酶代谢，形成硫化氢(单丽伟，冯桂颖，范三红.产甲烷菌研究进展.微生物学杂志，2003，23(6)：42-46)。Scott于1999年首次提出向煤层中注入微生物和营养物质可促进煤层甲烷产出的观点(ScottAR,KaiserWR,AyersWB.Thermogenicandsecondarybiogenicgases,SanJuanBasin,ColoradoandNewMexico:Implicationsforcoalbedgasproducibility.AAPGBulletin,1994,78(8):1186-1209.)。目前，国内外学者对煤制取生物气的研究仍以低煤阶煤为主。苏现波等在实验室条件下，研究了盐度和pH对沼液转化低煤阶煤形成甲烷的影响(苏现波，徐影，吴昱，等.盐度、pH值对低煤阶煤层生物甲烷生成的影响[J].煤炭学报，2011，36(8)：1302-1306.)，证明低煤阶煤在适宜的条件下可被微生物降解转化。2012年，Lenhart等发现一些担子菌，如T.versicolor等可以在好氧条件下产生甲烷，这填补了真菌代谢产生甲烷的空白。但到目前为止，国内外学者研究生物产甲烷的菌主要为古菌，关于真菌产甲烷，特别是在厌氧条件下转化煤形成甲烷的报道极少。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种裂褶菌(Schizophyllum)，所述的裂褶菌于2015年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏号为CGMCCNO.11604，保藏名称为裂褶菌(Schizophyllum)15R-5-F01。
本发明的第二目的在于提供上述的裂褶菌在吸附煤粉和产甲烷中的应用。该裂褶菌在厌氧条件下明显吸附褐煤煤粉，并可将低阶褐煤转化为甲烷，为该真菌用于降低能源污染和转化劣质煤为清洁高效能源方面提供参考。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种裂褶菌，2015年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11604，保藏名称为裂褶菌(Schizophyllum)15R-5-F01。
本发明提供的裂褶菌是由取自太平洋海底沉积物1923米深的褐煤层中经过分离纯化而得，经鉴定为一种新的菌株。综合形态学鉴定和核糖体RNA序列分析结果，菌株15R-5-F01鉴定为裂褶菌(Schizophyllumcommune)，属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌目(Agaricales)，裂褶菌属(Schizophyllum)。
进一步地，所述裂褶菌取自太平洋海底1923米深的褐煤层。
进一步地，所述裂褶菌的分离培养基的成分如下：按水的体积计，土豆粉3g/L，麦芽提取物2.5g/L，牛肉膏0.125g/L，酵母粉1g/L，酪蛋白胨1g/L，D-果糖-1,6-二磷酸三钠1g/L，乙酸钠0.375g/L，氯霉素500μg/L，红霉素500μg/L，琼脂15g/L，NaCl27.25g/L，Na2SO40.16g/L，KCl0.11g/L，NH4Cl0.08g/L，MgCl23.05g/L，CaCl21.69g/L，KBr0.08g/L，H3BO30.01g/L，FeSO40.0005g/L，ZnSO40.0003g/L，MnCl20.002g/L，CuSO40.0005g/L，调节pH至7.7。
进一步地，所述裂褶菌的纯化培养基的成分如下：按水的体积计，土豆粉5.5-6.5g/L，葡萄糖10-15g/L，琼脂18-22g/L，NaCl27-28g/L，Na2SO40.15-0.17g/L，KCl0.10-0.12g/L，NH4Cl0.07-0.09g/L，MgCl23.0-3.1g/L，CaCl21.6-1.8g/L，KBr0.05-0.10g/L，H3BO30.01-0.02g/L，FeSO40.0004-0.0006g/L，ZnSO40.0002-0.0005g/L，MnCl20.001-0.003g/L，CuSO40.0004-0.0006g/L。
优选地，所述裂褶菌的纯化培养基的成分如下：按水的体积计，土豆粉6g/L，葡萄糖12g/L，琼脂20g/L，NaCl27.25g/L，Na2SO40.16g/L，KCl0.11g/L，NH4Cl0.08g/L，MgCl23.05g/L，CaCl21.69g/L，KBr0.08g/L，H3BO30.01g/L，FeSO40.0005g/L，ZnSO40.0003g/L，MnCl20.002g/L，CuSO40.0005g/L。
进一步地，所述裂褶菌为厌氧菌。
进一步地，所述裂褶菌的培养温度为25-35℃。如培养温度可以为25℃、28℃、30℃、35℃等等。
本发明还提供了所述裂褶菌在吸附煤粉和产甲烷中的应用。
根据需求，可将裂褶菌制成各种产品，以满足应用的需要。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种来源于海底沉积物的裂褶菌菌株，2015年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11604，保藏名称为裂褶菌(Schizophyllum)15R-5-F01。
(2)本发明提供的裂褶菌具有非常显著的吸附煤粉的效果，并且还可以以褐煤为原料产生甲烷的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中15R-5-F01的ITS序列系统发育树示意图；
图2为本发明实施例2中裂褶菌裂褶菌15R-5-F01对褐煤煤粉的吸附观察图；
图3为本发明实施例2中裂褶菌15R-5-F01降解褐煤过程中上层气的GC图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
1、配置培养基
1.1分离培养基：土豆粉3g，麦芽提取物2.5g，牛肉膏0.125g，酵母粉1g，酪蛋白胨1g，D-果糖-1,6-二磷酸三钠1g，乙酸钠0.375g，氯霉素500μg，红霉素500μg，琼脂15g，NaCl27.25g，Na2SO40.16g，KCl0.11g，NH4Cl0.08g，MgCl23.05g，CaCl21.69g，KBr0.08g，H3BO30.01g，FeSO40.0005g，ZnSO40.0003g，MnCl20.002g，CuSO40.0005g，蒸馏水1L。调节pH至7.7，121℃灭菌20min。
1.2纯化培养基：土豆粉6g，葡萄糖12g，琼脂20g，NaCl27.25g，Na2SO40.16g，KCl0.11g，NH4Cl0.08g，MgCl23.05g，CaCl21.69g，KBr0.08g，H3BO30.01g，FeSO40.0005g，ZnSO40.0003g，MnCl20.002g，CuSO40.0005g，蒸馏水1L。自然pH，121℃灭菌20min。
2、样品处理
超净工作台中平铺一张铝箔纸，并喷洒75％乙醇消毒30min，鼓风晾干；
将取自太平洋海底的沉积物样品放置于铝箔纸上，喷洒75％乙醇消毒30min后用灭菌的瑞士军刀除去乙醇渗透的表面浅层，反复以上操作3次以得到沉积物岩芯部分；
用灭菌的瑞士军刀无菌操作碾碎至颗粒度＜0.1cm-3，并收集沉积物颗粒于灭菌的50mL离心管中，抽真空并于4℃冰箱中保存，留作后续实验。
3、菌株的分离
取0.5g沉积物颗粒直接涂抹于分离培养基表面，并轻压以确保样品能附着或嵌入到琼脂中，共涂抹3个平板。未接种的平板作为空白对照。置于30℃恒温箱培养14天。用接种针切取菌落边缘0.2cm2的小块转接于纯化培养基上，反复转接至纯培养，4℃保藏待用。
4、形态观察
30℃培养14天后，3个平板中只有一个平板长出一株白色丝状真菌，编号15R-5-F01。分离培养基空白平板中未长出菌落，说明在实验进行过程中未受到污染。经多次纯化，菌株15R-5-F01在纯化培养基平板中5天可长满全板，菌丝白色棉花状；移至光照条件下7d可长出肉质菌丝团；20d形成裂褶状子实体，菌盖扇形，表面密被绒毛，菌肉淡黄色，菌褶掌状开裂，从基辐射状而出，不均匀、不等长。
用接种针从纯化培养基上挑取3d的新鲜菌丝于400倍普通光学显微镜下观察菌丝结构及产孢情况。普通光学显微镜下，菌丝有隔膜，未见产孢结构和孢子。同时存在细的菌丝和粗大的菌丝。
摘取菌株子实体自然风干后，直接放置于扫描显微镜(S-3400NII，日本)样品台上喷金后观察菌褶形态。扫描电镜下，菌盖外表面绒毛有节状凸起，菌褶从根部发育，初始形态为菊花状，后成为环状，排列不整齐，且环状菌褶上菌丝横向排列。
5、15R-5-F01菌株的分子生物学鉴定
从纯化培养基平板上刮取真菌菌丝200mg，于1.5ml尖头Eppendorf(EP)管中加适量灭菌石英砂研磨至糊状，然后用真菌总DNA提取试剂盒(生工，中国)提取基因组DNA，并用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和LR6(5′-CGCCAGTTCTGCTTACC-3′)进行PCR扩增(DYY-10C型电泳仪，中国)ITS和部分28S片段。PCR扩增条件：94℃变性5min进入循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；循环结束后72℃复性2min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳验证(目标片段1.5kb)，送北京华大基因纯化并测序。
所得序列直接在NCBIGenbank数据库进行同源性比对。用ITS2Database截取ITS全长序列，如序列表的SEQIDNo.1所示。ITS序列经Blast分析和ClustalX1.83多重比对，比对之后去除产生的Gap，最后用Mega5.0软件(Burgaudetal.,2009)以邻接法(NJ)建立系统进化树。
利用ITS5/LR6引物，PCR扩增了1.5kb的ITS和部分28SRNA序列，经Blast同源性比对分析，15R-5-F01与SchizophyllumcommuneAF261587.1、HM595605.1和DQ071725.2同源性达99％，与同属的SchizophyllumumbrinumAF261590.1和SchizophyllumamplumAF261591.1的同源性达98％。而与XeromphalinacampanellaDQ470826.1、AmylocorticiumsubsulphureumGU187562.1和PsilocybecubensisHM035082.1的同源性比较小(≦93％)，但是其序列覆盖度较低(表1)。
表115R-5-F01基于1.5kbPCR扩增产物的blast结果
种属名 登录号 覆盖度(％) 相似性(％)
Schizophyllum commune AF261587.1 82 99
Schizophyllum commune HM595605.1 81 99
Schizophyllum commune DQ071725.2 80 99
Schizophyllum umbrinum AF261590.1 79 98
Schizophyllum amplum AF261591.1 77 98
Xeromphalina campanella DQ470826.1 85 93
Amylocorticium subsulphureum GU187562.1 83 93
Psilocybe cubensis HM035082.1 87 92
用ITS2Database截取了ITS全长序列，经ITS系统进化树分析，15R-5-F01与SchizophyllumcommuneKF293889.1的序列相似性达100％，而与同属的耳状裂褶菌(Schizophyllumamplum)和Schizophyllumumbrinum同源性较小，并与猪苓属(Grifola)、微小分支管菌属(Henningsomyces)和Porotheleum属亲缘关系较远(图1)。表明该菌为Schizophyllumcommune。
综合形态学鉴定和核糖体RNA序列分析结果，菌株15R-5-F01鉴定为裂褶菌(Schizophyllumcommune)，属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌目(Agaricales)，裂褶菌属(Schizophyllum)。
实施例2
15R-5-F01菌株吸附煤粉和厌氧产甲烷功能
1、材料：新疆褐煤SH2030，镜面反射率(Ro＝0.49％)，将褐煤块敲碎后，置于干净研钵中充分研磨，并过200目筛子，收集200目以下颗粒度的褐煤，并于高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌15min。
2、培养基：200目褐煤煤粉10g，葡萄糖2g，NH4Cl4g，KH2PO42g，FeSO40.5mg，ZnSO40.3mg，MnCl22.0mg，CuCl20.5mg，NaCl27.25g，Na2SO40.16g，KCl0.11g，NH4Cl0.08g，MgCl23.05g，CaCl21.69g，KBr0.08g，H3BO30.01g，FeSO40.0005g，ZnSO40.0003g，MnCl20.002g，CuSO40.0005g，蒸馏水1L。自然pH，115℃灭菌20min。
3、煤粉吸附和产甲烷
在纯化培养基平板中央接种真菌菌丝，并于30℃恒温厌氧箱中培养5d，用无菌的1ml移液枪头在培养5天的纯化培养基平板上沿菌落外边缘打取生长状态一致的新鲜菌丝菌饼。
设置不加煤粉的培养基为对照培养基。
分别在250ml厌氧瓶中加入100ml培养基，每个厌氧瓶中加入3个菌饼，橡胶塞子封口冲N25min以排除培养基里的O2，同时设置不接种真菌以及不加褐煤的空白对照。30℃150rpm培养20天。
用摇瓶厌氧培养法探究裂褶菌15R-5-F01对新疆褐煤的作用发现，20d时，褐煤煤粉被菌球完全吸附(图2A)，且在400倍普通光学显微镜下，可见真菌菌丝对煤粉有明显的吸附作用(图2B)。
检测上述处理组中，摇瓶培养20d后摇瓶上层气体。采用美国AgileueHP6890型气象色谱仪定性测定气体组成，色谱条件如下：进样口温度250℃，分流比5:1，载气(高纯氮)流量1ml/min，柱温40℃7min，FID检测器，温度250℃，进样量1ml，通过与标准CH4保留时间比对，确定气体成分。另取部分气体样品送江苏省环境监测中心进行定量分析。参照国标GB/T8984.1-1997的方法测定CH4含量。
通过气相色谱法检测了裂褶菌15R-5-F01降解新疆褐煤的终产物，并用标准甲烷气体做标准，比较相同气相条件下的保留时间，具体如图3所示。从图3可以看出，在三个处理中都有一个吸收峰(保留时间3.387min)，而标准甲烷气体的保留时间为3.445min，两者之间相差0.058min，确定厌氧瓶上层气中含有CH4气体。此外，在6.191min处还发现了一个吸收峰，表明该菌在降解褐煤过程中除了产生甲烷外，还可能产生其它气体。
将上述气体送江苏省环境监测中心作进一步的定量分析，结果显示，只有褐煤没有真菌以及只有真菌没有褐煤的处理对照中也有CH4的产生，分别为0.55mg/m3和0.81mg/m3，但显著低于真菌与褐煤共培养处理的CH4含量2.84mg/m3。其中，导致褐煤对照产甲烷的原因可能与煤本身含有或水解而形成少量的CH4有关，而导致只有真菌对照产甲烷的原因可能是由于该菌在厌氧条件下分解葡萄糖发酵产气所致，所以裂褶菌15R-5-F01厌氧下培养20天降解新疆褐煤产甲烷量为1.48mg/m3。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种裂褶菌，其特征在于，2015年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11604，保藏名称为裂褶菌(Schizophyllum)15R-5-F01。
2.根据权利要求1所述的裂褶菌，其特征在于，所述裂褶菌取自太平洋海底1923米深的褐煤层。
3.根据权利要求2所述的裂褶菌，其特征在于，所述裂褶菌的分离培养基的成分如下：按水的体积计，土豆粉3g/L，麦芽提取物2.5g/L，牛肉膏0.125g/L，酵母粉1g/L，酪蛋白胨1g/L，D-果糖-1,6-二磷酸三钠1g/L，乙酸钠0.375g/L，氯霉素500μg/L，红霉素500μg/L，琼脂15g/L，NaCl27.25g/L，Na2SO40.16g/L，KCl0.11g/L，NH4Cl0.08g/L，MgCl23.05g/L，CaCl21.69g/L，KBr0.08g/L，H3BO30.01g/L，FeSO40.0005g/L，ZnSO40.0003g/L，MnCl20.002g/L，CuSO40.0005g/L，调节pH至7.7。
4.根据权利要求1所述的裂褶菌，其特征在于，所述裂褶菌的纯化培养基的成分如下：按水的体积计，土豆粉5.5-6.5g/L，葡萄糖10-15g/L，琼脂18-22g/L，NaCl27-28g/L，Na2SO40.15-0.17g/L，KCl0.10-0.12g/L，NH4Cl0.07-0.09g/L，MgCl23.0-3.1g/L，CaCl21.6-1.8g/L，KBr0.05-0.10g/L，H3BO30.01-0.02g/L，FeSO40.0004-0.0006g/L，ZnSO40.0002-0.0005g/L，MnCl20.001-0.003g/L，CuSO40.0004-0.0006g/L。
5.根据权利要求4所述的裂褶菌，其特征在于，所述裂褶菌的纯化培养基的成分如下：按水的体积计，土豆粉6g/L，葡萄糖12g/L，琼脂20g/L，NaCl27.25g/L，Na2SO40.16g/L，KCl0.11g/L，NH4Cl0.08g/L，MgCl23.05g/L，CaCl21.69g/L，KBr0.08g/L，H3BO30.01g/L，FeSO40.0005g/L，ZnSO40.0003g/L，MnCl20.002g/L，CuSO40.0005g/L。
6.根据权利要求1所述的裂褶菌，其特征在于，所述裂褶菌为厌氧菌。
7.根据权利要求1所述的裂褶菌，其特征在于，所述裂褶菌的培养温度为25-35℃。
8.权利要求1所述的裂褶菌在吸附煤粉中的应用。
9.权利要求1所述的裂褶菌在以煤为原料产甲烷中的应用。
10.根据权利要求8或9中所述的应用，其特征在于，所述的煤为褐煤。
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