CN104498404A - 一种用于铅铬污染修复的芽孢杆菌cp-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及修复铅铬污染的芽孢杆菌CP-1及其应用,可有效解决修复铅铬污染的微生物问题,方法是,将铬污染土壤与灭菌水制成混悬液,涂布于LB固体培养基平板上培养,挑取各个单菌落平板划线法划线于LB固体培养基平板上,37℃恒温培养箱过夜培养;取单菌落分别接种于含六价铬的LB固体培养基平板上和含铅的LB固体培养基平板上培养,挑取单菌落平板划线法划线于LB固体培养基平板上过夜培养;将1株细菌菌株分离纯化,经生理生化和16S rDNA测定芽孢杆菌P-1( Bacillus sp),分类命名为芽孢杆菌,保藏号为CGMCC No.9989;再经K2Cr2O7LB液体培养基和(CH3COO)2Pb LB液体培养基的芽孢杆菌CP-1( Bacillus sp)驯化,成种子液,即成,本发明芽孢杆菌CP-1能有效去除铅、六价铬,操作简单,经济有效,环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,特别是一种用于铅铬污染修复的芽孢杆菌CP-1及其应用。
背景技术
随着工业的迅猛发展,重金属污染问题日益严重。土壤中或水中的重金属离子可以作为中心离子与土壤中的水、羟基、氨以及一些有机质中的某些分子形成螯合物,并在土壤中迁移转化,易于被植物或微生物吸收利用,超标的重金属还可通过污染粮食和肉蛋等农副产品,在食物链中蓄积、传递和放大,继而通过食物链进入人体,引起各种生理功能改变,导致各种急慢性疾病,如慢性中毒、致癌和致畸等,严重威胁生态环境和人类健康。另外,重金属一旦污染环境,很难自然修复,因此,研究重金属污染的脱污修复技术,对保护生态环境、呵护人类健康意义重大。
铅和铬是毒性极强的重金属,也是国际公认的致癌金属物,严重危害生态环境和人类健康。目前,已建立的铅和六价铬污染修复方法主要有物理,化学,生物等方法。常用的物理、化学方法成本高,操作复杂,且容易造成二次污染。而生物修复技术凭借二次污染较小、处理形式多样、操作相对简单、对环境的扰动较小且不破坏植物生长所需要的土壤环境等优点,越来越受人们的关注。目前已分离出多种分别对铅和六价铬有作用的菌种,然而,利用所分离出来的菌株进行铅铬污染土壤的实际修复的研究却相对较少。并且,土壤重金属污染往往不是重金属的单一污染,而是多重污染,只是各种重金属污染程度不同。因此,本领域迫切需要获得能去除不止一种重金属、耐受力强的菌株应用于铅铬污染土壤的实际修复,但至今未见有能够专门用于铅铬污染土壤实际修复的微生物的公开报导。
发明内容
针对上述情况,为克服现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种修复铅铬污染的芽孢杆菌CP-1及其应用,可有效解决修复铅铬污染的微生物问题。
本发明解决的技术方案是,该微生物是芽孢杆菌CP-1,分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp),2014年11月20日保藏于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9989,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在修复铅铬污染物中的应用;所述的污染物为土壤或水。
所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在制备修改铅铬污染的菌剂中的应用,所述的菌剂的制备方法是:
(1)、将铬污染土壤与灭菌水制成混悬液,涂布于LB固体培养基平板上,30℃培养1~2天,挑取各个单菌落平板划线法划线于LB固体培养基平板上,37℃恒温培养箱过夜培养,4℃保存;
(2)、取上述单菌落分别接种于含六价铬的LB固体培养基平板上和含铅的LB固体培养基平板上培养,挑取单菌落平板划线法划线于LB固体培养基平板上过夜培养,备用;
(3)、将上述既能在含六价铬的LB固体培养基上生长又能在含Pb的LB固体培养基上生长的1株细菌菌株分离纯化,经生理生化和16S rDNA测定芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp),分类命名为芽孢杆菌,2014年11月20日保藏于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9989;
(4)、再经K2Cr2O7LB液体培养基和(CH3COO)2Pb LB液体培养基的芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp)驯化,成种子液,即为去除铅和六价铬的菌剂。
本发明芽孢杆菌CP-1为一种新的微生物,可有效用于对铅铬污染的修复,特别是对铅铬污染土壤的修复,可有效解决土壤或水中的重金属污染问题,既能有效去除铅,又能有效去除六价铬。操作简单,经济有效,环境友好,为铅铬污染生物修复的推进提供了技术支撑,是微生物和对铅铬污染修复上的一大创新,经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中,该微生物是芽孢杆菌CP-1,分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp),2014年11月20日保藏于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9989。
所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在修复铅铬污染物中的应用;所述的污染物优选为土壤或水;
所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在制备铅铬污染菌剂中的应用;
所述菌剂的制备方法是:
(1)、将铬污染土壤与灭菌水以重量比1︰9制成混悬液,然后再用混悬液10倍体积的灭菌水进行稀释,涂布于LB固体培养基平板上,30℃培养1~2天,挑取单菌落,平板划线法划线于LB固体培养基平板上,37℃恒温培养箱过夜培养,成含有培养基的菌落,4℃保存;其中LB固体培养基为:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100mL,调PH至7.2~7.4,加琼脂1.5%~2.0%,高压灭菌;所说的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水;
(2)、取上述含有培养基的菌落分别接种于含六价铬浓度为100mg/L的LB固体培养基平板上和含铅浓度为300mg/L的LB固体培养基平板上,30℃培养1~2天后,分别挑取单菌落,采用平板划线法划线于LB固体培养基平板上,37℃恒温培养箱过夜培养,成既能在含100mg/L六价铬的LB固体培养基上生长又能在含300mg/L的Pb的LB固体培养基上生长的菌株,4℃保存备用;
含六价铬浓度为100mg/L的LB固体培养基为:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100mL,调PH至7.2~7.4,加琼脂1.5%~2.0%,高压灭菌后冷却至50℃,添加过滤灭菌后的K2Cr2O7,使六价铬浓度为100mg/L制成;含铅浓度为300mg/L的LB固体培养基为:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100mL,调PH至7.2~7.4,加琼脂1.5%~2.0%,高压灭菌后冷却至50℃,添加过滤灭菌后的(CH3COO)2Pb,使铅浓度为300mg/L制成;
(3)、将上述既能在含100mg/L六价铬的LB固体培养基上生长又能在含300mg/L的Pb的LB固体培养基上生长的1株细菌菌株分离纯化,经生理生化和16S rDNA测定为芽孢杆菌CP-1,分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp),4℃保存,并于2014年11月20日保藏于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9989;
(4)、再经K2Cr2O7LB液体培养基和(CH3COO)2Pb LB液体培养基驯化,方法是,取上述芽孢杆菌CP-1分别接种于K2Cr2O7LB液体培养基和(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天后,再分别接种于含铬质量浓度为150mg/L的K2Cr2O7LB液体培养基和含铅质量浓度为400mg/L的(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天后,再分别接种于含铬质量浓度为200mg/L的K2Cr2O7LB液体培养基和含铅质量浓度为500mg/L的(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天后,再分别接种于含铬质量浓度为250mg/L的液体培养基和含铅质量浓度为600mg/L的(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天,以此连续培养,每次使得铬质量浓度增加50mg/L,至铬最终浓度达250mg/L,铅质量浓度增加100mg/L,至铅最终浓度达600mg/L为止,成驯化的菌株,将驯化r菌株接种于LB培养基斜面上,制成斜面菌种,-4℃保存;将斜面菌种在铬浓度为100mg/L的K2Cr2O7LB培养基上活化1~3天后,挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期,5000r/min离心10min,收集菌体,经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次,再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度为1×1010个/mL,成种子液,该种子液即为去除铅和六价铬的细菌菌剂。
本发明经实验和试用,表明本发明微生物芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp)具有很好的除去铅和六价铬的作用,有关实验资料如下:
1、挑取芽孢杆菌CP-1(Bacillussp)单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期,5000r/min离心10min,收集菌体,经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次,再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度,使其浓度为1×1010个/mL,成种子液,按4%的接种量接种于100mL含铬浓度为100mg/L LB培养基中,同时以不接菌的LB培养基为对照,35℃培养3天后,二苯碳酰二肼法测得对六价铬的去除率为87.7%;将CP-1种子液按4%的接种量接种于100mL pH7.0含铅浓度为600mg/L的(CH3COO)2Pb的LB培养基中,同时以不接菌的LB培养基为对照,35℃培养3天后,原子吸收分光光度法测得对铅的去除率为97.4%。
2、将芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp)种子液按4%的接种量分别接种于不同pH(5、6、7、8、9)含铬浓度100mg/L和含铅浓度600mg/L LB培养基中,同时以不接菌的LB培养基为对照,30℃培养2天后,二苯碳酰二肼法测得对六价铬的去除率为60.2%~79.7%,原子吸收分光光度法测得对铅的去除率为86.7~93.3%。
3、将芽孢杆菌CP-1种子液按4%的接种量接种于100mLpH7.0含铬浓度100mg/L和含铅浓度为600mg/L的LB培养基中,同时以不接菌的LB培养基为对照,分别于25℃、30℃、35℃、40℃,培养2天后,二苯碳酰二肼法测得对六价铬的去除率为66.4%~78.8%,原子吸收分光光度法测得对铅的去除率为87.9~93.2%。
4、称取10g过100目筛的铬污染土壤(采自河南省三门峡义马市,六价铬含量为447.8mg/kg)于100mL灭菌水中,然后按6%的接种量接种上述芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp)种子液于其中,37℃培养5~7天后,二苯碳酰二肼法测得六价铬含量为137.82mg/kg,故其对六价铬的去除率是69.2%。
5、称取10g过100目筛的铅污染土壤(采自河南省济源市,铅含量为183.6mg/kg)于100mL灭菌水中,然后按6%的接种量接种上述芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp)种子液于其中,37℃培养5~7天后,原子吸收分光光度法测得铅含量为12.7mg/kg,故其对铅的去除率是93.1%。
本发明经多次反复实验,均取得了与上述实验相同或相近似的效果,表明本发明微生物及菌剂(种子液)能有效去除铅和六价铬,有效用于对铅铬污染的修复,特别适用于对铅铬污染土壤或水的修复,经济和社会效益巨大。
Claims (5)
1.一种修复铅铬污染的芽孢杆菌CP-1,分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp),2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9989。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在修复铅铬污染物中的应用。
3.根据权利要求2所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在修复铅铬污染物中的应用,其特征在于,所述的污染物为土壤或水。
4.权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在制备铅铬污染菌剂中的应用。
5.权利要求4所述的保藏号为CGMCC No.9989的芽孢杆菌CP-1在制备铅铬污染菌剂中的应用,其特征在于,所述菌剂的制备方法是:
(1)、将铬污染土壤与灭菌水以重量比1︰9制成混悬液,然后再用混悬液10倍体积的灭菌水进行稀释,涂布于LB固体培养基平板上,30℃培养1~2天,挑取单菌落,平板划线法划线于LB固体培养基平板上,37℃恒温培养箱过夜培养,成含有培养基的菌落,4℃保存;其中LB固体培养基为:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100mL,调PH至7.2~7.4,加琼脂1.5%~2.0%,高压灭菌;所说的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水;
(2)、取上述含有培养基的菌落分别接种于含六价铬浓度为100mg/L的LB固体培养基平板上和含铅浓度为300mg/L的LB固体培养基平板上,30℃培养1~2天后,分别挑取单菌落,采用平板划线法划线于LB固体培养基平板上,37℃恒温培养箱过夜培养,成既能在含100mg/L六价铬的LB固体培养基上生长又能在含300mg/L的Pb的LB固体培养基上生长的菌株,4℃保存备用;
含六价铬浓度为100mg/L的LB固体培养基为:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100mL,调PH至7.2~7.4,加琼脂1.5%~2.0%,高压灭菌后冷却至50℃,添加过滤灭菌后的K2Cr2O7,使六价铬浓度为100mg/L制成;含铅浓度为300mg/L的LB固体培养基为:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100mL,调PH至7.2~7.4,加琼脂1.5%~2.0%,高压灭菌后冷却至50℃,添加过滤灭菌后的(CH3COO)2Pb,使铅浓度为300mg/L制成;
(3)、将上述既能在含100mg/L六价铬的LB固体培养基上生长又能在含300mg/L的Pb的LB固体培养基上生长的1株细菌菌株分离纯化,经生理生化和16SrDNA测定为芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp),分类命名为芽孢杆菌,4℃保存,并于2014年11月20日保藏于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9989;
(4)、再经K2Cr2O7LB液体培养基和(CH3COO)2Pb LB液体培养基驯化,方法是,取上述芽孢杆菌CP-1(Bacillus sp)分别接种于K2Cr2O7LB液体培养基和(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天后,再分别接种于含铬质量浓度为150mg/L的K2Cr2O7LB液体培养基和含铅质量浓度为400mg/L的(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天后,再分别接种于含铬质量浓度为200mg/L的K2Cr2O7LB液体培养基和含铅质量浓度为500mg/L的(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天后,再分别接种于含铬质量浓度为250mg/L的液体培养基和含铅质量浓度为600mg/L的(CH3COO)2Pb LB液体培养基中,37℃培养2天,以此连续培养,每次使得铬质量浓度增加50mg/L,至铬最终浓度达250mg/L,铅质量浓度增加100mg/L,至铅最终浓度达600mg/L为止,成驯化的菌株,将驯化的菌株接种于LB培养基斜面上,制成斜面菌种,-4℃保存;将斜面菌种在铬浓度为100mg/L的K2Cr2O7LB培养基上活化1~3天后,挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期,5000r/min离心10min,收集菌体,经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次,再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度为1×1010个/mL,成种子液,该种子液即为去除铅和六价铬的细菌菌剂。
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