CN108300678B - 一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法及应用 - Google Patents

一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法及应用，该菌株分类命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，已于2017年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC NO.14265。本发明是从铬超积累植物李氏禾的根部组织中分离筛选出的李氏禾内生细菌，经鉴定为阴沟肠杆菌，命名为G04。该菌株可将六价铬还原为三价铬，并明确了还原六价铬的条件，为六价铬污染的微生物修复提供了菌株资源及理论基础。

Description

一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种可用于环境污染治理的菌株，特别涉及到一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法及应用。
背景技术
随着现代化技术的发展，重金属铬在制药、电镀等多领域中得到了广泛的应用。但与此同时，环境中的铬及其化合物的污染问题也越来越严重。长期接触铬及铬化合物容易对胃肠道系统、免疫系统、肝脏和肾脏产生影响甚至诱发呼吸系统癌症。各种铬形态中，主要以铬酸根和重铬酸根形式存在的Cr(VI)被认为是毒性最强的。国际上对铬污染的水体、土壤都提倡采用生物修复法，即借助微生物或植物的絮凝、吸收累积、富集等作用去除重金属离子。从铬重金属污染的环境中分离的白色杆菌属(Leucobacter sp.)、假单胞菌属(pseudomonad)、链霉菌属(Streptomyces griseus.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和栖热菌属(Thermusscotoductus)都具有较好的Cr(VI)去除能力。
超富集植物具有生物量大、对重金属吸附量是常规植物10～500倍、可在重金属污染土壤中生长良好等优势，在环境污染修复中的应用日益广泛。与此同时，超富集植物内生菌的研究也开始受到研究者的重视，如As超富集植物蜈蚣草、Zn超富集植物东南景天、Cd超累积植物龙葵、Mn超积累植物商陆等均有研究报道。李氏禾(Leersia hexandra Swartz)是张学洪等在广西桂林发现的铬超积累植物，也是第一种在中国境内被发现的铬超积累植物，研究表明其对Cr(III)和Cr(VI)都有较强的富集能力。但目前利用李氏禾内生细菌对重金属Cr(VI)进行还原的研究尚未见报道。本发明以李氏禾为原材料，为六价铬污染微生物修复提供了新的微生物资源。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法，该菌株具有将六价铬还原为三价铬的功能。
本发明所采用的技术方案是一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法，具体步骤为：
(1)采集李氏禾植物，选取适量健康无病害李氏禾根，蒸馏水冲洗干净；
(2)将步骤(1)所得李氏禾的根在无菌条件下用70％的酒精浸泡20s，2.5％次氯酸钠溶液浸泡1min，然后用无菌水冲洗6次；
(3)挑取步骤(2)所得的适量的根组织，研磨，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，在37℃，120r/min条件下振荡培养2d；
(4)将步骤(3)所得物稀释后涂布于含Cr(Ⅵ)浓度为200mg/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养2d，挑取长势较好的菌落，经反复划线获得李氏禾内生细菌；
所述的李氏禾内生细菌，分类命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，该菌株已于2017年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14265，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所使用的植物为桂林理工大学环境科学与工程学院实验室的铬超积累植物李氏禾的根部组织。
所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的液体培养基组成为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，其余为水，pH 7.2；步骤(4)中的固体培养基组成为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15～20g/L，其余为水，pH7.2。
所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的应用，其特征在于李氏禾内生细菌在还原六价铬中的应用。
所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的应用，其特征在于，所述李氏禾内生细菌G04在还原六价铬时的初始pH为5.0。
所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的应用，其特征在于，所述李氏禾内生细菌G04还原六价铬的温度为37℃。
附图说明
图1不同Cr(VI)浓度下G04菌株的生长情况对比图
图2初始pH对G04菌株还原六价铬的影响图
图3温度对G04菌株还原六价铬的影响图
图4Cr(VI)初始浓度对G04菌株还原六价铬的影响图
图5反应时间对G04菌株还原六价铬的影响图
具体实施方式：
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明该发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1李氏禾铬还原内生细菌的分离筛选
首先采集桂林理工大学环境科学与工程学院植物修复实验室李氏禾植物，取适量健康的李氏禾根部，用水冲洗干净后，无菌条件下用70％的酒精浸泡40s，然后用2.5％次氯酸钠浸泡2min，最后用无菌水冲洗6次，去除附着在材料表面的消毒剂。无菌条件下用最后一遍冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基，培养后无微生物长出，表明表面消毒彻底。无菌条件下取适量经表面消毒的根部组织，加1mL 0.9％的氯化钠溶液充分研磨，取1mL研磨液接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中(500mL三角瓶)，37℃，120r·min-1条件下振荡培养2d，将培养液按10-2，10-3，10-4，10-5，10-6进行稀释，分别取20μL用平板涂布器涂布在含Cr(VI)浓度分别为200mg/L的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃恒温培养24～48h后，根据菌落生长情况，挑选长势较好、耐铬性能强的菌落，接入含铬平板中，采用划线法进行多次的分离纯化，获得Cr(VI)抗性内生菌纯培养物。
抗Cr(VI)细菌还原性的鉴定：将试管斜面保存的菌株活化后，挑取一环接种于含20mL液体培养基的50mL三角瓶中，37℃、120r/min振荡培养24h后作为种子液。将种子液按10％接种量分别接种于Cr(VI)浓度为50mg/L、100mg/L和200mg/L的液体培养基(20mL/50mL三角瓶)中，置于37℃、120r/min培养箱中振荡培养。每隔24h无菌条件下取样1mL，8000r/min离心10min，取上清液测定Cr(VI)和总Cr浓度。以不接种但含Cr(VI)的空白培养基作为空白对照。Y04菌株对六价铬的还原效果如表1所示。
表1不同Cr(VI)浓度不同培养时间下G04菌株对铬的去除率
Figure GDA0001686843580000031
实施例2 Cr(VI)浓度对G04菌株生长的影响
将试管斜面保存的菌株活化后，挑取一环接种于含40mL液体培养基的100mL三角瓶中，37℃、120r/min振荡培养24h后作为种子液。将种子液按10％接种量分别接种于Cr(VI)浓度为50mg/L、100mg/L和200mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基(100mL/250mL三角瓶)中，置于37℃的恒温水平摇床上120r/min振荡培养。培养期间，间隔一定时间无菌条件下取样5mL，测定600nm波长下的光密度OD值。结果如附图1所示。当培养基中添加Cr(VI)浓度为50mg/L、100mg/L和200mg/L时，在前6h内，菌株的生长趋势与不加Cr(VI)的空白类似，但生长速度有所减缓，且随着Cr(VI)浓度的增大减缓程度增大。6h后，菌体生长减缓，这可能是由于菌株对Cr(VI)毒性的响应存在一定的迟缓期；其后由于菌株对Cr(VI)的适应或解毒效应，菌株继续缓慢生长。
实施例3初始pH对G04菌株还原Cr(VI)的影响
试管斜面保存的菌株G04经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化，于37℃恒温培养箱中培养24h后，挑取2环接种到含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、120r/min振荡培养24h后作为种子液。
将种子液按15％接种量接种于含Cr(VI)浓度为100mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量80mL/250mL三角瓶)中，用2M的氢氧化钠和盐酸溶液调节pH后，八层纱布封口，置于37℃的恒温水平摇床上120r/min振荡培养。培养48h后，无菌条件下取样适量培养液，10000r/min离心10min，将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀，测定OD600，上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图2所示。
实施例4温度对G04菌株还原Cr(VI)的影响
试管斜面保存的菌株G04经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化，于37℃恒温培养箱中培养24h后，挑取2环接种到含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、120r/min振荡培养24h后作为种子液。
将种子液按15％接种量接种于含Cr(VI)浓度为100mg/L、pH为5.0(用2M的氢氧化钠和盐酸溶液调节)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量80mL/250mL三角瓶)中，八层纱布封口，置于不同温度的恒温水平摇床上120r/min振荡培养。培养48h后，无菌条件下取样适量培养液，10000r/min离心10min，将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀，测定OD600，上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图3所示。
实施例5初始Cr(VI)浓度对G04菌株还原Cr(VI)的影响
试管斜面保存的菌株G04经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化，于37℃恒温培养箱中培养24h后，挑取2环接种到含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、120r/min振荡培养24h后作为种子液。
将种子液按15％接种量接种于含不同Cr(VI)浓度、pH为5.0(用2M的氢氧化钠和盐酸溶液调节)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量80mL/250mL三角瓶)中，八层纱布封口，置于37℃的恒温水平摇床上120r/min振荡培养。培养48h后，无菌条件下取样适量培养液，10000r/min离心10min，将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀，测定OD600，上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图4所示。
实施例6反应时间对G04菌株还原Cr(VI)的影响
试管斜面保存的菌株G04经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化，于37℃恒温培养箱中培养24h后，挑取2环接种到含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、120r/min振荡培养24h后作为种子液。
将种子液按15％接种量接种于含不同Cr(VI)浓度、pH为5(用2M的氢氧化钠和盐酸溶液调节)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量80mL/250mL三角瓶)中，八层纱布封口，置于37℃的恒温水平摇床上120r/min振荡培养。培养不同时间后，无菌条件下取样适量培养液，10000r/min离心10min，将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀，测定OD600，上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图5所示。

Claims (3)

1.一种具有还原六价铬的李氏禾内生细菌，其特征在于，分类命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)G04，该菌株已于2017年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.14265，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的应用，其特征在于李氏禾内生细菌在还原六价铬中的应用。
3.根据权利要求2所述的具有还原六价铬的李氏禾内生细菌的应用，其特征在于，所述李氏禾内生细菌G04在还原六价铬时的初始pH为5.0。
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Assignee: Guangxi Guilin Pengyu Brothers Citrus Industry Development Co.,Ltd.

Assignor: GUILIN University OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2022450000227

Denomination of invention: Preparation method and application of an endophytic bacteria with hexavalent chromium reduction from Poa reesei

Granted publication date: 20210615

License type: Common License

Record date: 20221206