CN110862931B - 真菌Stagonospora neglecta HT01及其应用 - Google Patents

真菌Stagonospora neglecta HT01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种真菌Stagonospora neglecta HT01及其应用。其为真菌Stagonospora neglecta HT01，所述菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏登记入册的编号为CGMCC No.17596，保藏日期为2019年4月15日。本发明提供的真菌HT01可耐受强碱环境(pH小于等于13)，并对低浓度六价铬具有较高的还原效率，在24h内由10mg/L降低到0.5mg/L以下。本发明提供的真菌Stagonospora neglecta HT01对六价铬具有还原作用，并可用于六价铬污染水体的修复。

Description

真菌Stagonospora neglecta HT01及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物修复技术领域，特别是涉及一种真菌Stagonosporaneglecta HT01及其应用。
背景技术
随着经济及工业发展，使得大量的重金属，如铬等物质进入自然环境中，造成环境污染，已引起广泛关注。六价铬极易被人体吸收并持续积累，可以进入细胞内，引起致畸，致癌等病变，对人类危害较大。
六价铬污染的处理通常采用化学法将其转化为毒性极小的三价铬状态，或是采用物理方法进行回收处理。但这些方法都会带来后续的处理麻烦，成本高，二次污染等缺点。近年来，使用生物法处理Cr(VI)污染引起了人们的注意，微生物修复技术利用菌体本身对于环境中游离的六价铬进行吸附和还原，降低毒性。《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中对于Cr(VI)的规定IV类水体为小于0.5mg/L。相比高浓度的六价铬还原，低浓度的六价铬具有还原效率低，速率慢，效果差等限制。因而开发处理低浓度Cr(VI)的生物法尤为重要。
自从上世纪七十年代至今，已报道了多例微生物菌株可还原六价铬。专利CN106367362A公开的一株链霉菌，可以将100-1000mg/L的六价铬离子在30℃的条件下，还原到0mg/L浓度。专利CN109182178A公开的一种纤维微菌Cr8可耐受六价铬并可修复中轻度铬污染，但是其培养温度仍需要在30℃。专利CN108251327A公开的一株嗜根寡养单胞菌DSM14405可以还原50-100mg/L浓度的六价铬，且可耐受弱碱性环境(pH值为7-8)。专利CN10418266B公开了一株苍白杆菌CTS-325,需要额外添加其他碳源的情况下，可在120h内将100-200mg/L的六价铬污染降低到检测线以下。专利CN106011009B所公开的一株产碱菌Alcaligenes sp.GTM2，对六价铬具有还原能力，对于高浓度的六价铬还原率为89％，而对于低浓度的还原率仅为28-56％左右。以上这些专利发明所公开的微生物菌株，大多仅能处理高浓度的Cr(VI)污染，且需要较高的培养和作用温度(约30℃左右)，且并不耐受强碱条件。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的在于提出一种可去除六价铬污染的真菌及其应用，尤其是低浓度的六价铬污染的处理，同时可耐受强碱环境。
基于上述目的，本发明的真菌Stagonospora neglecta HT01，该菌于2019年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC No.17596，命名为Stagonospora neglecta HT01。
基于上述目的，本发明的菌剂，所述的菌剂包含有如上述的真菌Stagonosporaneglecta HT01。
进一步的，所述的菌剂在制备处理含六价铬废水的产品中的应用。
进一步的，所述的菌剂在处理含六价铬废水中的应用。
进一步的，所述的菌剂在制备处理含低浓度六价铬废水产品中的应用。
进一步的，所述的菌剂在处理含低浓度六价铬废水中的应用；所述水体中六价铬浓度在1-10mg/L。
进一步的，所述的菌剂在制备处理含六价铬强碱性废水的产品中的应用。
进一步的，所述的菌剂在处理含六价铬强碱性废水中的应用。
进一步的，所述的菌剂在制备处理含低浓度六价铬强碱性废水产品中的应用；pH小于等于13。
基于上述目的，本发明的含六价铬废水的处理方法，用所述的真菌Stagonosporaneglecta HT01或其菌悬液处理含六价铬废水。
与现有技术相比，本发明具有如下有益优势：
Stagonospora neglecta HT01对于低浓度Cr(VI)废水(1-10mg/L)具有较高的还原速率，在24h内的还原率高达80％以上。Stagonospora neglecta HT01菌株可耐受强碱性环境，pH为10-13,并且具有较高的生长速率。Stagonospora neglecta HT01在强碱环境(pH＝13)下经过2周可以将10mg/L的Cr(VI)还原至0.5mg/L以下。
附图说明
图1为本发明实施例的Stagonospora neglecta HT01在不同pH下培养24h后的菌浓度(OD600)；
图2为本发明实施例的Stagonospora neglecta HT01在中性pH下24h对不同浓度六价铬的还原率；
图3为本发明实施例的Stagonospora neglecta HT01在强碱环境(pH＝13)中对于六价铬还原的浓度变化图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
本发明的真菌Stagonospora neglecta HT01，该菌于2019年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17596，命名为Stagonospora neglecta HT01。
1)可耐受强碱环境真菌的筛选
样品采集：自马鞍山钢渣堆放地采集含六价铬的土壤于4℃保存运输到实验室作为目标菌的筛选材料。
菌株筛选：添加生理盐水，充分悬浮采样土壤后，离心取上清。配置强碱性的固体察氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH＝13)，在121℃高压下蒸汽灭菌20min。灭菌结束后，无菌条件下制作培养平板。土壤悬浮上清液，划线涂布于培养平板上，于30摄氏度培养3-7天，平板上的单菌落即为筛选出的可耐受强碱环境的真菌。
2)耐强碱同时具有还原六价铬真菌的筛选、还原能力测定以及菌种鉴定
菌株复筛：配置含六价铬，强碱性的液体察氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，pH＝13)，其中重铬酸钾添加量，使得最终六价铬浓度为10mg/L。在121摄氏度高压下蒸汽灭菌溶解，冷却后分装至250mL摇瓶内。每瓶培养基中分别接种实施例1中分离筛选得到的真菌。于30摄氏度，150rpm条件下，摇床震荡培养3-7天，离心取上清，检测六价铬浓度，选取降解率最高的一株进行菌种斜面保存。
菌种鉴定：提取菌株总DNA，用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌ITS片段，测序结果如下(Stagonosporaneglecta HT01的ITS基因序列信息)：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACACKTGAGGAGTCCCTAAAAAGACTTCTAGTAAGGAGGTTTGTTAGTCTGTATGGCCCCAAAAGGGCCGATGAGCAGCGTGCCTCTTTTGTCTACCCTTGTCTTTTGCGTACCCACGTTTCCTCGGCAGGCTTGCCTGTCGATTGGACATTTACATAACCTTTTTAATCTTCAATCAGCGTCTGAAAAACCTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTACTCCTTGGTGTTTAGACTCGCCTTAAAACAATTGGCAGCCAGTGTTTTGGTATTGAAGCGCAGCACAAGTAGCGTAACAATCTAATAATACTAGCATCCACAAGCCTTTTTTCACGCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCAGCTCSAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
测序序列与NCBI数据库进行序列相似性比对，鉴定出菌株HT01属于Stagonosporaneglecta菌属，相似度为99％。
菌种保藏：发明人将筛选得到的具有还原六价铬的真菌命名为Stagonosporaneglecta HT01，并于2019年4月15日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心进行专利保藏，其保存号为CGMCC No.17596。
3)Stagonospora neglecta HT01真菌在不同碱性环境下的生长状况测定
分别配置梯度pH差异的液体察氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，pH分别配置13、11.5、10、8.5、7五个梯度)，不同的pH分装于5个锥形瓶内，接种等量的Stagonospora neglecta HT01菌。摇床培养每24h取样测定其OD600值，如图1所示。
结果显示：(1)从中性到强碱性环境，Stagonospora neglecta HT01均可生长繁殖，对强碱有较好的耐受性(2)Stagonospora neglecta HT01在中性环境下生长最好，24h培养后其菌液浓度OD600可接近1.0，随着碱性增强，其生长速率变慢，但在pH＝13时，培养24h后的菌液浓度OD600仍接近0.5。
实施例1
Stagonospora neglecta HT01真菌对低浓度含铬废水(1-10mg/L)的处理实验
分别配置梯度Cr(VI)差异的液体察氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，重铬酸钾添加量使得3个梯度的Cr(VI)浓度分别为1、5、10mg/L)，分装于3个锥形瓶内，接种等量的Stagonosporaneglecta HT01菌。摇床震荡24h后取样测定其Cr(VI)浓度，对比前后差值，计算还原率，结果如图2所示。
Figure BDA0002313500650000051
结果显示：Stagonospora neglecta HT01对低浓度(1-10mg/L)的Cr(VI)具有较好的还原效果，在添加适量菌剂24后，降解率均可达到80％以上。降解率随着Cr(VI)浓度的升高而略微下降。
实施例2
Stagonospora neglecta HT01真菌在强碱环境(pH＝13)下对低浓度含铬废水(10mg/L)的处理实验
配置强碱条件下含Cr(VI)的液体察氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，重铬酸钾添加量使得Cr(VI)浓度为10mg/L，使用氢氧化钠调pH至13)，培养基至于锥形瓶内，接种Stagonospora neglectaHT01菌在25℃震荡培养。摇床震荡每2天取样一次，测定其Cr(VI)浓度，结果如图3所示。
结果显示：在经过14天的连续检测，Stagonospora neglecta HT01可以将10mg/L的Cr(VI)还原至0.5mg/L以下，达到地表水四类的要求。其还原速率在开始的几天较慢，逐渐速率增大。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其他变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种真菌Stagonospora neglecta HT01，其特征在于：该菌于2019年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC No.17596，命名为Stagonospora neglecta HT01。
2.一种菌剂，其特征在于，所述的菌剂包含有如权利要求1所述的真菌Stagonospora neglecta HT01。
3.如权利要求2所述的菌剂在制备处理含六价铬废水的产品中的应用。
4.如权利要求2所述的菌剂在处理含六价铬废水中的应用。
5.一种含六价铬废水的处理方法，其特征在于，用权利要求1所述的真菌Stagonospora neglecta HT01或其菌悬液处理含六价铬废水。
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