CN109337831A - 一种重金属抗性微生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重金属抗性微生物Sporobolomyces carnicolor MWT‑01,筛选自湘潭锰矿尾矿渣,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 2018294。其具备Mn、Cd、Pb、Zn、Cu复合抗性,能够固化、絮凝去除Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。制备成重金属固化剂应用于重金属污染土壤能够有效固化土壤中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。使用Sporobolomyces carnicolor MWT‑01制备成微生物絮凝剂应用于重金属污染水体能够有效絮凝去除水体中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。
Description
技术领域
本发明涉及水体、土壤重金属污染微生物修复,特别涉及重金属抗性微生物及其应用。
背景技术
我国土壤、水体重金属污染形式严峻,特别是土壤、水体受多种重金属污染日益加剧。多种重金属复合污染给土壤、水体带来巨大的环境风险,严重危害人们的身体健康。现阶段处理土壤、水体中多种重金属复合污染方法主要采用化学方法,虽然化学方法处理土壤、水体多种重金属复合污染效率高、成本低,操作简单,但加入的化学试剂容易造成二次污染。例如,生石灰是使用普遍的土壤重金属固化剂,然而生石灰容易造成土壤板结、有机质过度分解、磷利用率降低。使用硫化物沉淀水体中重金属,水体pH值改变容易导致硫化物沉淀分解,产生硫化氢气体,形成二次污染。土壤、水体重金属污染微生物修复法是利用微生物的作用清除土壤和水体中的重金属污染物的方法,因其成本低、环境友好、修复可持续性而备受关注。
目前,微生物修复土壤、水体重金属污染也存在诸多不利因素。例如,现阶段微生物修复土壤或者水体重金属污染往往只针对某种重金属污染,缺乏能有效修复土壤或者水体多种重金属复合污染的微生物;筛选出的微生物往往只能针对水体重金属污染或者土壤重金属污染,缺乏能同时修复水体和土壤重金属污染的微生物。鉴于此,筛选获得能够修复水体和土壤多种重金属复合污染的微生物用于环境重金属污染修复非常有意义。
发明内容
本发明目的是提供一种可修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体的重金属抗性微生物Sporobolomyces carnicolor MWT-01。
本发明技术方案:一种重金属抗性微生物为Sporobolomyces carnicolor MWT-01,保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国,武汉,武汉大学),保藏日期为2018年05月21日,保藏编号:CCTCC NO:M 2018294。
所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体的应用。
所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01使用PDA液体培养基培养,收集含有活菌体的菌液,制备成微生物固化剂,应用于污染土壤重金属固化。
所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01使用PDA液体培养基培养,收集含有活菌体的菌液,制备成微生物絮凝剂,应用于污染水体重金属絮凝去除。
所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养2-4天,收集菌液,Sporobolomyces carnicolor MWT-01浓度为0.5-2.0*109cfu/ml,用于固化土壤中重金属,微生物固化剂施用量为0.5-1mL/Kg。
所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养5-7天,收集菌液,Sporobolomyces carnicolor MWT-01浓度为1.5-3.0*109cfu/ml,用于水体中重金属絮凝去除,微生物絮凝剂投用量为0.1-2mL/L。
所述PDA培养基为改良PDA培养基,1000mL培养基中含马铃薯250-300g,葡萄糖20-25g,自然pH值,配置培养基的液体为放置2d的灭菌自来水。
所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01作为重金属固化剂施用于土壤,施用时间为第1天、第10天、第30天。
所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01可用于固化土壤中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu,絮凝去除水体中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。
本发明所述Mn、Cd、Pb、Zn、Cu抗性微生物Sporobolomyces carnicolor MWT-01筛选自湘潭锰矿尾矿渣。分离筛选步骤主要包括:1、抗性微生物筛选;2、微生物絮凝能力检测。
1、抗性微生物筛选
(1)5g锰矿尾矿渣溶于20mL 0.9%的无菌NaCl溶液,25℃条件下,摇床中100rpm条件下振荡10min,静置20min;
(2)取1mL悬浮液加入含Mn 4000mg/L,含Cd 100mg/L、Pb 100mg/L、Zn 100mg/L和Cu100mg/L的无菌水中,25℃条件下,摇床中100rpm条件下振荡6h;
(3)取1mL反应液稀释103倍,取200µL培养液涂布于PDA固体培养基,25℃条件下,培养2-7d;
(4)挑取单菌落,接种到PDA液体培养基,25℃条件下,培养2-5d;
(5)吸取100µL培养液,接种到含不同浓度Mn、Cd、Pb、Zn、Cu的PDA液体培养基中,进行Mn、Cd、Pb、Zn、Cu抗性测定。
2、微生物絮凝能力检测
(1)选取对Mn、Cd、Pb、Zn、Cu具备优良抗性的微生物,PDA培养基中,25℃条件下培养2-7d,进行微生物扩增;
(2)2mL菌液加入98mL含4g/L高岭土和0.5g/LCaCl2溶液中;
(3)反复振荡10-20次后,静置5min,取5mL上清液550nm处测量OD值,检测微生物絮凝率。
本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01使用PDA液体培养基培养,25℃条件下培养2-7d。
微生物对重金属污染土壤修复与微生物自身能力有密切关系,通常可借助微生物吸附和富集作用、氧化还原作用、溶解和沉淀作用达到土壤重金属污染修复目的。本发明所述修复重金属污染土壤技术步骤包括:
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养2-4天。
(2)Sporobolomyces carnicolor MWT-01作为重金属固化剂施用于土壤,施用时间为第1天、第10天、第30天。
(3)Sporobolomyces carnicolor MWT-01施用浓度为0.5-2.0*109cfu/ml,施用量为0.5-1mL/Kg。
本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01施用到重金属污染土壤中,在Sporobolomyces carnicolor MWT-01及其代谢产物的影响下,施用Sporobolomycescarnicolor MWT-01后第1天、第10天和第30天测定土壤pH值,土壤pH值分别6.2、6.7、7.9。(30天后施用Sporobolomyces carnicolor MWT-01,土壤pH值与第30天施用时没有明显变化。)本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01应用于重金属污染土壤修复,生长初期的Sporobolomyces carnicolor MWT-01施用于重金属污染土壤。本发明利用Sporobolomyces carnicolor MWT-01生长初期代谢产物显著影响土壤pH值,土壤中游离重金属离子形成微沉淀,利用Sporobolomyces carnicolor MWT-01菌体吸附固持土壤中重金属,改变土壤中重金属离子形态。
重金属污染水体修复中应用较为广泛的微生物修复方法为微生物絮凝法。微生物絮凝剂有效成分主要是微生物次生代谢产物或者微生物菌体。本发明所述修复重金属污染水体技术步骤包括:
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养5-7天。
(2)含Sporobolomyces carnicolor MWT-01菌体的PDA液体培养基加入0.5-5mg/LCaCl2。
(3)Sporobolomyces carnicolor MWT-01作为微生物絮凝剂投用浓度为1.5-3.0*109cfu/ml,投用量为0.1-2mL/L。
本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01应用于重金属污染水体修复,培养5-7天后Sporobolomyces carnicolor MWT-01进入生长末期,产生次生代谢产物,利用Sporobolomyces carnicolor MWT-01生长末期次生代谢产物絮凝去除水体中重金属。同时,本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01,培养5-7天后,菌体浓度大,菌体能自絮凝聚集,快速沉淀于培养基底部。本发明利用Sporobolomyces carnicolor MWT-01次生代谢产物絮凝特点和菌体吸附重金属后能快速絮凝沉淀,絮凝去除水体中重金属。
本发明所筛选的Sporobolomyces carnicolor MWT-01,属掷孢酵母属微生物。目前,没有关于Sporobolomyces carnicolor重金属抗性和絮凝能力的报道。更没有关于利用Sporobolomyces carnicolor修复重金属污染土壤和水体技术的报道。
锰矿废弃尾矿渣主要是开矿、冶炼锰矿过程产生的废弃物。本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01筛选自湘潭锰矿尾矿渣。
湘潭锰矿尾矿渣环境是营养物贫乏的环境,为了加快微生物生长,提高筛选效率。本发明所述PDA培养基含更多马铃薯和葡萄糖,能为微生物提供更多碳源、氮源,并使用自来水代替蒸馏水配置培养基为微生物提供更多无机盐,以便微生物在营养充足的条件下生长,提高筛选微生物效率。
本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01,Mn抗性高达10000mg/L。
进一步地,Sporobolomyces carnicolor MWT-01对Cd抗性达到600mg/L,对Pb抗性达到800mg/L,对Zn抗性达到1000mg/L,对Cu抗性达到1500mg/L。
进一步地,Sporobolomyces carnicolor MWT-01具备多种重金属复合抗性。
进一步地,Sporobolomyces carnicolor MWT-01具备微生物絮凝能力。
本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01能固化土壤中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。
本发明所述Sporobolomyces carnicolor MWT-01能絮凝去除水体中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。
附图说明
图1 Sporobolomyces carnicolor MWT-01显微镜(400X)观察照片。
图2 Sporobolomyces carnicolor MWT-01平板菌落正面平板观察照片及其菌落形成的白色印迹镜像。
图3 Sporobolomyces carnicolor MWT-01基于26S rRNA基因序列比对结果构建的Neighbor-Joining系统发育树。
图4 Sporobolomyces carnicolor MWT-01在不同浓度重金属PDA培养基中生长曲线。
图5 Sporobolomyces carnicolor MWT-01生长期与絮凝活性的关系。
图6 Sporobolomyces carnicolor MWT-01絮凝去除水体中重金属效率。
图7 Sporobolomyces carnicolor MWT-01影响土壤pH值趋势
图8 Sporobolomyces carnicolor MWT-01固化土壤中重金属效率。
具体实施方式
实施例 1
(1)5g锰矿尾矿渣溶于20mL 0.9%的无菌NaCl溶液,25℃条件下,摇床中100rpm条件下振荡10min,静置20min;
(2)取1mL悬浮液加入含Mn 4000mg/L,含Cd 100mg/L、Pb 100mg/L、Zn 100mg/L和Cu100mg/L的无菌水中,25℃条件下,摇床中100rpm条件下振荡6h;
(3)取1mL反应液稀释103倍,取200µL培养液涂布于PDA固体培养基,25℃条件下,培养2-7d;
(4)挑取单菌落,接种到PDA液体培养基,25℃条件下,培养2-5d;
吸取100µL培养液,接种到含不同浓度Mn、Cd、Pb、Zn、或Cu的PDA液体培养基中,进行Mn、Cd、Pb、Zn、Cu抗性测定。
所筛选微生物Sporobolomyces carnicolor MWT-01,如图1、图2所示。
通过对所筛选微生物进行核酸提取并进行26S rRNA基因序列比对构建Neighbor-Joining系统发育树,同时进行微生物碳源氧化和碳源利用分析,鉴定所筛选微生物为Sporobolomyces carnicolor,并命名为Sporobolomyces carnicolor MWT-01。如图3,表1、表2.
实施例 2
(1)选取对Mn、Cd、Pb、Zn、Cu具备优良抗性的微生物,25℃条件下培养2-7d,进行微生物扩增;
(2)2mL菌液加入98mL含4g/L高岭土和0.5g/LCaCl2溶液中;
(3)反复振荡10-20次后,静置5min,取5mL上清液550nm处测量OD值,检测微生物絮凝率。如图5所示,由图可知Sporobolomyces carnicolor MWT-01在5-7天生长期,絮凝率迅速增加,并达到最大。
(4)选取絮凝率高的微生物再次进行重金属抗性实验,筛选获得的微生物Sporobolomyces carnicolor MWT-01 Mn抗性达到10000mg/L,Cd抗性达到600mg/L,Pb抗性达到800mg/L,Zn抗性达到1000mg/L,Cu抗性达到1500mg/L,如图4所示。
实施例 3
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养7天。
(2)含Sporobolomyces carnicolor MWT-01菌体的PDA液体培养基加入5mg/LCaCl2。
(3)向含150mg/L Mn,100mg/L Cd和100mg/L Pb、50mg/L Zn和50mg/L Cu的水体投用含Sporobolomyces carnicolor MWT-01的培养基,投用量2.5mL/L,Sporobolomycescarnicolor MWT-01浓度为2*109cfu/ml。
(4)Mn、Cd、Pb、Zn、Cu凝去除率分别是82.1%、82.7%、92.3%、100%、100%。
实施例 4
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养7天。
(2)含Sporobolomyces carnicolor MWT-01菌体的PDA液体培养基加入3mg/LCaCl2。
(3)向含0-250mg/L Mn、Cd、Pb、Zn、Cu的水体投用含Sporobolomyces carnicolorMWT-01的培养基,投用量1mL/L,Sporobolomyces carnicolor MWT-01浓度为2.5*109cfu/ml。
(4)由图6可知,Sporobolomyces carnicolor MWT-01能有效絮凝去除水体中0-250mg/L Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。
实施例 5
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养2天。
(2)分别在第1天、第10天和第30天向重金属污染土壤施用含Sporobolomycescarnicolor MWT-01的培养基,Sporobolomyces carnicolor MWT-01施用浓度为1.2*109cfu/ml,施用量为1mL/Kg。对比实验,分别在第1天、第10天和第30天向重金属污染土壤施用不含微生物的培养基,施用量为20mL/Kg。
(3)测定土壤pH值,由图7可知Sporobolomyces carnicolor MWT-01在不同施用期对土壤pH值影响显著,随着Sporobolomyces carnicolor MWT-01的使用,土壤pH值逐渐升高。
(4)使用BCR连续提取法分析土壤重金属形态,计算施用Sporobolomycescarnicolor MWT-01后土壤重金属固化效率。
(5)相比未施用Sporobolomyces carnicolor MWT-01,第30天后,土壤Mn,Cd,Pb,Zn,Cu固化率分别提高了72.2%、62.7%、53.3%、62.3%、42.7%。
实施例 6
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养5天。
(2)分别在第1天、第10天和第30天向重金属污染土壤施用含Sporobolomycescarnicolor MWT-01的培养基,Sporobolomyces carnicolor MWT-01施用浓度为2.0*109cfu/ml,施用量为0.5mL/Kg。对比实验,分别在第1天、第10天和第30天向重金属污染土壤施用不含微生物的培养基,施用量为5mL/Kg。
(3)使用BCR连续提取法分析土壤重金属形态,计算施用Sporobolomycescarnicolor MWT-01后土壤重金属固化效率。
(4)相比未施用Sporobolomyces carnicolor MWT-01,第30天后,土壤Mn,Cd,Pb,Zn,Cu固化率分别提高了78.3%、69.3%、59.5%、69.8%、71.2%。
(5)对比施用第10天和第30天后,Sporobolomyces carnicolor MWT-01对土壤重金属固化率,由图8可知随着Sporobolomyces carnicolor MWT-01的施用,Sporobolomycescarnicolor MWT-01对Mn、Cd、Pb、Zn、Cu固化效率显著增加。
实施例 7
(1)Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养6天。
(2)含Sporobolomyces carnicolor MWT-01菌体的PDA液体培养基加入2.5mg/LCaCl2。
(3)向含50mg/L Mn,100mg/L Cd和50mg/L Pb的水体投用含Sporobolomycescarnicolor MWT-01的培养基,投用量1.5mL/L,Sporobolomyces carnicolor MWT-01浓度为2.3*109cfu/ml。
(4)Mn、Cd、Pb絮凝去除率分别是100%、88.7%、100%。
Claims (8)
1.一种重金属抗性微生物,其特征在于,所述重金属抗性微生物为Sporobolomycescarnicolor MWT-01,保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国,武汉,武汉大学),保藏编号:CCTCC NO:M 2018294。
2.权利要求1所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用。
3.根据权利要求2所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用,其特征在于,将Sporobolomyces carnicolor MWT-01使用PDA液体培养基培养,收集含有活菌体的菌液,制备成微生物固化剂,应用于污染土壤重金属固化。
4.根据权利要求2所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用,其特征在于,将Sporobolomyces carnicolor MWT-01使用PDA液体培养基培养,收集含有活菌体的菌液,制备成微生物絮凝剂,应用于污染水体重金属絮凝去除。
5.根据权利要求3所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用,其特征在于,将Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养2-4天,收集菌液,Sporobolomyces carnicolor MWT-01浓度为0.5-2.0*109cfu/ml,用于固化土壤中重金属,微生物固化剂施用量为0.5-1mL/Kg。
6.根据权利要求4所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用,其特征在于,将Sporobolomyces carnicolor MWT-01在PDA液体培养基中培养5-7天,收集菌液,Sporobolomyces carnicolor MWT-01浓度为1.5-3.0*109cfu/ml,用于絮凝去除水体中重金属,微生物絮凝剂投用量为0.1-2mL/L。
7.根据权利要求5所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用,其特征在于,将Sporobolomyces carnicolor MWT-01作为重金属固化剂施用于土壤,施用时间为第1天、第10天和第30天。
8.根据权利要求1、3和4所述重金属抗性微生物在修复Mn、Cd、Pb、Zn、Cu污染土壤和水体方面的应用,其特征在于,将Sporobolomyces carnicolor MWT-01可用于固化土壤中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu,絮凝去除水体中Mn、Cd、Pb、Zn、Cu。
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