CN108485976A - 一种重金属抗性微生物的筛选方法 - Google Patents

一种重金属抗性微生物的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物筛选的技术领域，并公开了一种重金属抗性微生物的筛选方法。该方法包括：(a)采集被重金属污染的原位土壤将其分为两份，其中一份预处理后获得原位土壤的浸提液，在该浸提液中添加三羧酸循环底物，并维持添加前后的pH值不变，以此获得培养基基液，将该培养基基液分为两部分，一部分经高压蒸汽灭菌后作为液体培养基，另外一部分作为固体培养基；(b)采用稀释涂布平板法将另外一份原位土壤中的微生物分离获得多个单菌落，从中挑选出所需的菌落并接种到液体培养基中培养，然后保存。通过本发明，获取更多常规方法无法筛选的微生物。

Description

一种重金属抗性微生物的筛选方法
技术领域
本发明属于微生物筛选的技术领域，更具体地，涉及一种重金属抗性微生物的筛选方法。
背景技术
2014年，国家环境保护部、国土资源部联合公布的全国土壤污染状况公报显示，中国土壤污染物点位超标率为16.1％，而其中重金属污染占比超过82.8％，土壤环境状况整体形势较为严峻、重金属污染防治已到了刻不容缓的地步。重金属不能自然降解，其污染具有隐蔽、持续、不可逆的特点，对土壤、大气、水体环境造成了严重的破坏。同时，由于具有高流动性，重金属极易随农产品或受污染水体进入食物链，已严重威胁人类和动物的健康。严峻的重金属污染形势，需求高效、经济的治理手段。微生物可以通过自身生理活动对土壤中的重金属进行吸附、积累和转化，直接或间接影响土壤重金属的行为与归宿；同时，它们与植物具有良好的协同作用，兼具修复土壤重金属污染的能力，两者结合的修复方式，被认为是最具有前途的土壤重金属污染治理技术之一。然而，由于目前99％的微生物尚未纯培养，筛选技术的落后严重制约着微生物修复技术的发展。因此，加强对重金属污染土壤微生物的研究，开发新的筛选技术，对于保障土地可持续利用开发和生态安全，具有重要的科学意义。
环境中大部分微生物不可培养，与微生物之间微妙的相互作用有关，许多微生物的生长必须依赖其他多种微生物的相互协调，其对营养条件的要求通常也非常严格。许多微生物不能直接以常规的碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖等为碳源，而必须依靠其他微生物的代谢产物才能维持生存，因此传统的筛选方式下，这些微生物都不能生长，此外，由于微生物遗传稳定性较差，微生物种群间存在频繁的水平基因转移，致使按照这种方式获得的微生物已经不是纯粹的土著微生物，在实际土壤修复工程中与土著微生物相比没有竞争优势，往往难以维持有效的数量级。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种重金属抗性微生物的筛选方法，该方法通过在土壤浸提液中添加三羧酸循环底物作为微生物的通用碳源，使得所有微生物种群都可以直接获得碳源，不必通过其他微生物的代谢获得，由此解决单菌落不能生长和微生物基因转移的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明，提供了一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(a)采集被重金属污染的原位土壤，并将其分为两份，其中一份进行预处理后获得所述原位土壤的浸提液，在该浸提液中添加三羧酸循环底物为微生物提供通用碳源，以此获得培养基基液，其中，所述浸提液在添加三羧酸循环底物的前后pH值不变，将所述培养基基液分为两部分，一部分经高压蒸汽灭菌后保存作为液体培养基，另外一部分用于制备固体培养基；
(b)采用稀释法将另外一份原位土壤中的微生物分离后涂布在所述固体培养基上，由此在该固体培养基上获得多个单菌落，从多个单菌落中挑选出所需的菌落并接种到所述液体培养基中培养，然后保存，至此完成微生物的筛选。
进一步优选地，在步骤(a)中，所述预处理包括下列子步骤，
(a1)将所述原位土壤过筛去除杂质；
(a2)将过筛后的原位土壤溶解在去离子水中形成悬浊液；
(a3)将所述悬浊液进行高压蒸汽灭菌，使得所述原位土壤中的可溶性营养物质和重金属充分溶解，以获得接近原位土壤的营养条件和重金属胁迫的土壤初提液；
(a4)将步骤(a3)中获得的土壤初提液分别依次采用棉布和滤纸过滤，过滤后的溶液即为所述原位土壤的浸提液。
进一步优选地，在步骤(a)中，所述高压蒸汽灭菌的温度为121℃，时间为15min～30min。
进一步优选地，在步骤(a3)中，所述高压蒸汽灭菌的的温度为121℃,时间为不少于30min。
进一步优选地，在步骤(a)中，所述培养基基液中的三羧酸循环底物的浓度为3g/L～10g/L。
进一步优选地，在步骤(b)中，所述稀释法包括下列子步骤：
(b1)将所述原位土壤溶解在无菌水中，并加入无菌玻璃珠震荡形成悬浊液，以此使得微生物群落充分分散于水中；
(b2)取步骤(b1)获得的悬浊液的上清液，在该上清液中加入去离子水进行充分稀释，由此形成稀释液；
(b3)将所述稀释液涂布在所述固体培养基中培养，从而在该固体培养基上获得多个分散的单菌落。
进一步优选地，步骤(a)中，所述三羧酸循环底物优选采用琥珀酸或苹果酸。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比能够取得下列有益效果：
1、本发明通过土壤浸提液为基础，模拟原位土壤中的营养条件，可减少常规富营养培养基对微生物群落的干扰，降低微生物之间水平基因转移对筛选结果的影响，获得更纯粹的土著微生物；
2、本发明之所以选择采用三羧酸循环底物作为微生物的通用碳源，是因为其是需氧生物体内普遍存在的代谢途径的底物，所以其必然能被所有好氧微生物利用；
3、本发明通过采用三羧酸循环底物作为微生物的通用碳源，为不能利用常规碳源、必须依赖其他微生物代谢产物生存的微生物提供了必要的碳源，可获得更多的传统方法不可培养的微生物种类；
4、本发明共采用两次高压蒸汽灭菌，步骤(a)中的高压灭菌的作用是杀死培养基中的微生物，防止对筛选产生干扰，由于部分微生物，如细菌的芽孢，可以在极端环境中生存，所以需要高温高压，并保持15分钟；步骤(a3)中的高压灭菌的目的是，在高温环境下，使土壤中的营养物质和重金属充分溶解释放到土壤初提液中；
5、本发明提供的方法成本低廉，操作简便，是对传统筛选方法进行了重要补充和改进。
附图说明
图1是按照本发明的优选实施例所构建的筛选方法的流程图；
图2是按照本发明的优选实施例所构建的不同培养基筛选结果对比的韦恩图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的目的是提供一种新的重金属抗性微生物的筛选方法，包括其培养基配方、具体操作步骤，具体技术方案如下：
(1)本发明的培养基为土壤浸提液-三羧酸循环底物，配方由原位土壤浸提液和三羧酸循环底物组成，制备过程如下：采集重金属污染的原位土壤，过筛，取400g，加入960mL去离子水，121℃高压灭菌，达到压力后至少保持30min，棉布过滤，然后用滤纸过滤即土壤浸提液；
取土壤浸提液测定pH，加入三羧酸循环底物，使得浸提液中三羧酸循环底物的浓度为3～10g/L，以NaOH调节pH至与原土壤浸提液相同，121℃高压蒸汽灭菌15min～30min，4℃保存，此为液体培养基；高压蒸汽灭菌前加入15g/L琼脂糖倒入培养皿中冷却凝固，此为固体培养基，其中，加入三羧酸循环底物的浓度为3～10g/L，是为了提供充足的碳源，同时避免因过量而产生抑制作用。
保持浸提液添加三羧酸循环底物前后pH值不变是因为土壤pH是土壤中微生物群落的关键影响因子，其变化会直接影响微生物的生存与繁殖，因此，提供与原土壤环境中较为一致的pH，可满足绝大部分微生物对土壤pH的要求，也是部分微生物能生存与繁殖、从而被筛选出来的必要前提。
(2)本发明的筛选步骤主要包括微生物的分散，稀释涂布平板以及单菌落挑取、培养及保存，具体为：取10g土样，加入90mL无菌水，加入1g无菌玻璃珠，震荡2h；取200μL上清液，加入1.8mL去离子水，依次稀释102、103、104、105倍，取200μL涂布于上述固体培养基平板上，28℃培养72h,目的，获得在固体培养基平板上获得单菌落，根据菌落性状、颜色等特征，挑取不同的菌落，将所需的菌落(根据实际需求选取)接种于上述液体培养基中，28℃震荡，防止微生物成团或贴壁生长，震荡速度为180～220rpm培养至菌液浑浊；取200μL菌液，加入25％甘油，-80℃保存。
下面将结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明。
实施方案1：重金属污染土壤微生物筛选
实验土样采集于某电镀企业搬迁后的污染土壤，主要污染重金属为镍和铜。土样采集后，回实验室立即放于-20℃保存，以杀死土壤中的昆虫和植物组织以及一些病毒，处理10小时之后，于4℃解冻，多余的土样置于4℃冰箱保存。
实施例1
取适量土壤按下列步骤进行重金属抗性微生物筛选，
(1)本发明的培养基为土壤浸提液-琥珀酸培养基(SES)，配方由原位土壤浸提液和琥珀酸组成，制备过程如下：采集重金属污染的原位土壤，过筛，取400g，加入960mL去离子水，121℃高压灭菌，达到压力后至少保持30min，棉布过滤，然后用滤纸过滤即土壤浸提液；
取土壤浸提液测定pH，加入琥珀酸使得其在浸提液中浓度为5g/L，以NaOH调节pH至与原土壤浸提液相同，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存，此为液体培养基；高压蒸汽灭菌前加入15g/L琼脂糖倒入培养皿中冷却凝固，此为固体培养基；
(2)取10g土样，加入90mL无菌水，加入1g无菌玻璃珠，震荡2h；取200μL上清液，加入1.8mL去离子水，依次稀释102、103、104、105倍，取200μL涂布于SES固体培养基平板上，28℃培养72h,目的，获得在固体培养基平板上获得单菌落，根据菌落性状、颜色等特征，挑取不同的菌落，接种于SES液体培养基中，28℃震荡，防止微生物成团或贴壁生长，震荡速度为180rpm培养至菌液浑浊；取200μL菌液，加入25％甘油，-80℃保存。
除SES培养基外，设置LB培养基(培养基成分：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)、PDA培养基(培养基配方：马铃薯200g煮烂、过滤，加入20g葡萄糖，定容至1L)及不含琥珀酸的土壤浸提液(SE)作为对照。
经测序鉴定，本发明所用SES培养基组共筛选获得微生物15株，其中真菌4株，细菌11株；不含琥珀酸的SE对照组获得微生物3株，其中真菌1株，细菌2株；LB培养基是细菌专用的培养基，该组共获得细菌8株；PDA是真菌专用培养基，该组共获得真菌5株。图2是按照本发明的优选实施例所构建的不同培养基筛选结果对比的韦恩图，如图2所示，本发明所用筛选体系，可获得更多的微生物，尤其是细菌。SES组共有5株细菌是其独有的，未在其他任何组筛选到；对比SE组的结果说明，作为通用碳源，琥珀酸满足了更多微生物的生长条件，在筛选过程中起了关键作用。
实施方案2：重金属抗性植物根际微生物筛选
实验采样区域某古铜矿遗址，该区域主要为重金属铜、锌污染。选择当地典型铜指示植物海洲香薷，连同其根际土壤一起采集带回实验室。收集根际土壤，经冷冻处理后，参照本发明所述流程，采用SES培养基体系进行抗性微生物筛选，并对其生态功能进行鉴定。
实施例2
取适量土壤按下列步骤进行重金属抗性微生物筛选，
(1)本发明的培养基为土壤浸提液-苹果酸培养基(SEM)，配方由原位土壤浸提液和苹果酸组成，制备过程如下：采集重金属污染的原位土壤，过筛，取400g，加入960mL去离子水，121℃高压灭菌，达到压力后至少保持30min，棉布过滤，然后用滤纸过滤即土壤浸提液；
取土壤浸提液测定pH，加入苹果酸使得其在浸提液中浓度为5g/L，以NaOH调节pH至与原土壤浸提液相同，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存，此为液体培养基；高压蒸汽灭菌前加入15g/L琼脂糖倒入培养皿中冷却凝固，此为固体培养基；
(2)取10g土样，加入90mL无菌水，加入1g无菌玻璃珠，震荡2h；取200μL上清液，加入1.8mL去离子水，依次稀释102、103、104、105倍，取200μL涂布于SES固体培养基平板上，28℃培养72h,目的，获得在固体培养基平板上获得单菌落，根据菌落性状、颜色等特征，挑取不同的菌落，接种于SES液体培养基中，28℃震荡，防止微生物成团或贴壁生长，震荡速度为180rpm培养至菌液浑浊；取200μL菌液，加入25％甘油，-80℃保存。
实施例3
取适量土壤按下列步骤进行重金属抗性微生物筛选，
(1)本发明的培养基为土壤浸提液-苹果酸培养基(SEM)，配方由原位土壤浸提液和苹果酸组成，制备过程如下：采集重金属污染的原位土壤，过筛，取400g，加入960mL去离子水，121℃高压灭菌，达到压力后至少保持50min，棉布过滤，然后用滤纸过滤即土壤浸提液；
取土壤浸提液测定pH，加入苹果酸使得其在浸提液中浓度为3g/L，以NaOH调节pH至与原土壤浸提液相同，121℃高压蒸汽灭菌30min，4℃保存，此为液体培养基；高压蒸汽灭菌前加入15g/L琼脂糖倒入培养皿中冷却凝固，此为固体培养基；
(2)取10g土样，加入90mL无菌水，加入1g无菌玻璃珠，震荡2h；取200μL上清液，加入1.8mL去离子水，依次稀释102、103、104、105倍，取200μL涂布于SES固体培养基平板上，28℃培养72h,目的，获得在固体培养基平板上获得单菌落，根据菌落性状、颜色等特征，挑取不同的菌落，接种于SES液体培养基中，28℃震荡，防止微生物成团或贴壁生长，震荡速度为220rpm培养至菌液浑浊；取200μL菌液，加入25％甘油，-80℃保存。
实施例4
取适量土壤按下列步骤进行重金属抗性微生物筛选，
(1)本发明的培养基为土壤浸提液-琥珀酸培养基(SES)，配方由原位土壤浸提液和琥珀酸组成，制备过程如下：采集重金属污染的原位土壤，过筛，取400g，加入960mL去离子水，121℃高压灭菌，达到压力后至少保持30min，棉布过滤，然后用滤纸过滤即土壤浸提液；
取土壤浸提液测定pH，加入琥珀酸使得其在浸提液中浓度为10g/L，以NaOH调节pH至与原土壤浸提液相同，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存，此为液体培养基；高压蒸汽灭菌前加入15g/L琼脂糖倒入培养皿中冷却凝固，此为固体培养基；
(2)取10g土样，加入90mL无菌水，加入1g无菌玻璃珠，震荡2h；取200μL上清液，加入1.8mL去离子水，依次稀释102、103、104、105倍，取200μL涂布于SES固体培养基平板上，28℃培养72h,目的，获得在固体培养基平板上获得单菌落，根据菌落性状、颜色等特征，挑取不同的菌落，接种于SES液体培养基中，28℃震荡，防止微生物成团或贴壁生长，震荡速度为180rpm培养至菌液浑浊；取200μL菌液，加入25％甘油，-80℃保存。
实施例2中，经测序鉴定，共获得10株不同的微生物，其中8株细菌，2株真菌。对其生态功能的鉴定发现，其中4株具有分泌铁载体的功能，7株具有固氮作用，8株具有分泌植物激素吲哚乙酸的功能。这些结果表明，获得的微生物菌株具有良好的植物促生能力，在提高植物生物量、强化植物修复效率方面具有较好的潜力。同时，这些微生物对重金属铜具有良好的抗性，不同菌株耐受重金属浓度存在一定差异(200-800mg/L)。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(a)采集被重金属污染的原位土壤，并将其分为两份，其中一份进行预处理后获得所述原位土壤的浸提液，在该浸提液中添加三羧酸循环底物为微生物提供通用碳源，以此获得培养基基液，其中，所述浸提液在添加三羧酸循环底物的前后pH值不变，将所述培养基基液分为两部分，一部分经高压蒸汽灭菌后保存作为液体培养基，另外一部分用于制备固体培养基；
(b)采用稀释法将另外一份原位土壤中的微生物分离后涂布在所述固体培养基上，由此在该固体培养基上获得多个单菌落，从多个单菌落中挑选出所需的菌落并接种到所述液体培养基中培养，然后保存，至此完成微生物的筛选。
2.如权利要求1所述的一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述预处理包括下列子步骤，
(a1)将所述原位土壤过筛去除杂质；
(a2)将过筛后的原位土壤溶解在去离子水中形成悬浊液；
(a3)将所述悬浊液进行高压蒸汽灭菌，使得所述原位土壤中的可溶性营养物质和重金属充分溶解，以获得接近原位土壤的营养条件和重金属胁迫的土壤初提液；
(a4)将步骤(a3)中获得的土壤初提液分别依次采用棉布和滤纸过滤，过滤后的溶液即为所述原位土壤的浸提液。
3.如权利要求1或2所述的一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述高压蒸汽灭菌的温度为121℃，时间为15min～30min。
4.如权利要求2所述的一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，在步骤(a3)中，所述高压蒸汽灭菌的的温度为121℃,时间为不少于30min。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述培养基基液中的三羧酸循环底物的浓度为3g/L～10g/L。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述稀释法包括下列子步骤：
(b1)将所述原位土壤溶解在无菌水中，并加入无菌玻璃珠震荡形成悬浊液，以此使得微生物群落充分分散于水中；
(b2)取步骤(b1)获得的悬浊液的上清液，在该上清液中加入去离子水进行充分稀释，由此形成稀释液；
(b3)将所述稀释液涂布在所述固体培养基中培养，从而在该固体培养基上获得多个分散的单菌落。
7.如权利要求1-6任一项所述的一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，步骤(a)中，所述三羧酸循环底物优选采用琥珀酸或苹果酸。
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