WO2004065413A1 - 新規ｋ０１−ｂ０１７１物質およびその製造法 - Google Patents

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rhodococcus
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Satoshi Omura
Hiroshi Tomoda
Masato Iwatsuki
Yoko Takahashi
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The Kitasato Institute
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/60—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation occurring through the 4-amino group of 2,4-diamino-butanoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel ⁇ 01- ⁇ 0171 substance having antituberculous activity and a method for producing the same, wherein the ⁇ 01- ⁇ 0171 substance is derived from the ⁇ 01- ⁇ 0171 one substance and / or the ⁇ 01-BO171-C substance. It is related to a substance useful for prevention and treatment as an antituberculosis drug. Background art
  • the present invention extends to a novel K0 1 -B 0 171 substance that has found an effective antituberculosis drug against M. tuberculosis that can satisfy such expectations, and a method for producing the same.
  • the present invention also provides the following formula [II]
  • the present invention further includes in particular the following formula [I]
  • a microorganism belonging to the genus Orococcus and having the ability to produce ⁇ 0 1— ⁇ 0 1 7 1 — ⁇ substance is cultured in a medium, and ⁇ 0 1 — ⁇ 0 1 7 1— ⁇ 0 1- ⁇ 0 1 7 1 1. Collect ⁇ substances from the culture. ⁇ 0 1 ⁇ ⁇ 0 1 7 1 1. Provide a method for producing ⁇ substances.
  • a microorganism belonging to the genus Orococcus and having the ability to produce ⁇ 0 1— ⁇ 0 1 7 1—C substance is cultured in a medium, and ⁇ 0 1 — ⁇ 0 1 7 1— Accumulation of C substance and collection of C substance from the culture ⁇ 0 1- ⁇ 0 1 7 1
  • the present invention further includes cultivating a microorganism having the ability to produce ⁇ 0 1— ⁇ 0 1 7 1— ⁇ substance and ⁇ or ⁇ 0 1- ⁇ 0 1 7 1 ⁇ 0 1- ⁇ 0 1 7 1— Accumulate ⁇ substances and 1 0 1— ⁇ 0 1 7 1— Accumulate C substances from the culture ⁇ 0 1- ⁇ 0 1 7 1 —
  • a method for producing a composition comprising a ⁇ substance and / or ⁇ 0 1 ⁇ 1 0 1 7 1—C substance.
  • the present invention further relates to Rhodococcus sp. ⁇ 0 1 — ⁇ 0 1 7 1 (R) 0 1 — ⁇ 0 1 7 1 — A microorganism having the ability to produce a ⁇ substance. hodococcuss. K 0 1 -B 0 1 7 K FERM BP— 8 2 6 7) K 0 1 -B 0 1 7 1—The production method of the 1-B substance is provided.
  • the present invention further relates to Rhodococcus sp. K 0 1 -B 0 1 7 1 (R hodococcuss ⁇ . K 0 1), a microorganism belonging to the genus Orococcus genus and capable of producing the substance K0 1— B 0 1 7 1—C. -B 0 1 7 K FERM BP— 8 2 6 7) K 0 1 -B 0 1 7 1
  • the present invention further includes a microorganism belonging to the genus Orococcus, having the ability to sacrifice K 0 1—B 0 1 7 1—B substance and N or K 0 1 -B 0 1 7 1 C substance.
  • a method for producing a composition comprising a 1-C substance is provided.
  • the present invention further provides a microorganism which is Rhodococcus sp. K 0 1—B 0 1 71 (Rh 0 d 0 coc c sus sp. K 0 1 -B 0 1 7 FERM BP—826 7).
  • the present invention further provides K 0 1 -B 0 1 7 1 -B substance and K0 1 -B 0 1 7 1 1 C substance, or K 0 1 -B 0 1 7 1- B for use as an antituberculosis drug
  • a composition comprising a substance and a K0 1 -B 0 1 7 1-C substance is provided.
  • K 0 1—B 0 1 7 1—B substance and the K 0 1 —B 0 1 71—C substance of the present invention represented by the formulas [I] and [II], or a composition comprising these substances
  • Microorganisms having the ability to act (hereinafter referred to as “K 0 1—BO 1 71 1 producing bacteria”) belong to the genus Rhodococcus.
  • the present inventors newly isolated Rhodococcus sp. (Rh 0 d 0 c 0 ccuss p.) K 0 1 -B 0 1 7 1 is an example of the strain most effectively used in the present invention.
  • the mycological properties of the Rh odococcuss p. K 0 1 - ⁇ 0 1 71 strain of the present invention are as follows. (I) Morphological properties
  • This strain is composed of sucrose 'nitrate agar, glucose asparagine agar, glycerol asparagine agar, tyrosine agar, oatmeal agar, yeast malt extract agar, nutrient agar, glucose nitrate agar.
  • Medium, Glycerol ⁇ Grows well on calcium malate calcium agar and glucose peptone agar, moderately grows on starch, mineral salt agar and peptone iron agar, Mycelia do not settle. Under observation under a microscope, the cells change from gonococci to cocci, with a size of about 1.1 to 1.4 X 0.7 to 0.8 ⁇ m.
  • Soluble pigment not produced Glycerol Asparagine Agar (I SP)
  • Soluble pigments do not grow otomeal agar (ISP)
  • Soluble pigment Slightly produced, yellow glucose nitrate agar
  • Soluble pigment-producing source Peptone agar
  • L-rhamnose my 0—inositol, schucrose Not used: L-arabinose, rahuinose, melibiose, D-xylose
  • the cell wall diaminopimelic acid is meso-type, and the total microbial sugar contains galactose and arabinose.
  • Cell wall muramic acid is a glycolyl type.
  • the main menaquinone is MK-8 (H 2 ). Contains mycolic acid.
  • Diaminopimelate in the cell wall is meso-type, and all microbial sugars contain galactose and arabinose.
  • Cell wall muramic acid is glycolyl, and the main menaquinone is MK-8 (H 2 ).
  • the cells change from short koji molds to pseudococcal fungi, and the size is about 1.1 to 1.4 X 0.7 to 0.8 m.
  • the colony is orange to brown in color and does not produce melanin, but produces slightly yellow soluble pigment on peptone 'yeast' iron agar.
  • this strain was identified as one species belonging to the genus M. dococcus. This strain is Rho do coc cu s sp. K01—B 0 711, based on the Budapest Treaty on the International Approval of Deposit of Microorganisms in Patent Procedures.
  • K0 1 -B 0 1 71 substance-producing bacterium used in the present invention include the above-mentioned oral dococcus sp. (Rh 0 d 0 c 0 ccuss p.) K 01- B 0 1 71 strain.
  • the fungi are generally mutated in terms of their general characteristics, and are not uniform. Or it is a well-known fact to mutate by artificial mutation means using mutant derivatives, such as N-methyl-N'-nitro-1N-ditroguanidine, ethylmethanesulfonate, etc.
  • Rhodococcus It belongs to the genus Rhodococcus, including naturally occurring mutants as well as mutants, and produces the K 0 1— B 0 1 7 1 substance represented by the above formulas [I] and [II] or a composition of the substance Any strain having capacity can be used in the present invention.
  • the production of the substance K 0 1 -B 0 1 71 according to the present invention is carried out by first culturing a K 0 1 -B 0 1 71 substance producing bacterium belonging to the genus Orococcus in a medium.
  • Nutrient sources suitable for the production of K 0 1 -B 0 1 7 1 substances of the present invention include carbon sources that can be assimilated by microorganisms, nitrogen sources that can be digested, and inorganic salts, vitamins, and the like as necessary.
  • a nutrient medium is used.
  • As the carbon source glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, dextrin, saccharides such as starch, and vegetable oils such as soybean oil are used alone or in combination.
  • peptone, yeast extract, meat extract, soybean flour, cottonseed flour, corn steep liquor, malt extract, casein, amino acids, urea, ammonium salts, nitrates, etc. are used alone or in combination.
  • Others As required Phosphate, magnesium salt, calcium salt, sodium salt, potassium salt, etc.
  • Heavy iron salt such as iron salt, manganese salt, copper salt, cobalt salt, zinc salt, vitamins, etc. K 0 1-B 0 1 7 1 Those suitable for the production of substances are added.
  • the medium may be liquid or solid as long as it contains the above-mentioned nutrient sources. Usually, it is better to use a liquid medium for culture. In the case of small-scale production, culture using a flask is preferable. .
  • the composition of the medium to be used and the medium to be used for production culture may be the same, or may be changed if necessary.
  • the culture temperature can be appropriately changed within the range in which the present K 0 1—B 0 1 7 1 substance-producing bacterium produces the present K 0 1 -B 0 1 7 1 substance, but is usually 6 to 37, preferably 1 Incubate at around 7 ° C.
  • the culture pH is usually 7 to 8, preferably about 7.
  • the culture time varies depending on the culture conditions, but is usually about 4 days.
  • the K 0 1 -B 0 1 71 substances accumulated in the culture thus obtained are usually present in the cultured cells.
  • the means used to collect metabolites from normal microorganism cultures can be used alone or in any order, or Used repeatedly.
  • this K 0 1—B 0 1 7 1 substance it may be collected from the bacterial cell extract.
  • the cells are extracted with organic solvents such as acetone, ethanol or methanol.
  • the substance K 0 1 — B 0 17 1 can be isolated by silica gel column chromatography, Sephadex LH-20, ODS column chromatography or the like.
  • Solubility in solvents Soluble in water, dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol, and ethanol. , Insoluble in acetononitrile, ethyl acetate, black mouth form, and aceton.
  • Red external absorption spectrum Infrared absorption spectrum measured by the bromide-powered Rum tablet method is shown in Fig. 6 and shows a special absorption maximum at Ama X 1 650 cnr 1 .
  • Solubility in solvents Soluble in water, dimethylsulfoxide (DMSO), methanol, and ethanol. Insoluble in acetononitrile, ethyl acetate, black mouth form, and aceton.
  • the K01-BO 1 71—C substance has the chemistry represented by the following formula [II]. It was determined to be a structure.
  • Myc ob acteri um sme gma tis as a tuberculosis bacterium (; storage stock of Kitasato Life Research Institute, Kasato University). Waxman agar medium NaC l 0.5% G lueose 1.0%, Agar r 0.8%) was inoculated at 0.3%. The activity was evaluated by the paper-disc method (thick 6 mm, manufactured by ADVANTECH, Japan), and the inhibition circle was measured after incubation at 27 ° C for 24 hours.
  • the K0 1 -B 0171 1 B substance of the present invention exhibited a 19 mm inhibition circle at 10 ug / disk.
  • the K 0 1 -B 0 1 71 1 C substance of the present invention exhibited an inhibition circle of 18 mm at 10 g / disk.
  • This seed culture is equivalent to a mixture of McFar 1 and No. 0.5 (1% B a C 1 2 solution 0.05 mL, 1% H 2 S0 4 solution 9.95 mL at OD 630 nm. And 10 times diluted (10 times diluted culture solution: 10 7 C FU / mL). Wa k sma n br oth 90 ⁇ LZw e 1 1 dispensed 9 6-well microplate pre-prepared drug dilution series (3.9, 7.8, 1 5. 6, 31.
  • the substance K 01 -B 0171-1 B of the present invention was M IC 3.13 ng / mL
  • the substance K 01 -B 0171 1 C of the present invention was MI C 6.25 g / mL.
  • Jurkat cells cultured in RPM I medium are centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the supernatant is removed overnight, and RPMI medium is added to make the number of cells 5 x 10 5 cells sZm 1.
  • RPMI medium is added to make the number of cells 5 x 10 5 cells sZm 1.
  • the K0 1 -B 0 711 substance of the present invention has a new skeleton and is expected to be useful as a new antituberculosis drug effective against Mycobacterium tuberculosis.
  • FIG. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum (50% methanol in water) of the K 0 1 -B 0 71-B substance of the present invention.
  • FIG. 2 shows the infrared absorption spectrum (potassium bromide tablet method) of substance K01-B 01 71-1 B of the present invention.
  • FIG. 3 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum (heavy water) of the K 0 1 -B 0 1 71 -B substance of the present invention.
  • FIG. 4 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum (heavy water) of the K 01 -B 017 1-B substance of the present invention.
  • FIG. 5 shows the ultraviolet absorption spectrum (50% methanol in water) of the K01-B 0 71-C substance of the present invention.
  • FIG. 6 shows the infrared absorption spectrum (potassium bromide tablet method) of the substance K0 1 -B 0 1 71 1 C of the present invention.
  • FIG. 7 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum [in heavy water-deuterated methanol (3: 2)] of the K01-B 0 71-C substance of the present invention.
  • FIG. 8 shows the force-bonn nuclear magnetic resonance spectrum [in light water single methanol (3: 1)] of the K01-B 0 71 1-C material of the present invention.
  • K 0 1—B 0 1 7 1—B substance and K 0 1 -B 0 1 7 1C substance or K belonging to the genus Rhodococcus having the ability to produce the composition of these substances Microorganisms typified by 0 1 -B 0 1 7 1 strain are cultured in a culture medium, and K 0 1—B 0 1 7 1—B substance and K0 1 -B 0 1 7 1—C substance are contained in the culture medium.
  • the obtained substance or composition is expected to be an effective pharmaceutical agent for the prevention and treatment of tuberculosis because it has antituberculous activity.

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Abstract

本発明は、ロドコッカス属に属し、K01-B0171-B物質及び/又はK01-B0171-C物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養液中にK01-B0171-B物質及び/又はK01-B0171-C物質を蓄積せしめ、該培養物からK01-B0171-B物質及び/又はK01-B0171-C物質を採取する。得られたK01-B0171-B物質、K01-B0171-C物質、またはこれらの物質の組成物は抗結核薬の医薬品として有用であると期待される。

Description

明細書 新規 K 01 -Β 0171物質およびその製造法 技術分野
本発明は、 抗結核菌活性を有する新規 Κ01— Β 0171物質およびその製 造法に関し、 該 Κ 01 - Β 0171物質は Κ01 -Β 0171一 Β物質及び 又 は Κ0 1— BO 171—C物質からなる抗結核薬として予防、 治療に有用な物質 に関するものである。 背景技術
結核菌には全人類のおよそ 1/3が感染していると推定され、 年間 300万 人が結核症により死亡していることが報告されている。 発展途上国はもちろんの こと、 近年、 先進国 ίこおいても学校、 医療機関、 老人関連施設での集団感染およ ぴエイズ患者の日和見感染症の原因菌として同定さるなど、 人類を脅かす重大な 問題と再認識されている。 現在、 抗結核薬として、 イソ二アジド、 リファンピシ ン、 カナマイシンやエタンプトールなどが使用されているが、 耐性菌や副作用た とえばアレルギーゃ腎 ·肝障害などの問題から、 異なる骨格あるいは異なる作用 機構の新しい抗結核薬の開発が強く望まれている （A. Mau r e en Rou h i、 Chemi c a l and Eng i ne e r i ng News、 5月 1 7曰号、 pp. 52 - 69 , 1999年） 。 発明の開示
かかる実情において、 抗結核薬としてアレルギーゃ腎 '肝障害などの問題を 解決し得る作用機構を有する物質が見出せれば、 新しい医薬品として人類への福 音をもたらすことが期待される。 本発明はこのような期待を満足し得る結核菌に対して有効な抗結核薬を見出 した新規 K0 1 -B 0 1 71物質およびその製造法を ^洪するものである。
本発明者らは上記のごとき課題を解決すベく微生物の生産する代謝産物につ いて種々研究を続けた結果、 土壌から新たに分離された K01— B O 1 7 1菌株 の培養物中に抗真菌活性を有する物質が産生されることを見いだした。 次いで、 該培養物中から抗真菌活性を示す活性物質を分離精製した結果、 後記の式 [I] および [I I] で示される化学構造を有する物質を見いだした。 このような化学 構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、 各々本物質を K0 1 -B 0 1 7 1— B物質および K0 1 -B 0 1 71一 C物質と称することにし、 そ の総称を K0 1— BO 1 71物質と称することにした。
本発明は、 かかる知見に基づいて完成されたものであって、 下記式 [I]
Figure imgf000003_0001
で表される化合物である K 01 -B 01 71一 B物質を提供するものである。
本発明はまた、 下記式 [I I]
Figure imgf000004_0001
で表される化合物である K 01 -B 0171一 C物質を提供するものである。
本発明は更に、 特に下記式 [I]
Figure imgf000004_0002
CI] で表される KO 1— B 01 71— B物質及び特に下記式 [I I]
Figure imgf000005_0001
I で表される K 0 1 - Β 0 1 7 1一 C物質からなる Κ 0 1 - Β 0 1 7 1物質の組成 物を提供するものである。
本発明は更に、 口ドコッカス属に属し、 Κ 0 1— Β 0 1 7 1 —Β物質を生産 する能力を有する微生物を培地で培養し、 培養液中に Κ 0 1 — Β 0 1 7 1— Β物 質を蓄積せしめ、 該培養物から Κ 0 1 - Β 0 1 7 1一. Β物質を採取する Κ 0 1 ― Β 0 1 7 1一 Β物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、 口ドコッカス属に属し、 Κ 0 1— Β 0 1 7 1— C物質を生産 する能力を有する微生物を培地で培養し、 培養液中に Κ 0 1 — Β 0 1 7 1—C物 質を蓄積せしめ、 該培養物から Κ 0 1 - Β 0 1 7 1一 C物質を採取する Κ 0 1一 Β 0 1 7 1一 C物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、 口ドコッカス属に属し、 Κ 0 1— Β 0 1 7 1— Β物質及び Ζ 又は Κ 0 1 - Β 0 1 7 1一 C物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し 、 培養液中に Κ 0 1 - Β 0 1 7 1— Β物質及びノ又は Κ 0 1— Β 0 1 7 1— C物 質を蓄積せしめ、 該培養物から Κ 0 1 - Β 0 1 7 1 — Β物質及び 又は Κ 0 1一 Β 0 1 7 1—C物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、 口ドコッカス属に属し、 Κ 0 1 — Β 0 1 7 1 — Β物質を生産 する能力を有する微生物が、 ロドコッカス エスピー Κ 0 1 — Β 0 1 7 1 ( R h o d o c o c c u s s . K 0 1 -B 0 1 7 K FERM BP— 8 2 6 7 ) である K 0 1 -B 0 1 7 1—B物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、 口ドコッカス属に属し、 K0 1— B 0 1 7 1—C物質を生産 する能力を有する微生物が、 ロドコッカス エスピー K 0 1 -B 0 1 7 1 (R h o d o c o c c u s s ρ. K 0 1 - B 0 1 7 K FERM BP— 8 2 6 7 ) である K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、 口ドコッカス属に属し、 K 0 1— B 0 1 7 1— B物質及びノ 又は K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質を生產する能力を有する微生物が、 口ドコッ力 ス エスピ一 K 0 1—B 0 1 7 1 (Rh o d o c o c c u s s p. K 0 1— B 0 1 7 1、 FERM BP— 82 67) である KO I— B 0 1 7 1— B物質及 び/又は K 0 1 -Β 0 1 7 1—C物質からなる組成物の製造法を提供するもので ある。
本発明は更に、 ロドコッカス エスピー K 0 1— B 0 1 7 1 (Rh 0 d 0 c o c c u s s p. K 0 1 -B 0 1 7 FERM BP— 826 7) である 微生物を提供するものである。
本発明は更に、 抗結核薬として使用するための K 0 1 -B 0 1 7 1 - B物質 及び K0 1 -B 0 1 7 1一 C物質、 または K 0 1 -B 0 1 7 1— B物質と K0 1 -B 0 1 7 1—C物質からなる組成物を瑛供するものである。
前記の式 [ I ] および [ I I] で表される本発明の K 0 1—B 0 1 7 1— B 物質および K 0 1 -B 0 1 71—C物質またはこれら物質からなる組成物を生産 する能力を有する微生物 （以下 「K 0 1— B O 1 7 1物質生産菌」 と称する） は 、 口ドコッカス属 （Rh o d o c o c c u s) に属するが、 例えば本発明者らが 新たに分離したロド 3ッカス エスピー （Rh 0 d 0 c 0 c c u s s p. ) K 0 1 -B 0 1 7 1菌株が、 本発明において最も有効に使用される菌株の一例であ o
本発明の口ドコヅカス エスピー （Rh o d o c o c c u s s p. ) K 0 1 -Β 0 1 7 1菌株の菌学的性状を示すと、 以下のとおりである。 ( I ) 形態的性質
本菌株は、 シュ一クロース '硝酸塩寒天培地、 グルコース .ァスパラギン寒 天培地、 グリセロール 'ァスパラギン寒天培地、 チロシン寒天培地、 オートミー ル寒天培地、 イースト ·麦芽エキス寒天培地、 栄養寒天培地、 グルコース .硝酸 塩寒天培地、 グリセロール■ リンゴ酸カルシウム寒天培地及びグルコース ·ぺプ トン寒天培地上では良好に生育し、 スターチ ·無機塩寒天培地及びぺプトン ·ィ —スト ·鉄寒天培地上では中程度に生育し、 気菌糸は着生しない。 顕微鏡下の観 察では、 細胞は短棹菌から凝球菌状となり、 その大きさは約 1. 1〜1. 4 X 0 . 7〜0. 8^mである。
(I I)各種培地上での性状
ィー · ビー， シヤーリング （E. B. S h i r 1 i n g) とデ一 ·ゴッ トリ —ブ （D. Go t t l i eb) の方法 （インターナショナル · ジャーナル ·ォブ • システィマティック 'バクテリオ口ジ一、 16巻、 313頁、 1966年） に よって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。 色調は標準色として、 カラー， ハーモニー■マニュアル第 4版 （コンテナ一 'コーポレーション 'ォブ 'ァメリ 力 ·シカゴ、 1 958年） を用いて決定し、 色票名とともに括弧内にそのコード を併せて記した。 以下は特記しない限り、 27で、 2週間目の各培地における観 察の結果は下記のとおりである。
培養性状 シュ一クロース ·硝酸塩寒天培地
生 育 良好に生育、 ライトアプリコット （4 e a) 裏 面 フレッシュピンク （ 4 c a )
可溶性色素 産生しない グルコース ·ァスパラギン寒天培地
生 育 良好に生育、 フレッシュピンク （4 c a) 裏 面 ライトメロンイエロ一 （3 e a)
可溶性色素 産生しない グリセロール ·ァスパラギン寒天培地 （ I SP)
生 育 良好に生育、 ビスク一 （3 e c)
裏 面 ライトタン （3gc)
可溶性色素 産生しない スターチ ·無機塩寒天培地 （I SP)
生 育 中程度に生育、 パールピンク （3 c a) 裏 面 パールピンク （ 3 c a)
.. 可溶性色素 産生しない チロシン寒天培地 （ I SP)
生 育 良好に生育、 フレッシュピンク （4 c a) 裏 面 フレッシュピンク （4 c a)
可溶性色素 產生しない ォ—トミール寒天培地 （ I SP)
生 育 良好に生育、 ライトアプリコッ ト （4 e a) 裏 面 ライトメロンイエロ一 （3 e a)
可溶性色素 産生しない イースト ·麦芽エキス寒天培地 （I SP)
生 育 良好に生育、 ライトアプリコット （4 e a) 裏 面 ライトアンバー （3 i c)
可溶性色素 産生しない 栄養寒天培地
' 生 育 良好に生育、 フレッシュピンク （ 4 c a ) 裏 面 パールピンク （3 c a)
可溶性色素 産生しない ペプトン 'イースト ·鉄寒天培地 （ I S P)
生 育 中程度に生育、 ビスク一 （4 e c) 裏 面 ハニーゴールド （2 i c)
可溶性色素 わずかに産生する、 黄色 グルコース ·硝酸塩寒天培地
生 育 良好に生育、 フレッシュピンク （4 c a) 裏 面 フレッシュピンク （ 4 c a )
可溶性色素 產生しない ロール ' リンゴ酸カルシゥム寒天培地
生 育 良好に生育、 ライトアプリコット （4 e a) 裏 面 ライトアプリコット （4 e a)
可溶性色素 産生しない ース ·ペプトン寒天培地
生 育 良好に生育、 ライトアプリコッ ト （4 e a) 裏 面 ライトメロンイエロ一 （3 e a) 可溶性色素 産生しない (III) 生理学的諸性質
(1) メラニン色素の生成
(ィ） チロシン寒天 陰性
(口） ペプトン 'イースト '鉄寒天 陰性
(ハ） トリプトン ·イースト液 陰性
(二） 単純ゼラチン培地 （21〜23°C) 陰性
( 2 ) 硝酸塩の還元 . 疑陽性
(3) ゼラチンの液化 （21〜23°C) (単純ゼラチン培地） 陰性
(4) スターチの加水分解 陰性
(5) 脱脂乳の凝固 （27°C) 陰性
( 6 ) 脱脂乳のぺプトン化 （ 27 °C) 陰性
' (7)生育温度範囲 6〜37°C
( 8 ) 炭素源の利用性 （プリ ドハム ·ゴトリ—ブ寒天培地）
利用する ： D—グルコース、 D—マンニトール、 D—フラクト一ス、
L一ラムノース、 my 0—イノシトール、 シュ一クロース 利用しない： Lーァラビノース、 ラフイノース、 メリビオース、 D—キ シロース
(9) セルロースの分解 陰性
( I V)細胞の化学組成
細胞壁のジァミノピメリン酸はメソ型で、 全菌体糖にはガラクトースとァラ ビノースを含む。 細胞壁ムラミン酸はグリコリル型である。 主要メナキノンは、 MK- 8 (H2 ) である。 ミコール酸を含む。
(V) 1 6 S r RNA遺伝子解析
1 6 S r RNA遺伝子のうち約 1300塩基 （No. 131〜No. 13 50) の配列を決定し、 DNAデータベースに登録され公開されているロドコッ カス属に属する菌株およびその他の放射菌のデータを用い近隣結合法 （Sa i t ou, N. & Ne i, M. , Mo 1. B i o l. Evo l. 4巻、 406〜 4 25、 1 987年） による系統解析の結果、 本菌株は口ドコッカス属に分類する ことが妥当である。
(V I)結論
以上、 本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。 細胞壁中のジアミ ノピメリン酸はメソ型、 全菌体糖にはガラクト一スとァラビノースを含む。 細胞 壁ムラミン酸はグリコリル型で、 主要メナキノンは MK— 8 (H2 ) である。 ミ コール酸を含有する。 細胞は短桿菌から擬球菌状となり、 その大きさは約 1. 1 〜1. 4 X 0. 7〜0. 8 mである。 コロニーはオレンジから褐色の色調を呈 し、 メラニン色素は産生しないが、 ペプトン 'イースト '鉄寒天培地上で黄色の 可溶性色素をわずかに産生する。
これらの結果および 1 6S r RNA遺伝子の解析結果から、 本菌株は口ド コッカス属に属する 1菌種であると同定した。 本菌株はロドコッカス エスピー (Rho do c o c cu s sp. ) K01— B 0 1 71として、 特許手続上の 微生物の寄託の国際的承認に関するブ夕ぺスト条約に基づき、 日本国茨城県つく ぱ巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566 ) [A I ST Τ s ukub a C e n t r a l 6, 1 - 1 , H i g a s h i 1— Chome Ts ukub a- s h i, I ba r ak i -ken 305- 8566 J a p an] に所在する独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ— （ I n t e r na t i ona l Pa t en t Or gan i sm Dep o s i t a r y Na t i ona l I ns t i t u t e o f Advan c e d I ndu s t r i a l Sc i en c e and Te chno l ogy) に平 成 1 5年 （2003) 1月 6日に寄託され、 受託番号 FERM BP- 8267 が付与された。
本発明で使用される K0 1 -B 0 1 71物質生産菌としては、 前述の口ドコ ッカス エスピー （Rh 0 d 0 c 0 c c u s s p. ) K 01— B 0 1 71菌株 が好ましい例として挙げられるが、 菌は一般的性状として菌学上の性状は極めて 変異し易く、 一定したものではなく、 自然的にあるいは通常行われる紫外線照射 または変異誘導体、 例えば N—メチルー N' -ニトロ一 N—二トロソグァ二ジン 、 ェチルメタンスルホネ一ト等を用いる人工的変異手段により変異することは周 知の事実であり、 このような人工変異株は勿論、 自然変異株も含め、 ロドコッカ ス属に属し、 前記の式 [ I ] および [ I I ] で表される K 0 1— B 0 1 7 1物質 またはその物質の組成物を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用する ことができる。
本発明の K 0 1 - B 0 1 7 1物質を製造するにあたっては、 先ず口ドコッカ ス属に属する K 0 1 - B 0 1 7 1物質生産菌を培地に培養することにより行われ る。 本発明の K 0 1 - B 0 1 7 1物質生産に適した栄養源としては、 微生物が同 化し得る炭素源、 消化し得る窒素源、 さらに必要に応じて無機塩、 ビタミン等を 含有させた栄養培地が使用される。 炭素源としては、 グルコース、 フラクト一ス 、 マルトース、 ラクト一ス、 ガラクト一ス、 デキストリン、 澱粉などの糖類、 大 豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用レ、られる。
窒素源としては、 ペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粉、 綿実粉、 コー ン ·スチープ · リカー、 麦芽エキス、 カゼィン、 アミノ酸、 尿素、 アンモニゥム 塩類、 硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。 その他必要に応じて リン酸塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩などの塩 類、 鉄塩、 マンガン塩、 銅塩、 コバルト塩、 亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン 類、 その他 K 0 1 - B 0 1 7 1物質の生産に好適なものが添加される。
培養するに当たり、 発泡の激しいときには、 必要に応じて液体パラフィ ン、 動物油、 植物油、 シリコン油、 界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。 上記 の培養は、 上記の栄養源を含有すれば、 培地は液体でも固体でもよいが、 通常は 液体培地を用い、 培養するのがよい、 少量生産の場合にはフラスコを用いる培養 が好適である。
培養を大きなタンクで行う場合は、 生産工程において、 菌の生育遅延を防止 するため、 はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、 次に培養物を 大きなタンクに移して、 そこで生産培養するのが好ましい。 この場合、 前培養に 使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、 両者ともに同一であつて もよいし、 必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、 例えばプロペラやその他機械による攪拌 、 ファメーターの回転または振とう、 ポンプ処理、 空気の吹き込みなど既知の方 法が適宜使用される。 通気用の空気は、 滅菌したものを使用する。 培養温度は、 本 K 0 1—B 0 1 7 1物質生産菌が本 K 0 1 -B 0 1 7 1物質を生産する範囲内 で適宜変更し得るが、 通常は 6〜37で、 好ましくは 1 7°C前後で培養するのが よい。 培養 pHは、 通常は 7〜8、 好ましくは 7前後で培養するのがよい。 培養 時間は、 培養条件によっても異なるが、 通常は 4日程度である。
このようにして得られた培養物に蓄積される K 0 1 -B 0 1 7 1物質は、 通 常は培養菌体中に存在する。 培養菌体から目的とする K 0 1 -B 0 1 7 1物質を 採取するには、 通常の微生物の培養物から代謝産物を採取するに用いられる手段 を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、 または反復して用いられる。
本 K 0 1— B 0 1 7 1物質を分離、 採取するには菌体抽出液から採取すれば よい。 例えば菌体よりアセトン、 エタノールあるいはメタノールなどの有機溶剤 などで抽出する。 抽出液を濃縮した後クロ口ホルムや酢酸ェチルなどの有機溶剤 などで抽出する。 抽出液を濃縮した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー、 セ フアデックス LH— 20、 ODSカラムクロマトグラフィー等によって本 K 0 1 — B 0 1 7 1物質を単離することができる。
次に、 本発明の K 0 1 -B 0 1 7 1物質の理化学的性状について説明する。 1. K 0 1 -B O 1 7 1—B物質
( 1 ) 性状 ：淡黄色粉末
( 2 ) 融点 ： 24 0 °C (分解）
(3) 分子式： Ca4H143 N27025
HRFAB— MS (m/z) [ + H]
計算値 20 5 1. 0 8 26、 実測値 20 5 1. 0 76 4
( 4 ) 分子量： 20 5 0 FAB-MS (m/z)で [M + H] 2051を観測
(5) 紫外部吸収スペクトル： 50%メタノール水中で測定した紫外部吸収ス ベクトルは第 1図に示すとおりであり、 Amax 203 (£ = 225, 200 ) 、 220 (£ = 83， 200) 、 282 (ε= 1 1 , 900 ) nmに特徵的な吸 収極大を示す。
( 6 ) 赤外部吸収スぺクトル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ クトルは第 2図に示すとおりであり、 λπι&χ 1 643 cm一1に特徵的な吸収極 大を示す。
(7) 比旋光度： [ ] 。 28— 1 9. 6° (c = 0. 5、 50%メタノール水)
(8)溶剤に対する溶解性：水、 ジメチルスルフォキサイド （DMSO) 、 メ 夕ノール、 エタノールに可溶。，ァセトニトリル、 酢酸ェチル、 クロ口ホルム、 ァ セトンに不溶。
( 9 ) 塩基性、 酸性、 中性の区別：弱塩基性物質
( 1 0) プロトン核磁気共鳴スぺクトル： 日本国、 Va r i an Jap an社 製 400 MHz核磁気共鳴スぺクトロメータ （重水中） での測定は第 3図に示す とおりであり、 その水素の化学シフト （ppm) は下記に示すとおりである。
0. 64 (3H) 、 0. 6 6 (3H) 、 0. 6 8 (3H) 0. 7 2 (3H)
0. 74 (3H) 、 0. 7 9 (3H) 、 0. 8 1 (3H) 、 0. 9 0 (3H) 、
0. 93 (3H) 、 1. 0 5 (1H) 、 1， 1 5 (3H) 、 1. 3 5 (1 H) 、
1. 35 (2H) 、 1. 4 0 (1H) 、 1， 4 2 (1 H) 、 1. 5 8 (1 H) 、
1. 60 (2H) 、 1. 6 5 (1H) 、 1. 6 6 (1H) 、 1. 6 7 (2H) 、
1. 72 ( 1 H) 1. 7 5 (2H) 1. 7 6 (1H) 、 1. 8 0 (2H) 、
1. 80 (2H) 、 丄 · 8 4 (1H) 、 2. 0 0 (1 H) 、 2. 0 3 (2H) 、
2. 04 (1 H) 2. 1 0 (1H) 、 2. 1 8 C1H) 、 2. 3 0 (1H) 、
2. 38 (2H) 2. 6 0 (1H) 、 2. 7 0 (1H) 、 2. 8 3 (1 H)
2. 86 (1H) 、 2. 9 8 (2H) 、 3. 1 4 (1H) 、 3. 1 6 (1 H) 、
3. 1 7 (2H) 、 3. 3 0 (1H) 3. 3 5 (1 H) 、 3. 6 2 (1 H) 、 3. 62 ( 1 H)、 3. 70 ( 1 H) , 3. 73 ( 1 H)、 3. 74 ( 1 H)、
3. 7 8 ( 1 H) 、 3. 8 0 ( 1 H)、 3. 8 4 ( 1 H)、 3. 9 2 ( 1 H) 、
3. 9 4 ( 1 H) 、 4. 1 0 ( 1 H)、 4. 1 5 ( 1 H)、 4. 2 8 ( 1 H) 、
4. 3 8 ( 1 H) 、 4. 4 3 ( 1 H)、 4. 4 5 ( 1 H)、 4. 4 7 ( 1 H) 、
4. 5 3 ( 1 H) 4. 6 9 ( 1 H) , 4. 7 0 ( 1 H)、 4. 73 ( 1 H) 、
4. 8 9 ( 1 H) 、 4. 9 4 ( 1 H) , 4. 9 7 ( 1 H) 、 5. 1 5 ( 1 H)
5. 2 9 ( 1 H) 、 6. 7 0 ( 1 H)、 6. 7 2 (2H)、 7. 0 0 (2H) 、
7. 1 2 ( 1 H) s 7. 2 2 ( 1 H)、 7. 2 7 ( 1 H)、 7. 4 8 ( 1 H) 、
7. 6 7 ( 1 H) 、 8. 6 0 ( 1 H)。但し、 ( ) 內は水素原子数を示す。
( 1 1 ) 力一ボン核磁気共鳴スぺクトル： 日本国、 Va r i an J a p a n社 製 1 0 0 MHz核磁気共鳴スぺクトロメータ （重水中） での測定は第 4図に示す とおりであり、 その炭素の化学シフト （p pm) は下記に示すとおりである。
1 3 . 2 0、 1 7 0 0. 2 0 • 1 0、 2 0 6 0、 2 0 - 8 0、 2 1 • 0 0、
2 1 . 3 0、 2 1 7 0、 2 3 • 7 0、 2 4 6 0、 2 4 7 0、 2 7 1 0、
27 . 4 0、 2 7 • 6 0、 2 7 • 8 0、 2 7 8 0, 2 8 6 0、 2 9 3 0、
2 9 . 7 0、 3 0 • 6 0、 3 1 • 8 0、 3 2 1 0、 3 2 • 6 0、 3 2 • 9 0、
34 . 0 0、 3 4 3 0、 3 4 4 0、 3 4 8 (K 3 8 3 0, 3 8 8 0、
4 0 ， 1 0、 4 2 • 1 0、 4 3 4 0、 4 4 • 9 0、 4 5 - 3 0、 4 7 1 0、
5 0 . 6 0、 5 3 4 0、 5 3 7 0、 5 3 • 8 0, 5 4 • 8 0、 5 5 0 0,
5 6 . 2 0. 5 7 2 0、 5 7 4 0、 5 8 • 3 0、 5 8 6 0、 6 1 • 2 0、
6 1 . 3 0. 6 1 • 9 0、 6 2 0 0、 6 2 • 4 0、 6 3 • 7 0、 6 5 9 0、
6 8 . 8 0、 1 1 1 • 20 、 1 1 4 . 90 、 1 1 8. 4 0 、 1 1 9 . 3 0 、 1 2
1. 30 、 1 2 2 • 3 0、 1 2 5 • 0 0、 1 27 . 70 、 1 2 9. 6 0 、 1 3 1
. 4 0、 1 3 2 . 0 0 、 1 3 3 . 6 0、 1 3 6 . 5 0 、 1 3 9 . 30 1 5 7.
6 0 、 1 5 9 . 7 0 、 1 7 2 . 1 0 、 1 7 4 • 2 0、 1 7 4 . 30 、 1 74 . 7
6、 1 7 4. 7 7 、 1 74 . 8 0 、 1 74 • 8 5 、 1 7 4 • 9 0、 1 7 5 . 1 0
、 1 75 . 2 0 、 1 7 5. 3 2 、 1 75. 3 3 、 1 75 8 0 、 1 7 5 9 3、 1 7 6. 5 4、 1 7 6. 75、 1 76. 9 0、 1 77. 0 0、 1 77. 7 0、 1
7 8. 8 0、 1 8 0. 5 0o
以上のように、 K0 1— B 0 1 7 1—Β物質の各種理化学性状やスぺクトル データを詳細に検討した結果、 Κ 0 1— Β 0 1 7 1—Β物質は下記の式 [ I] で 表される化学構造であることが決定された。
Figure imgf000016_0001
CI]
2. Κ 0 1—Β 0 1 7 1— C物質
( 1 ) 性状 ：淡黄色粉末
( 2 ) 融点 ： 2 4 0 °C (分解）
(3) 分子式： Clfll H1B3 N29O27
HRFAB-MS (m/z) [M十 H]
計算値 220 5. 1 5 6 8、 実測値 220 5. 1 5 04
( 4 ) 分子量： 2204
FAB-MS (m/z) で [M + H] 2205を観測
(5) 紫外部吸収スペクトル： 5 0 %メタノール水中で測定した紫外部吸収ス ぺクトルは第 5図に示すとおりであり、 Amax 203 (g = 1 82, 700 ) 、 22 0 (ε = 6 6, 80 0) 、 284 (ε = 9, 8 0 0) nmに特徵的な吸収 極大を示す。 ( 6 ) 赤外部吸収スぺクトル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ クトルは第 6図に示すとおりであり、 Ama X 1 650 cnr1に特徵的な吸収極 大を示す。
(7) 比旋光度： [ ] D 2e— 29. 6° (c = 0. 5、 50%メタノール）
(8) 溶剤に対する溶解性：水、 ジメチルスルフオキサイド （DMSO) 、 メ 夕ノール、 エタノールに可溶。 ァセトニトリル、 酢酸ェチル、 クロ口ホルム、 ァ セトンに不溶。
( ) 塩基性、 酸性、 中性の区別：弱塩基性物質。
( 1 0) プロトン核磁気共鳴スぺクトル： 日本国、 Va r i an Jap an社 製 400 MHz核磁気共鳴スぺクトルメータ [重水一重メタノール （3 ： 2) 中 ] での測定は第 7図に示すとおりであり、 その水素の化学シフト （ppm) は下 記に示すとおりである。
0. 5 9 (3H) 、 0. 6 2 (3H) 0. 7 0 (3H) 、 0. 7 5 (3H) 、
0. 7 6 (3H) 0. 8 0 (3H) 、 0. 8 2 (3H) 、 0. 9 0 (3H) 、
0. 9 4 (3H) 、 1. 0 1 (1H) 、 1. 1 5 (3H) 、 1. 3 2 (1 H) 、
1. 3 3 (2H) 、 1. 4 0 (1H) 、 1. 4 3 (1 H) 1. 5 8 ( 1 H) 、
1. 6 0 (2H) 、 1. 6 5 (1H) 、 1. 6 6 (1H) 、 1. 6 7 (2H) 、
1. 7 4 (1 H) 1. 7 5 (2H) 、 1. 7 6 (1H) 、 1. 8 0 (2H) 、
1. 8 0 (2H) 、 1. 8 4 (1H) 、 1. 9 9 (1H) 、 2. 0 1 (1 H) 、
2. 0 2 (2H) 、 2. 0 3 (2H) 2. 0 4 (1H) 、 2. 1 0 (1H)
2. 1 8 (1 H) 、 2. 3 1 (1H) 、 2. 3 2 (1H) 、 2. 3 8 (2H) 、
2. 4 8 (1 H) 2. 4 9 (1H) 、 2. 8 4 (1 H) 、 2. 8 7 (1 H) 、
2. 9 9 (2H) 、 3. 0 4 (1H) 、 3. 0 8 (1 H) 、 3. 1 3 (2H) 、
3. 3 1 (1 H) 、 3. 3 5 (1 H) 、 3. 4 8 (1H) 、 3. 5 1 (1H) 、
3. 5 4 (1 H) 、 3. 6 1 (1H) 、 3. 6 8 (1 H) 、 3. 7 2 (1 H) 、
3. 7 6 (1 H) 、 3. 7 7 (1H) 3. 7 8 (1 H) 、 3. 7 9 (1 H) 、
3. 8 1 (1 H) 、 3. 9 1 (1H) 、 3. 9 4 (1 H) 、 3. 9 9 (1 H) 、
6一 4. 0 7 ( 1 H)、 4. 1 4 (1 H)、 4. 2 1 ( 1 H) .、 4, 25 ( 1 H)、
4. 4 3 ( 1 H)、 4. 4 4 (1 H)、 4 . 4 9 ( 1 H) 、 4 5 9 ( 1 H) .
4. 6 4 ( 1 H)、 4. 6 7 ( 1 H)、 4 . 9 2 ( 1 H) . 、 4 9 9 ( 1 H) ,
5. 1 4 ( 1 H)、 5. 2 2 ( 1 H)、 5 . 2 5 ( 1 H) 、 5 3 2 ( 1 H)、
6. 3 5 ( 1 H)、 6. 7 0 (2H)、 6 . 9 9 (2H) . 、 7 0 8 ( 1 H)、
7. 1 8 ( 1 H) . 7. 4 3 ( 1 H)、 7 . 5 5 ( 1 H) 、 7 6 2 ( 1 H)、
8. 4 2 ( 1 H) 。 但し、 ( ) 内は水素原子数を示す。
( 1 1 ) カーボン核磁気共鳴スぺクトル • 日本国、 Va r i a n J a p a n社 製 1 0 0 MHz核磁気共鳴スぺクトロメ一夕 [軽水一重メタノ ―ル (3 ： 2) 中
] での測定は第 8図に示すとおりであり、 その炭素の化学シフ h ( pm) は下 記に示すとおりである。
1 1 . 1 3、 1 4. 9 7、 1 7. 8 9、 1 8. 7 2、 1 8 ， 8 5 、 1 9. 0 8、
1 9 . 3 2、 1 9. 75、 2 1. 65、 2 2. 4 3. 22 . 4 9 、 22. 9 5、
2 3 . 1 0、 25. 0 5、 25. 1 3、 2 5. 2 8, 25 . 7 3 、 2 6. 0 1、
2 6 ， 6 7、 26. 9 3、 2 7. 46、 2 8. 3 6、 30 . 2 9 、 3 0. 3 5、
3 1 . 0 5. 3 1. 1 4、 3 1. 8 9、 3 2. 2 7, 32 . 4 4 、 32. 9 1、
3 6 . 0 7、 3 6. 6 6、 3 8. 08、 4 0. 3 0、 4 1 . 0 8 、 4 2. 5 7、
4 3 . 3 0、 4 3. 4 5、 4 5. 29、 4 7. 4 4、 4 8 . 0 5 4 9. 5 4、
5 1 . 4 0、 5 1. 5 0、 5 1. 74、 5 2. 7 8, 54 . 2 3 5 5. 1 6、
5 5 . 9 3、 5 6. 34、 5 8. 95、 5 9. 4 3、 5 9 . 9 9 、 6 0. 2 1、
6 1 ， 3 5、 6 1. 7 9、 62. 8 1、 6 3. 9 7、 67 . 2 0 、 6 8. 3 9、
1 0 9. 2 1、 1 1 2. 6 8、 1 1 6. 3 5、 1 1 8. 8 0、 1 1 9. 0 5、
1 2 0. 1 2、 1 22. 7 2、 1 25. 3 7、 1 27. 5 7、 1 2 9. 0 8、
1 3 1. 6 0、 1 3 4. 7 8、 1 36. 1 5 1 37. 3 1、 1 5 5. 70、
1 5 7. 72、 1 6 8. 6 1、 1 69. 5 7、 1 7 1. 0 7、 1 7 1. 8 3、
1 7 2. 1 5、 1 72. 3 2、 1 72. 4 0、 1 72. 5 7、 1 7 2. 8 3、
1 7 2. 9 4、 1 72. 9 9、 1 73. 1 3、 1 73. 6 7、 1 7 3. 8 9、 1 74. 02 1 74. 39 1 74. 71 1 74. 75 1 74. 80 1 75. 06 1 78. 56 1 79. 52 1 80. 1 50
以上のように、 K 0 1— B 0171—C物質の各種理化学性状やスぺクトル データを詳細に検討した結果、 K01 - B O 1 71— C物質は下記の式 [I I] で表される化学構造であることが決定された。
Figure imgf000019_0001
[I I] 次に、 本発明の K0 1 -B 01 71物質の生物学的性状について述べる。 K 0 1 -B 01 71物質の抗結核菌活性は以下 2種類の方法で測定した。
(1) ペ ディスク法による抗結核菌活性の測定
結核菌として M y c ob a c t e r i um sme gma t i s (；!匕里大学 北里生命研究所の保管株） を用い、 ワックスマン寒天培地 （Pep t on e 0 . 5 Me a t ex t r ac t 0. 5% NaC l 0. 5% G l u e o s e 1. 0%, Aga r 0. 8%) に 0. 3 %で植菌した。 活性はぺーパ 一ディスク法 （厚手 6mm ADVANTECH社製、 日本国） により評価し、 27°C 24時間培養後に阻止円を測定した。
その結果、 本発明の K0 1 -B 0171一 B物質は 1 0 ug/ディスクで 1 9 mmの阻止円を示した。 また本発明の K 0 1 -B 0 1 71一 C物質は 1 0 g /ディスクで 1 8 mmの阻止円をそれぞれ示した。 ( 2 ) 液体培養法による抗結核菌活性
MI C測定は、 微量液体希釈法の改変により行った。 Waksman b r o t h (Pp t on e 0. 5 Me a t ext r a c t 0. 5 %、 N a C I 0. 5%、 Gl u c o s e 2. 0%) 1 0 m Lを入れた大試験管に My c oba c t e r i um sm e gma ΐ i s (北里大学北里生命研究所の保管 株） を一白金耳植菌し、 ガラスビーズ （d = 5mm) を 5つ入れて 27°C、 48 時間震盪培養し、 種培養液を得た。
この種培養液を Mc F a r 1 a n d No. 0. 5 (OD 630 nmにおけ る、 1 %B a C 12 溶液 0. 05mL、 1 %H2 S04 溶液 9. 95mLの混合 液と同等の透過度） に調製し、 1 0倍希釈した （10倍希釈培養菌液： 1 07 C FU/mL)。 Wa k sma n br o t h 90〃 LZw e 1 1を分注した 9 6穴マイクロプレートにあらかじめ調製しておいた薬剤希釈系列 （3. 9、 7. 8、 1 5. 6、 31. 3、 62. 5、 125、 250、 500 g/mL) の各 々を 5 L/w e 1 1ずつ分注し、 更に 10倍希釈培養菌液を 5 zL/ e 1 1 ずつ加えて混合し （最終接種菌量： 5 X 1 04 C F U/w e l l) , 37 °C、 9 6時間培養後、 菌の生育の見られない濃度をもって M I Cとした。
その結果、 本発明 K 01 -B 0171一 B物質は M I C 3. 13 n g/mL 、 また本発明 K01 -Β 0171一 C物質は MI C 6. 25 g/mLをそれぞ
A 1/不し 7こ o o
( 3 ) 細胞毒性試験
RPM I培地で培養した J u r k a t細胞を 1000 r pm、 10分間遠心 後、 ァスピレ一夕一で上清を除き、 新たに RPMI培地を加えて細胞数が 5 X 1 05 c e l l sZm 1となるように調製して細胞懸濁液とした。 サンプルを添加 した 96穴マイクロプレート中に細胞懸濁液 200 L加え、 37°Cで 20時間 培養した。 培養後、 1000 r pm、 10分間遠心し、 ァスピレーターで上清を 除き Kr i shan' s r e agen t [ 500 m g T r i s od i um c i t r a t e (和光純薬社製、 日本国） 、 1. 5mL I GEPAL CA— 630 (シグマ社製、 米国） 、 1 0mg R i b onu c l e a s e A (シグ マ社製、 米国） 、. 25mg Pr op i d i um i od i d e (シグマ社製、 米国） を 500 m 1の滅菌水に溶解] を各 w e l 1に 200 1加えた後アルミ ホイルで遮光し、 振盪機で軽く振盪しながら室温で 2時間放置して D N Aを染色 した。 染色後、 FACS Ca l i bur (Be c t on D i ck i n s on 社製、 米国） を用いて測定を行った。
その結果、 終濃度 50 zL/mLで細胞毒性を示さなかった。
以上に詳しく述べたように、 本発明の K0 1 -B 01 71物質は、 新しい骨 格を有し、 結核菌に対し有効な新しい抗結核薬として有用であると期待される。 図面の簡単説明
第 1図は本発明の K 0 1 -B 0 1 71—B物質の紫外部吸収スぺクトル （5 0%メタノール水中） を示したものである。
第 2図は本発明の K01 -B 01 71一 B物質の赤外部吸収スぺクトル （臭 化カリウム錠剤法） を示したものである。
第 3図は本発明の K 0 1 -B 0 1 71 - B物質のプロトン核磁気共鳴スぺク トル （重水中） を示したものである。
第 4図は本発明の K 01 -B 017 1一 B物質のカーボン核磁気共鳴スぺク トル （重水中） を示したものである。
第 5図は本発明の K01— B 0 1 71— C物質の紫外部吸収スぺクトル （5 0%メタノール水中） を示したものである。
第 6図は本発明の K0 1 -B 0 1 71一 C物質の赤外部吸収スぺクトル （臭 化カリウム錠剤法） を示したものである。
第 7図は本発明の K01—B 0 1 71—C物質のプロトン核磁気共鳴スぺク トル [重水—重メタノール （3 ： 2) 中] を示したものである。
第 8図は本発明の K01— B 0 1 71一 C物質の力一ボン核磁気共鳴スぺク トル [軽水一重メタノール （3 ： 1) 中] を示したものである。 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例を挙げて本発明を説明するが、 本発明はこれのみに限定される ものでない。
寒天斜面培地 （S e i n 0培地） で培養したロドコッカス エスピー K 0 1— B 0 1 7 1菌株 （FERM BP - 82 6 7) を、 種培地 [ 4 9培地； M a n n i t 0 1 3. 0%, G l u c o s e 1. 0%、 Ye a s t e x t r a c i 0. 5%、 MgS04 - 7H2 0 0. 1 %、 コハク酸アンモニゥム 0. 5 %、 K2 HP04 0. 1 %, 微量金属溶液 （MgS04 ' 7H2 0 0. 0 0 0 1 F e S 04 · 7 H2 0 0. 0 0 0 1 Mg C 12 · 4 H2 0 0. 0 00 1 %, Zn SO* · 7 H2 0 0. 00 0 1 %, Cu S04 - 5H2 0 0. 0 0 0 1 %、 C o C 12 · 6 H2 0 0. 0 0 0 1 %) 1 mL/L] 1 0 0 mLを分注した 5 0 OmL容三角フラスコに一白金耳ずつ接種し、 2 7 °Cで 3日 間ロータリ一シヱイカー （2 1 0 r pm) で培養した。 その後、 生産培地 [4 9 培地； Mnn i t o l 3. 0%, G l u c o s e 1. 0 %、 Ye a s t e x t r a c t 0. 5%、 MgS〇4 - 7H2 0 0. 1 %、 コハク酸アンモニ ゥム 0. 5%、 K2 HPO4 0. 1 %, 微量金属溶液 （MgS04 · 7H2 〇 0. 0 0 0 1 %. F e S O4 - 7H2 0 0. 0 0 0 1 %, MgC 12 · 4Η a 0 0. 0 0 0 1 %, ZnS04 · 7H2 0 0. 00 0 1 %, CuS04 - 5 H2 0 0. 0 0 0 1 %, C oC l 2 - 6H2 0 0. 0 0 0 1 %) 1 mL/ L] 20 Lを入れた 30 L容ジャ一フアーメンターに植菌し、 37°Cで 4日間培 し 。
経時的に培養液 5 OmLを取り、 ρΗ：菌体量 （ 1 0 00 0 r pm、 1 5分 間、 遠心分離し、 沈澱量を培養液 1 0111 分に換算して1111^で表示） 、 抗 M. s me gma t i s活性 [上清 l mLを OAS I S HL B ( 1 m g、 ウォーター ズ社製、 米国） にかけ、 水 lmL、 20%ァセトニトリル 300 で洗浄後、 40 %ァセトニトリル 300 zLで溶出し、 5 0 LZ8mm d i s k) を測 疋した o 前記 4日間培養した培養液 （1 6L) をシャープレス遠心機 （国産精ェ社製 、 日本国） で遠心して上清と菌体に分け、 上清を D i a i 0 n HP—, 20カラ ム （ø 75 x 22 Omm、 三菱化成社製、 日本国） にかけ、 水および 20%ァセ トン各 3 Lで洗浄後、 活性成分を 80%アセトン 3 Lで溶出し、 減圧下濃縮して 凍結乾燥した。 得られた粗物質 5 gのうち、 2 gを少量のメタノールに溶解して ODSカラム 35 X 270 mm, センシユー科学社製、 日本国） にかけ、 水 および 20%ァセトニトリル各 60 OmLで洗浄後、 活性成分を 40%ァセトニ トリル 600 m Lで溶出し、 減圧下濃縮乾固して粗物質 1 54 m gを得た。 残り の 3 gについても活性成分を同様に溶出して減圧下濃縮乾固し、 粗物質 1 94m gを得た。
得られた粗物質全 348 mgを少量のメタノールに溶解し、 メタノールで充 塡したセフアデックス LH— 20カラム （02. 5 X 1 1 0 cm、 フアルマシ ァ社製、 スゥヱ一デン国） にかけ、 lmL/mi n. の流速で lmLずつ計 1 2 0フラクションをメタノールで溶出し、 活性成分を含むフラクシヨンを濃縮乾固 した。 最終的な精製を分取 HP LC (カラム ： CAPCELL PAK. φ 20 Χ 25 Omm、 資生堂、 日本国） により行った。 1 0 mMリン酸緩衝液 （ p H 7 . 5) —22%ァセトニトリルのァイソクラティックを移動相とし、 8mL/m i n. の流速において、 UV 21 0 nmの吸収をモニタ一した。 44分、 5 6分 に活性を示すピークを観察し、 このピークを分取して分取液を濃縮した。
1 00倍濃縮液 2 m Lを OAS I S HLB (3mg、 ウォーターズ社製、 米国） に載せ、 水 3mLで洗浄して、 脱塩を行った後、 活性成分を 80%ァセト 二トリル 2 m Lで溶出した。 これを繰り返すことにより得られた溶出液を減圧下 濃縮乾固し、 凍結乾燥を行うことにより薄黄色粉末状の本発明 K01 -B 0 1 7 ί— Β物質成分を収量 38. 3mg、 総収率 1 1. 5 %で、 また本発明 K 0 1— B 0 1 71— C物質成分を収量 1 1. 2 mg、 総収率 1 1. 5 %でそれぞれ単離 した。 産業上の利用分野
以上に説明したように、 K 0 1—B 0 1 7 1— B物質及び K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質又はこれら物質の組成物を生産する能力を有するロドコッカス属に属 する K 0 1 -B 0 1 7 1株を代表とする微生物を培地に培養して、 その培養液中 に K 0 1— B 0 1 7 1— B物質及び K0 1 -B 0 1 7 1—C物質又はこれら物質 の組成物を蓄積せしめ、 該培養物から K0 1 -B 0 1 7 1一 B物質および K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質またはこれら物質の組成物を蓄積せしめ、 該培養物から K 0 1 -B 0 1 7 1一 B物質および K0 1 -B 0 1 7 1一 B物質またはこれら物質 の組成物を採取する。 得られた物質または組成物は、 抗結核菌活性を有すること から結核の予防、 治療に有効な医薬品として期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記式 [ I ]
Figure imgf000025_0001
で表される化合物である K 01 - B 0171— B物質。
2. 1 · 下記式 [I I]
Figure imgf000025_0002
[I I] で表される化合物である K 01—Β 01 71— C物質。
3· 特に下記式 [I]
Figure imgf000026_0001
で表される Κ0 1 -Β 0 1 71— Β物質及び特に、 下記式 [I I]
Figure imgf000026_0002
で表される Κ0 1— Β 0 1 71— C物質からなる Κ01 -Β 0 1 71物質の組成
4. 口ドコッカス属に属し、 K 0 1— B 0 1 7 1— B物質を生産する能力を 有する微生物を培地で培養し、 該培養液中に K0 1 -B 0 1 7 1一 B物質を蓄積 せしめ、 該培養物から K0 1 -B 0 1 7 1一 B物質を採取することを特徴とする K 0 1 -B 0 1 7 1一 B物質の製造法。
5. 口ドコヅカス属に属し、 K0 1— B 0 1 7 1— C物質を生産する能力を 有する微生物を培地で培養し、 該培養液中に K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質を蓄積 せしめ、 該培養物から K0 1 -B 0 1 7 1一 C物質を採取することを特徴とする K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質の製造法。
6. ロドコッカス属に属し、 K 0 1— B 0 1 7 1— B物質及び/又は K 0 1 -B 0 1 7 1—C物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、 該培養液 中に K 0 1 -B 0 1 7 1一 B物質及び/又は K 0 1 -B 0 1 7 1—C物質を蓄積 せしめ、 該培養物から K 0 1 -B 0 1 7 1—B物質及び/又は K 0 1 -B 0 1 7 1一 C物質を採取することを特徽とする K 0 1— B 0 1 7 1物質の組成物の製造 法。
7. 口ドコッカス属に属し、 K0 1— B 0 1 7 1—B物質を生産する能力を 有する微生物が、 ロドコッカス エスピー K 0 1— B 0 1 7 1 (FERM B P- 8 2 6 7) である請求の範囲 4に記載の製造法。
8. 口ドコッカス属に属し、 K0 1— B 0 1 7 1— B物質を生産する能力を 有する微生物が、 ロドコッカス エスピー K 0 1— B 0 1 7 1 (FERM B P- 8 2 6 7 ) である請求の範囲 5に記載の製造法。
9. 口ドコッカス属に属し、 K 0 1— B 0 1 7 1—B物質を生産する能力を 有する微生物が、 ロドコッカス エスピー K 0 1— B 0 1 7 1 (FERM B P— 8 26 7 ) である請求の範囲 6に記載の製造法。
1 0. 医薬として使用するための請求の範囲 1記載の化合物。
1 1. 医薬として使用するための請求の範囲 2記載の化合物。
1 2. 医薬として使用するための請求の範囲 3記載の組成物。
1 3. 抗結核薬として使用するための請求の範面 1 0に記載の化合物。
1 4. 抗結核薬として使用するための請求の範囲 1 1に記載の化合物。
1 5. 抗結核薬として使用するための請求の範囲 1 2に記載の化合物。
1 6. 抗結核薬のための医薬の製造における請求の範囲 1 3記載の化合物の使 0
1 7. 抗結核薬のための医薬の製造における請求の範囲 1 4記載の化合物の使
¾。
1 8. 抗結核薬のための医薬の製造における請求の範囲 1 5記載の組成物の使 用 ό
1 9. ロドコッカス エスピー （Rh o d o c o c c u s s p. ) K 0 1 - B O 1 7 1 (FERM B P— 8267 ) である微生物。
20. 上記の微生物が、 ロドコッカス エスピー K 0 1—B 0 1 7 1 (FE RM BP— 826 7) の変異株である請求の範囲 1 3に記載の微生物。
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