JP4185497B2 - 新規k01−b0171物質およびその製造法 - Google Patents
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Description
本発明はこのような期待を満足し得る結核菌に対して有効な抗結核薬を見出した新規K01−B0171物質およびその製造法を提供するものである。
本発明者らは上記のごとき課題を解決すべく微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、土壌から新たに分離されたK01−B0171菌株の培養物中に抗真菌活性を有する物質が産生されることを見いだした。次いで、該培養物中から抗真菌活性を示す活性物質を分離精製した結果、後記の式[I]および[II]で示される化学構造を有する物質を見いだした。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、各々本物質をK01−B0171−B物質およびK01−B0171−C物質と称することにし、その総称をK01−B0171物質と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式[I]
で表される化合物であるK01−B0171−B物質を提供するものである。
本発明はまた、下記式[II]
で表される化合物であるK01−B0171−C物質を提供するものである。
本発明は更に、特に下記式[I]
で表されるK01−B0171−B物質及び特に下記式[II]
で表されるK01−B0171−C物質からなるK01−B0171物質の組成物を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、K01−B0171−B物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にK01−B0171−B物質を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−B物質を採取するK01−B0171−B物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、K01−B0171−C物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にK01−B0171−C物質を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−C物質を採取するK01−B0171−C物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、K01−B0171−B物質及び/又はK01−B0171−C物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にK01−B0171−B物質及び/又はK01−B0171−C物質を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−B物質及び/又はK01−B0171−C物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、K01−B0171−B物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス エスピー K01−B0171(Rhodococcus sp.K01−B0171、FERM BP−8267)であるK01−B0171−B物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、K01−B0171−C物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス エスピー K01−B0171(Rhodococcus sp.K01−B0171、FERM BP−8267)であるK01−B0171−C物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、K01−B0171−B物質及び/又はK01−B0171−C物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス エスピー K01−B0171(Rhodococcus sp.K01−B0171、FERM BP−8267)であるK01−B0171−B物質及び/又はK01−B0171−C物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス エスピー K01−B0171(Rhodococcus sp.K01−B0171、FERM BP−8267)である微生物を提供するものである。
本発明は更に、抗結核薬として使用するためのK01−B0171−B物質及びK01−B0171−C物質、またはK01−B0171−B物質とK01−B0171−C物質からなる組成物を提供するものである。
前記の式[I]および[II]で表される本発明のK01−B0171−B物質およびK01−B0171−C物質またはこれら物質からなる組成物を生産する能力を有する微生物(以下「K01−B0171物質生産菌」と称する)は、ロドコッカス属(Rhodococcus)に属するが、例えば本発明者らが新たに分離したロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)K01−B0171菌株が、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。
本発明のロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)K01−B0171菌株の菌学的性状を示すと、以下のとおりである。
(I)形態的性質
本菌株は、シュークロース・硝酸塩寒天培地、グルコース・アスパラギン寒天培地、グリセロール・アスパラギン寒天培地、チロシン寒天培地、オートミール寒天培地、イースト・麦芽エキス寒天培地、栄養寒天培地、グルコース・硝酸塩寒天培地、グリセロール・リンゴ酸カルシウム寒天培地及びグルコース・ペプトン寒天培地上では良好に生育し、スターチ・無機塩寒天培地及びペプトン・イースト・鉄寒天培地上では中程度に生育し、気菌糸は着生しない。顕微鏡下の観察では、細胞は短桿菌から凝球菌状となり、その大きさは約1.1〜1.4×0.7〜0.8μmである。
(II)各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング(E.B.Shirling)とデー・ゴットリーブ(D.Gottlieb)の方法(インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、16巻、813頁、1966年)によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第4版(コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、1958年)を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、27℃、2週間目の各培地における観察の結果は下記のとおりである。
(III)生理学的諸性質
(1)メラニン色素の生成
(イ)チロシン寒天 陰性
(ロ)ペプトン・イースト・鉄寒天 陰性
(ハ)トリプトン・イースト液 陰性
(ニ)単純ゼラチン培地(21〜23℃) 陰性
(2)硝酸塩の還元 疑陽性
(3)ゼラチンの液化(21〜23℃)(単純ゼラチン培地) 陰性
(4)スターチの加水分解 陰性
(5)脱脂乳の凝固(27℃) 陰性
(6)脱脂乳のペプトン化(27℃) 陰性
(7)生育温度範囲 6〜37℃
(8)炭素源の利用性(プリドハム・ゴトリーブ寒天培地)
利用する :D−グルコース、D−マンニトール、D−フラクトース、
L−ラムノース、myo−イノシトール、シュークロース
利用しない:L−アラビソース、ラフィノース、メリビオース、D−キ
シロース
(9)セルロースの分解 陰性
(IV)細胞の化学組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はメソ型で、全菌体糖にはガラクトースとアラビノースを含む。細胞壁ムラミン酸はグリコリル型である。主要メナキノンは、MK−8(H2)である。ミコール酸を含む。
(V)16S rRNA遺伝子解析
16S rRNA遺伝子のうち約1300塩基(No.131〜No.1350)の配列を決定し、DNAデータベースに登録され公開されているロドコッカス属に属する菌株およびその他の放射菌のデータを用い近隣結合法(Saitou,N.& Nei,M.,Mol.Biol.Evol.4巻、406〜425、1987年)による系統解析の結果、本菌株はロドコッカス属に分類することが妥当である。
(VI)結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はメソ型、全菌体糖にはガラクトースとアラビノースを含む。細胞壁ムラミン酸はグリコリル型で、主要メナキノンはMK−8(H2)である。ミコール酸を含有する。細胞は短桿菌から擬球菌状となり、その大きさは約1.1〜1.4×0.7〜0.8μmである。コロニーはオレンジから褐色の色調を呈し、メラニン色素は産生しないが、ペプトン・イースト・鉄寒天培地上で黄色の可溶性色素をわずかに産生する。
これらの結果および16S rRNA遺伝子の解析結果から、本菌株はロドコッカス属に属する1菌種であると同定した。本菌株はロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)K01−B0171として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)[AIST Tsukuba Central 6,1−1,Higashi 1−Chome Tsukuba−shi,Ibaraki−ken 305−8566 Japan]に所在する独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)に平成15年(2003)1月6日に寄託され、受託番号FERM BP−8267が付与された。
本発明で使用されるK01−B0171物質生産菌としては、前述のロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)K01−B0171菌株が好ましい例として挙げられるが、菌は一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工変異株は勿論、自然変異株も含め、ロドコッカス属に属し、前記の式[I]および[II]で表されるK01−B0171物質またはその物質の組成物を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
本発明のK01−B0171物質を製造するにあたっては、先ずロドコッカス属に属するK01−B0171物質生産菌を培地に培養することにより行われる。本発明のK01−B0171物質生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉などの糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他K01−B0171物質の生産に好適なものが添加される。
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい、少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込みなど既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は、滅菌したものを使用する。培養温度は、本K01−B0171物質生産菌が本K01−B0171物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は6〜37℃、好ましくは17℃前後で培養するのがよい。培養pHは、通常は7〜8、好ましくは7前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は4日程度である。
このようにして得られた培養物に蓄積されるK01−B0171物質は、通常は培養菌体中に存在する。培養菌体から目的とするK01−B0171物質を採取するには、通常の微生物の培養物から代謝産物を採取するに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して用いられる。
本K01−B0171物質を分離、採取するには菌体抽出液から採取すればよい。例えば菌体よりアセトン、エタノールあるいはメタノールなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後クロロホルムや酢酸エチルなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー、セファデックスLH−20、ODSカラムクロマトグラフィー等によって本K01−B0171物質を単離することができる。
次に、本発明のK01−B0171物質の理化学的性状について説明する。
1.K01−B0171−B物質
(1)性状 :淡黄色粉末
(2)融点 :240℃(分解)
(3)分子式:C94H143N27O25
HRFAB−MS(m/z)[M+H]
計算値2051.0826、実測値2051.0764
(4)分子量:2050
FAB−MS(m/z)で[M+H]2051を観測
(5)紫外部吸収スペクトル:50%メタノール水中で測定した紫外部吸収スペクトルは第1図に示すとおりであり、λmax203(ε=225,200)、220(ε=83,200)、282(ε=11,900)nmに特徴的な吸収極大を示す。
(6)赤外部吸収スペクトル:臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第2図に示すとおりであり、λmax1643cm−1に特徴的な吸収極大を示す。
(7)比旋光度:[α]D 26−19.6°(c=0.5、50%メタノール水)
(8)溶剤に対する溶解性:水、ジメチルスルフォキサイド(DMSO)、メタノール、エタノールに可溶。アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンに不溶。
(9)塩基性、酸性、中性の区別:弱塩基性物質
(10)プロトン核磁気共鳴スペクトル:日本国、Varian Japan社製400MHz核磁気共鳴スペクトロメータ(重水中)での測定は第3図に示すとおりであり、その水素の化学シフト(ppm)は下記に示すとおりである。
0.64(3H)、0.66(3H)、0.68(8H)、0.72(3H)、0.74(3H)、0.79(3H)、0.81(3H)、0.90(3H)、0.93(3H)、1.05(1H)、1.15(3H)、1.35(1H)、1.35(2H)、1.40(1H)、1.42(1H)、1.58(1H)、1.60(2H)、1.65(1H)、1.66(1H)、1.67(2H)、1.72(1H)、1.75(2H)、1.76(1H)、1.80(2H)、1.80(2H)、1.84(1H)、2.00(1H)、2.03(2H)、2.04(1H)、2.10(1H)、2.18(1H)、2.30(1H)、2.38(2H)、2.60(1H)、2.70(1H)、2.83(1H)、2.86(1H)、2.98(2H)、3.14(1H)、3.16(1H)、3.17(2H)、3.30(1H)、3.35(1H)、3.62(1H)、3.62(1H)、3.70(1H)、3.73(1H)、3.74(1H)、3.78(1H)、3.80(1H)、3.84(1H)、3.92(1H)、3.94(1H)、4.10(1H)、4.15(1H)、4.28(1H)、4.38(1H)、4.43(1H)、4.45(1H)、4.47(1H)、4.53(1H)、4.69(1H)、4.70(1H)、4.73(1H)、4.89(1H)、4.94(1H)、4.97(1H)、5.15(1H)、5.29(1H)、6.70(1H)、6.72(2H)、7.00(2H)、7.12(1H)、7.22(1H)、7.27(1H)、7.48(1H)、7.67(1H)、8.60(1H)。但し、( )内は水素原子数を示す。
(11)カーボン核磁気共鳴スペクトル:日本国、Varian Japan社製100MHz核磁気共鳴スペクトロメータ(重水中)での測定は第4図に示すとおりであり、その炭素の化学シフト(ppm)は下記に示すとおりである。
13.20、17.00、20.10、20.60、20.80、21.00、21.30、21.70、23.70、24.60、24.70、27.10、27.40、27.60、27.80、27.80、28.60、29.30、29.70、30.60、31.80、32.10、32.60、32.90、34.00、34.30、34.40、34.80、38.30、38.80、40.10、42.10、43.40、44.90、45.30、47.10、50.60、53.40、53.70、53.80、54.80、55.00、56.20、57.20、57.40、58.30、58.60、61.20、61.30、61.90、62.00、62.40、63.70、65.90、68.80、111.20、114.90、118.40、119.30、121.30、122.30、125.00、127.70、129.60、131.40、132.00、133.60、136.50、139.30、157.60、159.70、172.10、174.20、174.30、174.76、174.77、174.80、174.85、174.90、175.10、175.20、175.32、175.33、175.80、175.93、176.54、176.75、176.90、177.00、177.70、178.80、180.50。
以上のように、K01−B0171−B物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、K01−B0171−B物質は下記の式[I]で表される化学構造であることが決定された。
2.K01−B0171−C物質
(1)性状 :淡黄色粉末
(2)融点 :240℃(分解)
(3)分子式:C101H153N29O27
HRFAB−MS(m/z)[M+H]
計算値2205.1568、実測値2205.1504
(4)分子量:2204
FAB−MS(m/z)で[M+H]2205を観測
(5)紫外部吸収スペクトル:50%メタノール水中で測定した紫外部吸収スペクトルは第5図に示すとおりであり、λmax203(ε=182,700)、220(ε=66,800)、284(ε=9,800)nmに特徴的な吸収極大を示す。
(6)赤外部吸収スペクトル:臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第6図に示すとおりであり、λmax1650cm−1に特徴的な吸収極大を示す。
(7)比旋光度:[α]D 26−29.6°(c=0.5、50%メタノール)
(8)溶剤に対する溶解性:水、ジメチルスルフォキサイド(DMSO)、メタノール、エタノールに可溶。アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンに不溶。
(9)塩基性、酸性、中性の区別:弱塩基性物質。
(10)プロトン核磁気共鳴スペクトル:日本国、Varian Japan社製400MHz核磁気共鳴スペクトルメータ[重水−重メタノール(3:2)中]での測定は第7図に示すとおりであり、その水素の化学シフト(ppm)は下記に示すとおりである。
0.59(3H)、0.62(3H)、0.70(3H)、0.75(3H)、0.76(3H)、0.80(3H)、0.82(3H)、0.90(3H)、0.94(3H)、1.01(1H)、1.15(3H)、1.32(1H)、1.33(2H)、1.40(1H)、1.43(1H)、1.58(1H)、1.60(2H)、1.65(1H)、1.66(1H)、1.67(2H)、1.74(1H)、1.75(2H)、1.76(1H)、1.80(2H)、1.80(2H)、1.84(1H)、1.99(1H)、2.01(1H)、2.02(2H)、2.03(2H)、2.04(1H)、2.10(1H)、2.18(1H)、2.31(1H)、2.32(1H)、2.38(2H)、2.48(1H)、2.49(1H)、2.84(1H)、2.87(1H)、2.99(2H)、3.04(1H)、3.08(1H)、3.13(2H)、3.31(1H)、3.35(1H)、3.48(1H)、3.51(1H)、3.54(1H)、3.61(1H)、3.68(1H)、3.72(1H)、3.76(1H)、3.77(1H)、3.78(1H)、3.79(1H)、3.81(1H)、3.91(1H)、3.94(1H)、3.99(1H)、4.07(1H)、4.14(1H)、4.21(1H)、4.25(1H)、4.43(1H)、4.44(1H)、4.49(1H)、4.59(1H)、4.64(1H)、4.67(1H)、4.92(1H)、4.99(1H)、5.14(1H)、5.22(1H)、5.25(1H)、5.32(1H)、6.35(1H)、6.70(2H)、6.99(2H)、7.08(1H)、7.18(1H)、7.43(1H)、7.55(1H)、7.62(1H)、8.42(1H)。但し、( )内は水素原子数を示す。
(11)カーボン核磁気共鳴スペクトル:日本国、Varian Japan社製100MHz核磁気共鳴スペクトロメータ[軽水−重メタノール(3:2)中]での測定は第8図に示すとおりであり、その炭素の化学シフト(ppm)は下記に示すとおりである。
11.13、14.97、17.89、18.72、18.85、19.08、19.32、19.75、21.65、22.43、22.49、22.95、23.10、25.05、25.13、25.28、25.73、26.01、26.67、26.93、27.46、28.36、30.29、30.35、31.05、31.14、31.89、32.27、32.44、32.91、36.07、36.66、38.08、40.30、41.08、42.57、43.30、43.45、45.29、47.44、48.05、49.54、51.40、51.50、51.74、52.78、54.23、55.16、55.93、56.34、58.95、59.43、59.99、60.21、61.35、61.79、62.81、63.97、67.20、68.39、109.21、112.68、116.35、118.80、119.05、120.12、122.72、125.37、127.57、129.08、131.60、134.78、136.15、137.31、155.70、157.72、168.61、169.57、171.07、171.83、172.15、172.32、172.40、172.57、172.83、172.94、172.99、173.13、173.67、173.89、174.02、174.39、174.71、174.75、174.80、175.06、178.56、179.52、180.15。
以上のように、K01−B0171−C物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、K01−B0171−C物質は下記の式[II]で表される化学構造であることが決定された。
次に、本発明のK01−B0171物質の生物学的性状について述べる。
K01−B0171物質の抗結核菌活性は以下2種類の方法で測定した。
(1)ペーパーディスク法による抗結核菌活性の測定
結核菌としてMycobacterium smegmatis(北里大学北里生命研究所の保管株)を用い、ワックスマン寒天培地(Peptone 0.5%、Meat extract 0.5%、NaCl 0.5%、Glucose 1.0%、Agar 0.8%)に0.3%で植菌した。活性はペーパーディスク法(厚手6mm、ADVANTECH社製、日本国)により評価し、27℃、24時間培養後に阻止円を測定した。
その結果、本発明のK01−B0171−B物質は10μg/ディスクで19mmの阻止円を示した。また本発明のK01−B0171−C物質は10μg/ディスクで18mmの阻止円をそれぞれ示した。
(2)液体培養法による抗結核菌活性
MIC測定は、微量液体希釈法の改変により行った。Waksman broth(Pptone 0.5%、Meat extract 0.5%、NaCl 0.5%、Glucose 2.0%)10mLを入れた大試験管にMycobacterium smegmatis(北里大学北里生命研究所の保管株)を一白金耳植菌し、ガラスビーズ(d=5mm)を5つ入れて27℃、48時間震盪培養し、種培養液を得た。
この種培養液をMcFarland No.0.5(OD630nmにおける、1%BaCl2溶液0.05mL、1%H2SO4溶液9.95mLの混合液と同等の透過度)に調製し、10倍希釈した(10倍希釈培養菌液:107CFU/mL)。Waksman broth 90μL/wellを分注した96穴マイクロプレートにあらかじめ調製しておいた薬剤希釈系列(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500μg/mL)の各々を5μL/wellずつ分注し、更に10倍希釈培養菌液を5μL/wellずつ加えて混合し(最終接種菌量:5×104CFU/well)、37℃、96時間培養後、菌の生育の見られない濃度をもってMICとした。
その結果、本発明K01−B0171−B物質はMIC3.13μg/mL、また本発明K01−B0171−C物質はMIC6.25μg/mLをそれぞれ示した。。
(3)細胞毒性試験
RPMI培地で培養したJurkat細胞を1000rpm、10分間遠心後、アスピレーターで上清を除き、新たにRPMI培地を加えて細胞数が5×105cells/mlとなるように調製して細胞懸濁液とした。サンプルを添加した96穴マイクロプレート中に細胞懸濁液200μL加え、37℃で20時間培養した。培養後、1000rpm、10分間遠心し、アスピレーターで上清を除きKrishan’s reagent[500mg Trisodium citrate(和光純薬社製、日本国)、1.5mL IGEPAL CA−630(シグマ社製、米国)、10mg Ribonuclease A(シグマ社製、米国)、25mg Propidium iodide(シグマ社製、米国)を500mlの滅菌水に溶解]を各wellに200μl加えた後アルミホイルで遮光し、振盪機で軽く振盪しながら室温で2時間放置してDNAを染色した。染色後、FACS Calibur(Becton Dickinson社製、米国)を用いて測定を行った。
その結果、終濃度50μL/mLで細胞毒性を示さなかった。
以上に詳しく述べたように、本発明のK01−B0171物質は、新しい骨格を有し、結核菌に対し有効な新しい抗結核薬として有用であると期待される。
第2図は本発明のK01−B0171−B物質の赤外部吸収スペクトル(臭化カリウム錠剤法)を示したものである。
第3図は本発明のK01−B0171−B物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル(重水中)を示したものである。
第4図は本発明のK01−B0171−B物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル(重水中)を示したものである。
第5図は本発明のK01−B0171−C物質の紫外部吸収スペクトル(50%メタノール水中)を示したものである。
第6図は本発明のK01−B0171−C物質の赤外部吸収スペクトル(臭化カリウム錠剤法)を示したものである。
第7図は本発明のK01−B0171−C物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル[重水−重メタノール(3:2)中]を示したものである。
第8図は本発明のK01−B0171−C物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル[軽水−重メタノール(3:1)中]を示したものである。
寒天斜面培地(Seino培地)で培養したロドコッカス エスピー K01−B0171菌株(FERM BP−8267)を、種培地[49培地;Mannitol 3.0%、Glucose 1.0%、Yeast extract 0.5%、MgSO4・7H2O 0.1%、コハク酸アンモニウム0.5%、K2HPO4 0.1%、微量金属溶液(MgSO4・7H2O 0.0001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、MgCl2・4H2O 0.0001%、ZnSO4・7H2O 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.0001%、CoCl2・6H2O 0.0001%)1mL/L]100mLを分注した500mL容三角フラスコに一白金耳ずつ接種し、27℃で3日間ロータリーシェイカー(210rpm)で培養した。その後、生産培地[49培地;Mnnitol 3.0%、Glucose 1.0%、Yeast extract 0.5%、MgSO4・7H2O 0.1%、コハク酸アンモニウム 0.5%、K2HPO4 0.1%、微量金属溶液(MgSO4・7H2O 0.0001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、MgCl2・4H2O 0.0001%、ZnSO4・7H2O 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.0001%、CoCl2・6H2O 0.0001%)1mL/L]20Lを入れた30L容ジャーファーメンターに植菌し、37℃で4日間培養した。
経時的に培養液50mLを取り、pH:菌体量(10000rpm、15分間、遠心分離し、沈澱量を培養液10mL分に換算してmLで表示)、抗M.smegmatis活性[上清1mLをOASIS HLB(1mg、ウォーターズ社製、米国)にかけ、水1mL、20%アセトニトリル300μLで洗浄後、40%アセトニトリル300μLで溶出し、50μL/8mm disk)を測定した。
前記4日間培養した培養液(16L)をシャープレス遠心機(国産精工社製、日本国)で遠心して上清と菌体に分け、上清をDiaion HP−20カラム(φ75×220mm、三菱化成社製、日本国)にかけ、水および20%アセトン各3Lで洗浄後、活性成分を80%アセトン3Lで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質5gのうち、2gを少量のメタノールに溶解してODSカラム(φ35×270mm、センシュー科学社製、日本国)にかけ、水および20%アセトニトリル各600mLで洗浄後、活性成分を40%アセトニトリル600mLで溶出し、減圧下濃縮乾固して粗物質154mgを得た。残りの3gについても活性成分を同様に溶出して減圧下濃縮乾固し、粗物質194mgを得た。
得られた粗物質全348mgを少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填したセファデックス LH−20カラム(φ2.5×110cm、ファルマシア社製、スウェーデン国)にかけ、1mL/min.の流速で1mLずつ計120フラクションをメタノールで溶出し、活性成分を含むフラクションを濃縮乾固した。最終的な精製を分取HPLC(カラム:CAPCELL PAK、φ20×250mm、資生堂、日本国)により行った。10mMリン酸緩衝液(pH7.5)−22%アセトニトリルのアイソクラティックを移動相とし、8mL/min.の流速において、UV210nmの吸収をモニターした。44分、56分に活性を示すピークを観察し、このピークを分取して分取液を濃縮した。
100倍濃縮液2mLをOASIS HLB(3mg、ウォーターズ社製、米国)に載せ、水3mLで洗浄して、脱塩を行った後、活性成分を80%アセトニトリル2mLで溶出した。これを繰り返すことにより得られた溶出液を減圧下濃縮乾固し、凍結乾燥を行うことにより薄黄色粉末状の本発明K01−B0171−B物質成分を収量38.3mg、総収率11.5%で、また本発明K01−B0171−C物質成分を収量11.2mg、総収率11.5%でそれぞれ単離した。
産業上の利用分野
以上に説明したように、K01−B0171−B物質及びK01−B0171−C物質又はこれら物質の組成物を生産する能力を有するロドコッカス属に属するK01−B0171株を代表とする微生物を培地に培養して、その培養液中にK01−B0171−B物質及びK01−B0171−C物質又はこれら物質の組成物を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−B物質およびK01−B0171−C物質またはこれら物質の組成物を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−B物質およびK01−B0171−B物質またはこれら物質の組成物を採取する。得られた物質または組成物は、抗結核菌活性を有することから結核の予防、治療に有効な医薬品として期待される。
Claims (9)
- ロドコッカス属に属し、請求項1に記載のK01−B0171−B物質を生産する能力を有するロドコッカス エスピー K01−B0171(FERMBP−8267)を培地で培養し、該培養液中にK01−B0171−B物質を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−B物質を採取することを特徴とするK01−B0171−B物質の製造法。
- ロドコッカス属に属し、請求項2に記載のK01−B0171−C物質を生産する能力を有するロドコッカス エスピー K01−B0171(FERMBP−8267)を培地で培養し、該培養液中にK01−B0171−C物質を蓄積せしめ、該培養物からK01−B0171−C物質を採取することを特徴とするK01−B0171−C物質の製造法。
- 医薬として使用するための請求項1に記載の化合物。
- 医薬として使用するための請求項2に記載の化合物。
- 抗結核薬として使用するための請求項5に記載の化合物。
- 抗結核薬として使用するための請求項6に記載の化合物。
- ロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)K01−B0171(FERM BP−8267)。
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