JPH10251289A

JPH10251289A - 新規抗生物質ノスラマイシンとその製造方法

Info

Publication number: JPH10251289A
Application number: JP5917697A
Authority: JP
Inventors: Tomio Takeuchi; 富雄竹内; Hironobu Iinuma; 寛信飯沼; Hiroshi Osanawa; 博長縄; Masa Hamada; 雅濱田; Isao Momose; 功百瀬
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1997-03-13
Publication date: 1998-09-22

Abstract

(57)【要約】【課題】リファンピシン耐性菌を含む抗酸性菌に対し
てすぐれた抗菌活性を示し、また抗腫瘍活性を示す新し
い分子骨格を有する抗生物質を提供する。【解決手段】式（Ｉ）で表わされるノスラマイシンが新規抗生物質としてノカ
ルディア・エスピー MJ896-43F17株の培養により得られ
た。ノスラマイシンあるいはそれの塩は各種の抗酸性菌
に対する抗菌活性と抗腫瘍活性とを有する抗生物質であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗菌活性及び抗腫
瘍活性を示す新規な抗生物質ノスラマイシン(Nothramic
in)、あるいはこれの塩に関し、また本発明はノスラマ
イシンの製造法に関する。さらに本発明は、ノスラマイ
シンまたはそれの塩を有効成分とする抗菌剤及び抗腫瘍
剤に関する。また、本発明は新規抗生物質ノスラマイシ
ンを生産する特性を持つ微生物としてノカルデイア・エ
スピー MJ896-43F17株を包含する。

【０００２】

【従来の技術】種々な多数の抗菌物質が知られており、
また種々な多数の抗腫瘍性物質が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】細菌感染症の化学療法
において、多剤耐性菌の出現は重大な問題である。従来
知られているまたは使用されている既知の抗菌性化合物
とは異なる化学構造を有し且つ優れた抗菌活性を示す新
しい化合物の発見または創製をすることは常に望まれて
おり、そのための研究が行われている。また抗腫瘍性物
質は、一般に強い毒性を有するものが多く、その抗腫瘍
剤としての使用に当たって大きな制約となっている。そ
こで、毒性が低く且つ新規な化学構造を有する抗腫瘍性
物質を発見または創製することが常に望まれており、そ
のための研究が行われている。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記の
要望に応えることができる抗菌活性及び抗腫瘍活性を持
つ新規な抗生物質を提供することを目的に、従来より有
用な抗生物質の開発と実用化の研究を促進してきた。そ
の結果、土壌試料からノカルデイア属に属する菌株を分
離することに成功し、またこの菌株が新しい構造骨格を
有する抗生物質を生産していることを見い出した。この
新規抗生物質を単離することに成功し、後記の式（Ｉ）
で示される化学構造を有することを確認し、そしてノス
ラマイシンと命名した。更に、この新規抗生物質が抗酸
性菌に抗菌活性を示し、また癌細胞の増殖に対して抑制
活性を示すことを見い出した。

【０００５】すなわち、第１の本発明においては、次式
（Ｉ）：で表わされる化合物であるノスラマイシン、あるいはこ
れの塩が提供される。

【０００６】ノスラマイシンの塩としては、ノスラマイ
シンのジメチルアミノ基における製薬学的に許容できる
酸、例えば塩酸、硫酸のような無機酸あるいは酢酸、メ
タンスルホン酸のような有機酸との酸付加塩が包含さ
れ、またノスラマイシンのフェノール性水酸基における
金属塩、例えばナトリウムのようなアルカリ金属との塩
が包含される。

【０００７】次に、本発明の抗生物質ノスラマイシンの
理化学的性状を記載する。

【０００８】A) 外観及び性質：赤色粉末、両性物質 B) 融点:140〜145℃ C) ＴＬＣのＲｆ値:0.21 シリカゲル(Art.105715、メルク社製）の薄層クロマト
グラフィーで展開溶媒としてクロロホルムーメタノール
(3:1)で展開して測定した場合 D) マススペクトル(m/z): 588（M + H)⁺ 587 (M^-) E) 高分解能マススペクトル：実験値 588.2431（M + H)⁺ 計算値 588.2445 F) 分子式：Ｃ₃₀Ｈ₃₇ＮＯ₁₁ G) 紫外線吸収スベクトル (i) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトルは添
付図面の図１に示す。主なピークは次のとおりである。 λmax nm（ε) 233(51800)、257(20200)、290(sh,910
0)、472(13400) (ii) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収
スペクトルは添付図面の図２に示す。主なピークは次の
とおりである。 λmax nm（ε) 238(44300)、280(9500)、 323(4200) 、5
36(13600) (iii) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したＵＶ吸
収スペクトルは添付図面の図３に示す。主なピークは次
のとおりである。 λmax nm (ε) 233(53300)、257(21200)、290(sh,950
0)、473(14000)

【０００９】H) 赤外線吸収スペクトル (KBr錠剤法)：
添付図面の図４に示す。 νmax(cm^-1) 3400、2930、1620、1470、1410、1290、12
25、1180、 1010、990 I) ¹H-NMRスペクトル(CDCl₃／TMS)：添付図面の図５に
示す。 J) ¹³C-NMRスペクトル(CDCl₃／TMS)：添付図而の図６に
示す。

【００１０】さらに、抗生物質ノスラマイシンの生物学
的性状を次に記載する。 A) 抗菌活性本発明による抗生物質ノスラマイシンの各種細菌に対す
る最低発育阻止濃度を測定して次の表１に示す。各種の
耐性菌に対しても抗菌活性を示した。この抗菌スペクト
ルは、ニュートリエント＋ｌ％グリセリン寒天培地で標
準の倍数希釈法により測定した。

【００１１】[表1] （注）1)パロモマイシン耐性 2)カプレオマイシン耐性 3)バイオマイシン耐性 4)ストレプトスライシン耐性 5)カナマイシン耐性 6)ストレプトマイシン耐性 7)リフアンピシン耐性

【００１２】B) 癌細胞増殖抑制活性各種の癌細胞を用いて癌細胞の増殖を50％抑制するノス
ラマイシンの濃度（IC₅₀値）を、MTT法(「Journal of Im
munological Methods」65巻、 55-60頁（1983年)参照）
で測定した。その結果を表２に示す。

【００１３】［表２］

【００１４】表１の結果から明らかなように、本発明に
よる抗生物質ノスラマイシンは、各種の抗酸性菌に対し
て抗菌活性を有し、また結核菌が抗酸性菌の一種である
ことから抗結核薬として有用である。また、表２の結果
から明らかなように、ノスラマイシンは各種の癌細胞の
増殖を抑制する抗腫瘍活性を有することから抗腫瘍剤と
して有用である。

【００１５】さらに第２の本発明によれば、ノカルデイ
ア属に属する、前記の式（Ｉ）のノスラマイシンの生産
菌を培地に培養し、その培養物からノスラマイシンを採
取することを特徴とする、抗生物質ノスラマイシンの製
造法が提供される。

【００１６】第２の本発明の方法で使用できるノスラマ
イシンの生産菌の一例として、ノカルデイア・エスピー
MJ896-43F17株がある。この生産菌は平成４年10月、微
生物化学研究所において神奈川県三浦市の土壌より分離
された放線菌で、MJ896-43F17の菌株番号が付された微
生物である。

【００１７】MJ896-43F17株の菌学的性状を次に記載す
る。 1. 形態基生菌糸はよく分枝し、分断が認められる。気菌糸は、
直状あるいは不規則ならせん状に長く伸長し、円筒形〜
長円形の胞子状に分断する。また、気菌糸の先端が絡ま
り、球状を呈する場合がある。胞子の表面は平滑で、大
きさは約0.3〜0.5 ×0.8〜1.2ミクロンである。輪生
枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。

【００１８】2. 各種培地における生育状態色の記載について［］内に示す色の標準は、コンティ
ナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハ
ーモニー・マニュアル(Container Corporationof Ameri
ca のcolor harmony manual)を用いた。 (1) シュクロース・硝酸塩寒天培地 (27℃培養) 無色〜うす黄[3ca, Pearl Pink] の発育上に、白の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。 (2) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地５、
27℃培養) うすだいだい[3ea, Lt Melon Yellow] の発育上に、ピ
ンク白[5ba, ShellPink]の気菌糸を着生し、溶解性色素
はかすかにうすだいだいを帯びる。 (3) スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、27℃培
養) 無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解
性色素は認められない。 (4) チロシン寒天培地（ISP-培地７、27℃培養) うすだいだい[3ea, Lt Melon Yellow]〜うす黄茶[3ic,L
t Amber] の発育上に、ピンク白[5ba, Shell Pink]の気
菌糸を着生し、溶解性色素はかすかにうすだいだいを帯
びる。

【００１９】(5) イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地
２、27℃培養) にぶだいだい[4ic, Pastel Orange] の発育上に、ピン
ク白[4ca, FleshPink] の気菌糸を着生し、溶解性色素
はピンクを帯びる。 (6) オートミール寒天培地（ISP-培地３、27℃培養) 無色〜うす黄[3ca, Pearl Pink] の発育上に、白〜ピン
ク白[5ba, ShellPink] の気菌糸を着生し、溶解性色素
はかすかにうすピンクを帯びる。

【００２０】3. 生理的性質 (1) 生育温度範囲グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0
％、Ｌ−アスパラギン0.05％、リン酸水素二カリウム
0.05％、ひも寒天3.0％、pH7.0)を用い、10℃、20℃、2
4℃、27℃、30℃、37℃及び50℃の各温度で試験した結
果、50℃での生育は認められず、10℃〜37℃の範囲で生
育した。生育至適温度は27℃〜30℃付近である。 (2) スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、
ISP-培地４、27℃培養) 21日間の培養でスターチの加水分解は認められない。 (3) メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブ
ロス、ISP-培地１；ぺプトン・イースト・鉄寒天培地、
ISP-培地６；チロシン寒天培地、ISP-培地７；いずれも
27℃培養) いずれの培地においても陰性である。 (4) 炭素源の利用性(プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地、ISP-培地９、27℃培養) Ｄ−グルコース、myo−イノシトール、ラムノースを利
用して発育し、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトールは
おそらく利用する。Ｌ−アラビノースはおそらく利用せ
ず、Ｄ一キシロース、シュクロース、ラフィノースは利
用しない。 (5) 硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリウム含有ペプト
ン水、ISP-培地８、27℃培養) 陽性である。

【００２１】4. 菌体成分 (1) 細胞壁組成メソ型の2,6-ジアミノピメリン酸を含有する。 (2) 全菌体中の還元糖アラビノース、ガラクトースを含み、Ａ型である。 (3) 細胞壁ぺプチドグリカンのムラミン酸のアシルタイ
プグリコレートテストの結果、グリコリル型である。 (4) イソプレノイド・キノン主要なメナキノンとしてMK-8(H₄) 及び少量のMK-8(H₂)
を含有する。 (5) リン脂質ホスファチジルエタノールアミンを含み、ホスファチジ
ルコリン及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含ま
ず、ＰII型を示す。 (6) ミコール酸含有する。 (7) 脂肪酸 16:0 (へキサデカン酸)、10-methyl-18:0(10-メチルオ
クタデカン酸)を主成分とし、16:1 (ヘキサデセン酸)
及び18:1 (オクタデセン酸)を含有する。

【００２２】以上の性状を要約すると、MJ896-43F17株
は、その形態上、基生菌糸はよく分枝し、分断を認め
る。気菌糸は直状あるいは不規則ならせん状に長く伸長
し、円筒形〜長円形の胞子状に分断する。輪生枝、菌束
糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。種々の培
地で、無色〜うすだいだい〜にぶだいだいの発育上に白
〜ピンク白の気菌糸を着生する。溶解性色素はかすかに
うすピンクあるいはうすだいだいを帯びる。メラニン
様色素は生成せず、硝酸塩の還元反応は陽性であり、ス
ターチの水解性は認められない。

【００２３】MJ896-43F17株の菌体成分は、細胞壁にメ
ソ型の2,6-ジアミノピメリン酸を含有し、全菌体中の還
元糖はＡ型、グリコレートテストの結果はグリコリル型
である。主要なメナキノンはMK-8(H₄ )及びMK-8(H₂ )
で、リン脂質はＰII型である。ミコール酸を含有する。
脂肪酸は16:0、10-methyl-18:0,16:１及び18:1を含有す
る。以上の結果より、MJ896-43F17株はノカルデイア（N
ocardia、文献、Bergy'sManual of Systematic Bacteri
ology、４巻、2350-2361頁、1989年）属に属するものと
考えられる。そこで、MJ896-43F17株をノカルデイア・
エスピー(Nocardia sp.) MJ896-43Fl7とする。なお MJ8
96-43F17株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
申請し、平成９年２月７日、FERM P-16068として受託さ
れた。

【００２４】第２の本発明の方法を実施するに当って
は、ノカルディア属に属するノスラマイシンの生産菌を
栄養培地に接種し、この培地中で培養する。ここで用い
る栄養培地は、前記の生産菌が資化できる炭素源と窒素
源を栄養成分として含有するものである。その栄養源と
しては、通常微生物の栄養源として通常に使用されるも
の、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの資化できる栄
養源を使用できる。例えば、ぶどう糖、麦芽糖、糖密、
デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭水化物や、大
豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源を使用でき、
またぺプトン、肉エキス、綿実紛、大豆紛、酵母エキ
ス、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、NZ-アミ
ン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウムなどの窒素源を使用できる。さらに、燐酸二カリ
ウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガンなどの無機塩が使用でき、必
要により微量金属、例えばコバルト、鉄などを添加する
ことができる。栄養源としては、その他、抗生物質ノス
ラマイシンを生産するのに使用する生産菌が利用しうる
ものであれば、いずれの公知の栄養源でも使用できる。

【００２５】培地における上記のごとき栄養源の各成分
の配合割合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘っ
て変えることができ、使用するノスラマイシン生産菌に
よって、最適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者で
あれば簡単な小規模実験により容易に決定することがで
きる。また、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に
先立ち殺菌することができ、この殺菌の前または後で、
培地のpHを６〜８の範囲、特にpH 6.5〜7.5の範囲に調
節するのが有利である。

【００２６】かかる栄養培地でのノスラマイシン生産菌
の培養は、一般の放線菌による抗生物質の製造において
通常使用されている方法に準じて行うことができる。通
常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常は攪拌
しながら及び／又は通気しながら行なうことができる。
また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪
拌をともなう液内培養のいずれも使用可能であるが、液
体培養がノスラマイシンの大量生産に適している。

【００２７】使用しうる培養温度はノスラマイシン生産
菌の発育が実質的に阻害されず、該抗生物質を生産しう
る範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用す
る生産菌に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは
25〜30℃の範囲内の温度を挙げることができる。培養は
通常にはノスラマイシンが十分に蓄積するまで継続する
ことができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、
使用生産菌株などにより異なるが、通常４〜８日間の培
養で目的の抗生物質を得ることができる。

【００２８】培養を実施するに当って培地中の抗生物質
ノスラマイシンの蓄積量は、ミコバクテリウム・スメグ
マチスATCC 607を使用して、通常の抗生物質の定量に用
いられる円筒平板法により定量することができる。

【００２９】かくして、ノスラマイシン生産菌の培養物
中に蓄積されたノスラマイシンは、これを培養物から採
取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離などのそ
れ自体公知の分離方法によって菌体を除去した後、その
濾液を有機溶媒、特に酢酸ブチルなどを用いた溶媒抽出
や、吸着やイオン交換能を利用したクロマトグラフィ
ー、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィー
を単独で又は組み合わせて使用することにより単離精製
して採取することができる。吸着やイオン交換能を有す
るクロマトグラフィー用担体としては、活性炭，シリカ
ゲル，多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂もし
くは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。

【００３０】また、分離した菌体からは、適当な有機溶
媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌
体から目的の抗生物質を抽出し、上記と同様に単離精製
することができる。かくして、前記した特性を有する本
発明の抗生物質ノスラマイシンが得られる。

【００３１】さらに、第３の本発明では、前記の式
（Ｉ）で表わされるノスラマイシンまたはそれの製薬学
的に許容できる塩を有効成分とする抗菌剤が提供され
る。

【００３２】さらに、第４の本発明では、前記の式
（Ｉ）で表わされるノスラマイシンまたはそれの製薬学
的に許容できる塩を有効成分とする抗腫瘍剤が提供され
る。

【００３３】本発明による抗菌剤または抗腫瘍剤におい
ては、有効成分としてのノスラマイシンあるいはその塩
は、製薬学的に許容できる常用の固体又は液体担体、例
えばエタノール、水、デンプン等と混和されている形の
組成物であることができる。また、第５の本発明では、
新規な微生物として、前記の式(Ｉ)のノスラマイシンを
生産する特性をもつノカルデイア・エスピー MJ896-43F
17株が提供される。

【００３４】

【発明の実施の形態】次に実施例により本発明を更に詳
細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるも
のではない。

【００３５】実施例１抗生物質ノスラマイシンの製造ガラクトース２％、デキストリン２％、ソイペプトン１
％、粉末コーン・スチープ・リカー 0.5％、グリセリン
１％、硫酸アンモニウム 0.2％、炭酸カルシウム 0.2
％、シリコーンオイルｌ滴を含む液体培地(pH 7.4に調
整）を三角フラスコ(500 ml容）に110 mlずつ分注し、
常法により120℃で20分滅菌したものに、寒天斜面培地
に培養したノカルディア・エスピー MJ896-43F17株(FER
M P-16068）を接種し、その後30℃で３日間回転振とう
培養した。これにより種母培養液を得た。

【００３６】酵母エキス 0.5％、グルコース１％、ポテ
ト・スターチ２％、カザミノ酸 0.5％、炭酸カルシウム
0.4％を含む液体培地をジャーファーメンター（30リッ
トル容）に15リットルずつ分注し、常法により120 ℃で
20分滅菌した。その後、上記の種母培養液をそれぞれ55
0 mlずつ接種し、撹拌数 200rmp 、通気量15リットル／
分で８日間27℃で通気撹拌条件下で培養した。

【００３７】このようにして得られた培養液30リットル
を遠心分離し、菌体を分離した。培養ろ液はダイヤイオ
ンHP-20 (1.5リットル）を充填したカラムに吸着させ、
水３リットルで洗浄し、続いて30％メタノール水２リッ
トルで洗浄の後、50％アセトン水で溶出した。抗菌活性
のある分画を集め減圧下で 2.0リットルまで濃縮し、pH
を8.0 に調整し、酢酸ブチル２リットルで二度抽出し
た。この酢酸ブチル抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥
後に減圧下で濃縮乾固して、赤色油状物質(437.2mg) を
得た。

【００３８】この物質を高速液体クロマトグラフイー
（カラム：資生堂カプセルパックUG）に供し、アセトニ
トリル−0.45％リン酸水（20：80）で溶出した。抗菌活
性のある分画を集め0.1N-NaOHで中和し、減圧下で濃縮
した。この濃縮液をpH 8.0に調整しクロロホルムを加え
抽出した。クロロホルム層を水洗後、減圧下で濃縮乾固
することによりノスラマイシンを分離精製した。ノスラ
マイシンが融点140 〜145 ℃の赤色粉末として105.1 mg
の収量で得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ノスラマイシンのメタノール溶液中の紫外線吸
収スペクトルである。

【図２】ノスラマイシンの0.01N NaOH−メタノール溶液
中の紫外線吸収スペクトルである。

【図３】ノスラマイシンの0.01N HCl−メタノール溶液
中の紫外線吸収スペクトルである。

【図４】ノスラマイシンのKBr錠剤法で測定した赤外線
吸収スペクトルである。

【図５】ノスラマイシンの重クロロホルム溶液（内部標
準：テトラメチルシラン）にて測定したプロトン核磁気
共鳴スペクトルである。

【図６】ノスラマイシンの重クロロホルム溶液（内部標
準：テトラメチルシラン）にて測定した炭素13核磁気共
鳴スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:365） (72)発明者濱田雅東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデンス405号 (72)発明者百瀬功東京都日野市栄町３丁目１番地35号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（Ｉ）：で表わされる化合物である抗生物質ノスラマイシン、ま
たはそれの塩。
【請求項２】ノカルディア属に属して次式（Ｉ）で表されるノスラマイシンを生産する菌を培地に培養
し、その培養物からノスラマイシンを採取することを特
徴とする、抗生物質ノスラマイシンの製造法。
【請求項３】請求項１に示された式（Ｉ）の抗生物質
ノスラマイシンまたはそれの製薬学的に許容できる塩を
有効成分とする抗菌剤。
【請求項４】請求項１に示された式（Ｉ）の抗生物質
ノスラマイシンまたはそれの製薬学的に許容できる塩を
有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項５】抗生物質ノスラマイシンを生産する特性
を持つノカルディア・エスピー MJ896-43F17株。