CN110669706B - 一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌,该菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)J01,由发明人从桂林理工大学环境科学与工程学院实验室的铬超积累植物李氏禾的茎部组织内分离所得,已于2017年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.14267。本发明的李氏禾内生细菌可将六价铬还原为三价铬,为六价铬污染微生物修复提供了新的微生物资源。

Description

一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及菌株领域,具体涉及一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌及其制备方法和应用。
背景技术
随着现代化技术的发展,重金属铬在制药、电镀等多领域中得到了广泛的应用。但与此同时,环境中的铬及其化合物的污染问题也越来越严重。长期接触铬及铬化合物容易对胃肠道系统、免疫系统、肝脏和肾脏产生影响甚至诱发呼吸系统癌症。各种铬形态中,主要以铬酸根和重铬酸根形式存在的Cr
Figure 798628DEST_PATH_IMAGE001
被认为是毒性最强的。国际上对铬污染的水体、土壤都提倡采用生物修复法,即借助微生物或植物的絮凝、吸收累积、富集等作用去除重金属离子。从铬重金属污染的环境中分离的白色杆菌属(Leucobacter sp.)、假单胞菌属(pseudomonad)、链霉菌属(Streptomyces griseus.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和栖热菌属(Thermusscotoductus)都具有较好的Cr
Figure 491777DEST_PATH_IMAGE001
去除能力。
超富集植物具有生物量大、对重金属吸附量是常规植物10~500倍、可在重金属污染土壤中生长良好等优势,在环境污染修复中的应用日益广泛。与此同时,超富集植物内生菌的研究也开始受到研究者的重视,如As超富集植物蜈蚣草、Zn超富集植物东南景天、Cd超累积植物龙葵、Mn超积累植物商陆等均有研究报道。李氏禾(Leersia hexandra Swartz)是张学洪等在广西桂林发现的铬超积累植物,也是第一种在中国境内被发现的铬超积累植物,研究表明其对Cr
Figure 22116DEST_PATH_IMAGE002
和Cr
Figure 775308DEST_PATH_IMAGE001
都有较强的富集能力。但目前利用李氏禾内生细菌对重金属Cr
Figure 656677DEST_PATH_IMAGE001
进行还原的研究尚未见报道。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌及其制备方法和应用。
为实现上述目的,本发明人从桂林理工大学环境科学与工程学院实验室的铬超积累植物李氏禾的茎部组织(李氏禾地上部分平均含铬量为1786.9mg/kg,超过了植物对铬超积累临界值(1000 mg/kg)内分离得到一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌,通过鉴定证明其为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)J01,已于2017年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.14267,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)J01 的菌体细胞为杆状,末端方,成短链。产芽孢,芽孢柱形,中生,孢囊无明显膨大。革兰氏阳性,无荚膜,运动。在普通琼脂平板培养基上,37 ℃,培养24 h,可形成近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落,直径5-7 mm。
所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)J01的16SrDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明还提供了上述一株李氏禾内生细菌的制备方法,包括如下步骤:
S1、选取健康无病害李氏禾茎,蒸馏水冲洗干净后,无菌条件下用70%的酒精浸泡30s,2.5%次氯酸钠溶液浸泡1 min,然后用无菌水冲洗6次;
S2、将完成浸泡冲洗处理的李氏禾茎研磨,接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基,在37℃,120 r/min条件下振荡培养2 d,得培养物;
S3、将所得的培养物稀释后涂布于含Cr(Ⅵ)浓度为200 mg/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基,37℃培养2 d,挑取长势较好的菌落,经反复划线获得李氏禾内生细菌。
进一步地,所述步骤S1中的李氏禾茎采用桂林理工大学环境科学与工程学院实验室的铬超积累植物李氏禾的茎部组织。所述步骤S2中,牛肉膏蛋白胨液体培养基的组分为:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,其余为水,pH 7.2;步骤S3中,牛肉膏蛋白胨固体培养基的组分为:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,琼脂15~20 g/L,其余为水,pH7.2。
本发明的李氏禾内生细菌可将六价铬还原为三价铬,因此,其可用于治理六价铬污染。
优选地,该李氏禾内生细菌在初始pH为6.0,温度为35℃的条件下还原效果较佳。
本发明的李氏禾内生细菌可将六价铬还原为三价铬,当六价铬初始浓度为120mg/L时,该菌株对六价铬的去除率可达80%左右,为六价铬污染微生物修复提供了新的微生物资源。
附图说明
图1为初始pH对J01菌株还原六价铬的影响图。
图2 为温度对J01菌株还原六价铬的影响图。
图3 为Cr
Figure 887938DEST_PATH_IMAGE001
初始浓度对J01菌株还原六价铬的影响图。
图4 为反应时间对J01菌株还原六价铬的影响图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
李氏禾铬还原内生细菌的分离筛选
首先采集桂林理工大学环境科学与工程学院植物修复实验室李氏禾植物,取适量健康的李氏禾茎部,用水冲洗干净后,无菌条件下用70%的酒精浸泡30 s,然后用2.5%次氯酸钠浸泡1 min,最后用无菌水冲洗6次,去除附着在材料表面的消毒剂。无菌条件下用最后一遍冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基,培养后无微生物长出,表明表面消毒彻底。无菌条件下取适量经表面消毒的根部组织,加1 mL 0.9%的氯化钠溶液充分研磨,取1 mL研磨液接种于100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中(500 mL三角瓶),37 ℃,120r·min-1条件下振荡培养2 d,将培养液按10-2,10-3,10-4,10-5,10-6进行稀释,分别取20 μL用平板涂布器涂布在含Cr
Figure 36897DEST_PATH_IMAGE001
浓度分别为200 mg/L的牛肉膏蛋白胨平板培养基上,37 ℃恒温培养24~48 h后,根据菌落生长情况,挑选长势较好、耐铬性能强的菌落,接入含铬平板中,采用划线法进行多次的分离纯化,获得Cr
Figure 695412DEST_PATH_IMAGE001
抗性内生菌纯培养物。
抗Cr
Figure 64076DEST_PATH_IMAGE001
细菌还原性的鉴定:将试管斜面保存的菌株活化后,挑取一环接种于含20 mL液体培养基的50 mL三角瓶中,37 ℃、120 r/min振荡培养24 h后作为种子液。将种子液按10%接种量分别接种于Cr(VI)浓度为50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的液体培养基(20mL/50 mL三角瓶)中,置于37 ℃、120 r/min培养箱中振荡培养。每隔24 h无菌条件下取样1mL,8000 r/min离心10 min,取上清液测定Cr
Figure 99028DEST_PATH_IMAGE001
和总Cr浓度。以不接种但含Cr(VI)的空白培养基作为空白对照。J01菌株对六价铬的还原效果如表1所示。
表1 不同Cr
Figure 603959DEST_PATH_IMAGE001
浓度不同培养时间下J01菌株对铬的去除率
Figure 698954DEST_PATH_IMAGE004
实施例2 初始pH对J01菌株还原Cr
Figure DEST_PATH_IMAGE005
的影响
试管斜面保存的菌株J01经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,挑取2环接种到含100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中,37℃、120 r/min振荡培养24 h后作为种子液。
将种子液按10%接种量接种于含Cr(VI)浓度为120 mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量100 mL/250 mL三角瓶)中,用2 M的氢氧化钠和盐酸溶液调节pH后,八层纱布封口,置于35 ℃的恒温水平摇床上150 r/min振荡培养。培养48 h后,无菌条件下取样适量培养液,10000 r/min离心10 min,将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀,测定OD600,上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图1所示,当pH为6.0时Cr(VI)去除率达最大,约为87%,此时总铬去除率约为10%。
实施例3 温度对J01菌株还原Cr
Figure 23756DEST_PATH_IMAGE005
的影响
试管斜面保存的菌株J01经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,挑取2环接种到含100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中,37℃、120 r/min振荡培养24 h后作为种子液。
将种子液按10%接种量接种于含Cr(VI)浓度为120 mg/L、pH为6.0(用2 M的氢氧化钠和盐酸溶液调节)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量100 mL/250 mL三角瓶)中,八层纱布封口,置于不同温度的恒温水平摇床上150 r/min振荡培养。培养48 h后,无菌条件下取样适量培养液,10000 r/min离心10 min,将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀,测定OD600,上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图2所示,在25℃至40℃下,J01均能较好地生长和进行Cr(VI)还原。当培养温度为35℃时,Cr(VI)去除率达最大。
实施例4 初始Cr
Figure 89495DEST_PATH_IMAGE005
浓度对J01菌株还原Cr
Figure 448933DEST_PATH_IMAGE005
的影响
试管斜面保存的菌株J01经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,挑取2环接种到含100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中,37℃、120 r/min振荡培养24 h后作为种子液。
将种子液按10%接种量接种于含不同Cr(VI)浓度、pH为6.0(用2 M的氢氧化钠和盐酸溶液调节)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量100 mL/250 mL三角瓶)中,八层纱布封口,置于37 ℃的恒温水平摇床上150 r/min振荡培养。培养48 h后,无菌条件下取样适量培养液,10000 r/min离心10 min,将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀,测定OD600,上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图3所示,随着培养液中Cr(VI)初始浓度的增加,菌体生长受到限制,Cr(VI)去除率逐渐降低。当Cr(VI)初始浓度为120mg/L时,Cr(VI)的绝对去除量达最大,此时去除率约为87%。
实施例5 反应时间对J01菌株还原Cr
Figure 714829DEST_PATH_IMAGE005
的影响
试管斜面保存的菌株J01经牛肉膏蛋白胨固体培养基平板活化,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,挑取2环接种到含100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中,37℃、120 r/min振荡培养24 h后作为种子液。
将种子液按10%接种量接种于含Cr(VI)浓度为120 mg/L、pH为6.0(用2 M的氢氧化钠和盐酸溶液调节)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(装液量100 mL/250 mL三角瓶)中,八层纱布封口,置于35 ℃的恒温水平摇床上120 r/min振荡培养。培养不同时间后,无菌条件下取样适量培养液,10000 r/min离心10 min,将沉淀与上清液分离。沉淀用蒸馏水溶液混匀,测定OD600,上清液测定Cr(Ⅵ)的浓度和总Cr的浓度。结果如附图4所示,随着培养时间的加长,Cr(VI)去除率逐步递增,在24 h时Cr(VI)去除率达最大。在24-72 h之间其Cr(VI)去除率变化不大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0003895312490000011

Claims (4)

1.一株可还原六价铬的李氏禾内生细菌,其特征在于,该菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)J01,已于2017年06月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.14267,所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)J01的16SrDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.如权利要求1所述的李氏禾内生细菌的应用,其特征在于:所述李氏禾内生细菌用于治理六价铬污染。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述李氏禾内生细菌将六价铬还原为三价铬。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述李氏禾内生细菌在还原六价铬时的初始pH为6.0,温度为35℃。
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