CN110724653B - 一种阴沟肠杆菌hyn-p47及其制备的生物助悬剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阴沟肠杆菌（Enterobacter sp.）HYN‑P47及其制备的生物助悬剂，该菌株已于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC）（湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学），保藏编号：CCTCC M 2019247。本发明的菌株可用于发酵制备生物助悬剂，其生产的生物助悬剂具有良好的悬浮稳定性，具有广阔的应用前景和良好的经济效益。

Description

一种阴沟肠杆菌HYN-P47及其制备的生物助悬剂

技术领域

本发明涉及属于生物技术领域，特别涉及一种阴沟肠杆菌HYN-P47及其制备的生物助悬剂。

背景技术

混悬液是指固体颗粒以微粒状态分散于分散介质中形成的非均匀的液体体系。混悬液属于热力学不稳定的粗分散体系，固体颗粒容易出现沉淀现象。因此，要提高混悬液体系稳定性，常常需要添加助悬剂等添加剂。

助悬剂是一类具有粘性的亲水性物质，其可以增加分散介质的粘度减慢微粒的沉降速度，并可吸附在微粒表面形成微粒聚集结块的屏障，防止或减少微粒间的吸引或絮凝，维持微粒比较均匀的分散状态。助悬剂主要有低分子助悬剂和高分子助悬剂两大类，低分子助悬剂有甘油、山梨醇等。高分子类助悬剂包括天然的高分子助悬剂如琼脂、阿拉伯胶、果胶、海藻酸钠、淀粉、黄原胶等；合成或半合成高分子助悬剂如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素等。目前，在医药、食品、石油化工等行业中，应用最广泛的助悬剂主要是一些高分子助悬剂。但是这些高分子助悬剂在使用中还存在各种自身的不足。如琼脂是助悬剂的常用原料，其悬浮能力强，但使用琼脂时溶液的流动性和透明度不好，甚至会出现结冻现象，酸性较强时琼脂还会降解；淀粉也存在相类似的现象，放置后容易重新凝沉等；果胶的透明度好，但悬浮能力较差；卡拉胶不耐酸和高温。而羧甲基纤维素钠等半合成助悬剂溶解于水的速度较慢，也给工业应用造成一定困难，合成这些半合成助悬剂过程中也会产生大量废弃物，对环境造成一定污染。此外琼脂、阿拉伯胶等从植物中获得的助悬剂生产受季节、地域的影响较大，不利于工业化连续生产。为此，我们提出一种阴沟肠杆菌及其生产的生物助悬剂。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种阴沟肠杆菌及其生产的生物助悬剂，利用阴沟肠杆菌发酵生产助悬剂，且阴沟肠杆菌发酵过程对环境影响较小，形成的废弃物能生物降解，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种阴沟肠杆菌HYN-P47， 2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2019247。

进一步地，所述生物助悬剂是通过权利要求1所述的阴沟肠杆菌对原料发酵后加工制备的，所述原料分为A组和B组，A组为葡萄糖、酵母膏、牛肉膏；B组为葡萄糖，硫酸铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠，酵母膏。

进一步地，所述A组原料的质量体积比（g/ml）分别为葡萄糖1-5%，酵母膏0.1-0.5%和牛肉膏0.2-1%；所述B组原料的质量体积比（g/ml）分别为葡萄糖 2-4%，硫酸铵0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.3-0.8%，磷酸二氢钾 0.1-0.5%，氯化钠0.1%，酵母膏0.5-1%。

进一步地，所述A组原料的pH值为7.0。

一种生物助悬剂的制备方法，包括如下步骤：

S1.用接种环从斜面挑取阴沟肠杆菌HYN-P47菌种接种于三角摇瓶中，三角瓶中培养基由A组原料制成，振荡培养；

S2.将步骤S1培养好的菌种接入种子罐，种子罐中培养基由B组原料制成，培养至对数生长期得种子液；

S3.将S2种子液接入发酵罐，发酵罐中培养基由B组原料制成，发酵结束后得到含生物助悬剂的发酵液；

S4.将S3制得的发酵液于离心机上离心10~20 min，收集上清液；

S5.将S4收集的上清液用超滤膜进行一次浓缩得一次浓缩液，一次浓缩液再在60~70℃真空中进行二次浓缩得二次浓缩液；

S6.向S5的二次浓缩液中加入3~5倍体积无水乙醇，4℃沉淀12小时后离心，收集沉淀物干燥后得生物助悬剂。

优选地，所述S2中菌种的接入量按体积比占比为1-5%，即菌种量体积与接种后培养液的体积比， V_菌种/（V_菌种+V_{种子培养基}）；所述S3中种子液接入量按体积比占比为1-10%，即种子液体积与接种后发酵液的体积比，V_种子液/ V_种子液+V_{发酵培养基}。

优选地，所述S2种子罐培养条件：通风量为1~2VVM，搅拌速度为150~200r/min，培养温度为32℃，培养时间为36~48h。

优选地，所述S3发酵罐发酵条件：通风量为0.8~1.2VVM，搅拌速度为120~180r/min，培养温度为32℃，培养时间为3天。

优选地，所述S5中超滤膜的截留分子量为1万。

优选地，所述S5一次浓缩液的体积为所用上清液体积的1/3，二次浓缩液体积为所用上清液体积的1/10。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的菌株制备生物助悬剂生产周期短，成本低，所生产的生物助悬剂具有良好的悬浮稳定性、水溶性、对热及酸碱的稳定性，溶于水中无色无味，与多种盐类有很好的相容性，且微生物发酵生产的生物助悬剂适合工业化大规模生产，且不受地域、季节等条件限制，同时本发明生产的生物助悬剂及生产中产生的废弃物都能生物降解，符合当下环保和可持续发展的要求，因此本发明提供的生物助悬剂具有良好的发展前景，也能满足各行业对特殊性质助悬剂的需求。

附图说明

图1为菌种纯培养照片。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：菌株的分离筛选、鉴定

先用自来水冲洗新鲜野葛根和茎，除去表面的泥土等杂质，再用无菌水冲洗3遍，等植物稍干之后，切成0.5 cm左右长的样块，样块用75%乙醇消毒4 min，无菌水漂洗三次，再用0.1%升汞灭菌4 min，最后用无菌水漂洗三次，用无菌滤纸将植物样品表面水分吸干，用无菌镊子和手术刀将样品撕开，放置于平板上，每平板放置4片，30 ℃培养。待各组织的切面处长出菌落后，挑取菌体并进行划线分离获得纯培养物，获得阴沟肠杆菌HYN-P47，保存于斜面。

按照生工SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取总DNA。以上述提取的总DNA为模板，采用引物50F/1492R进行PCR扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，由电泳结果切割所需DNA目的条带，按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行纯化回收。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序。测序结果如下：

TTGCTCTCGGGTGAGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGCATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCCGGCTT

将测得菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析，经Blast序列比对及系统进化树分析，结果表明：本发明的菌株位于系统发育树中肠杆菌(Enterobacter .sp)分支中，与Enterobacter cloacae有最近的亲缘关系，HYN-P47 16SrRNA基因序列与Enterobacter cloacae strain NIBSM_OsR9的同源性为99%，与Enterobacter cloacae strain PaKu4同源性为99%，结合进化树，确定其为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。

本发明提供的阴沟肠杆菌HYN-P47（Enterobacter cloacae HYN-P47 ），该菌于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC）（湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学），保藏编号：CCTCC NO：M 2019247。

以下实施例2-4中，菌种的接入量按体积比计算方法：菌种量体积与接种后培养液的体积比，即V_菌种/（V_菌种+V_{种子培养基}）；种子液接入量计算方法：种子液体积与接种后发酵液的体积比，V_种子液/ V_种子液+V_{发酵培养基}。

实施例2

本实施例说明用菌株阴沟肠杆菌HYN-P47制备生物助悬剂的方法，包括以下步骤：

S1.用接种环从斜面挑取阴沟肠杆菌HYN-P47菌种接种于三角摇瓶中，于32℃，150r/min振荡培养2天；其中培养基质量含量和组成为：葡萄糖1%，酵母膏0.1%和牛肉膏0.2%；pH值为7.0；

S2.将步骤S1培养好的菌种按体积比为1%接入种子罐，培养至对数生长期，培养条件为通风量为1VVM，搅拌速度为200r/min，培养温度为32℃，培养时间为48h；培养基质量含量和组成为：葡萄糖2%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾0.3%，磷酸二氢钾 0.1%，氯化钠0.1%，酵母膏0.5%；

S3.将步骤S2的种子液按1%的接种量接入发酵罐，培养基质量含量和组成为：葡萄糖2%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾0.3%，磷酸二氢钾 0.1%，氯化钠0.1%，酵母膏0.5%；培养条件为通风量为0.8VVM，搅拌速度为180r/min，培养温度为32℃，培养时间为3天，发酵结束后得到含生物助悬剂的发酵液；

S4.将步骤S3所得的发酵液于4000 rpm离心20 min，收集上清；

S5.将S4收集的上清液用截留分子量为1万的超滤膜进行一次浓缩，一次浓缩液的体积为所用上清液体积的1/3，将一次浓缩液再在60℃真空浓缩至所用上清液体积的1/10；

S6.向S5的二次浓缩液中加入3体积无水乙醇，4℃低温沉淀12小时后，4000 rpm离心20 min，收集沉淀物真空干燥得生物助悬剂。

实施例3

本实施例说明用菌株阴沟肠杆菌HYN-P47制备生物助悬剂的方法，包括以下步骤：

S1.用接种环从斜面挑取阴沟肠杆菌HYN-P47菌种接种于三角摇瓶中，于32℃，150r/min振荡培养2天；其中培养基质量含量和组成为：葡萄糖2%，酵母膏0.25%，牛肉膏0.5%,；pH值为7.0；

S2.将步骤S1培养好的菌种按体积比为2.5%接入种子罐，培养至对数生长期，培养条件为通风量为1VVM，搅拌速度为200r/min，培养温度为32℃，培养时间为48h；培养基质量含量和组成为：葡萄糖3%，硫酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾 0.2%，氯化钠0.1%，酵母膏0.7%；

S3.将步骤S2的种子液按5%的接种量接入发酵罐，培养基质量含量和组成为：葡萄糖3%，硫酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾 0.2%，氯化钠0.1%，酵母膏0.7%；培养条件为通风量为0.8VVM，搅拌速度为180r/min，培养温度为32℃，培养时间为3天，发酵结束后得到含生物助悬剂的发酵液；

S4.将步骤S3所得的发酵液于4000 rpm离心20 min，收集上清；

S5.将S4收集的上清液用截留分子量为1万的超滤膜进行一次浓缩，一次浓缩液的体积为所用上清液体积的1/3，将一次浓缩液再在60℃真空浓缩至所用上清液体积的1/10；

S6.向S5的二次浓缩液中加入4体积无水乙醇，4℃低温沉淀12小时后，4000 rpm离心20 min，收集沉淀物真空干燥得生物助悬剂。

实施例4

本实施例说明用菌株阴沟肠杆菌HYN-P47制备生物助悬剂的方法，包括以下主要的步骤：

S1.用接种环从斜面挑取阴沟肠杆菌HYN-P47菌种接种于三角摇瓶中，于32℃，150r/min振荡培养2天；其中培养基质量含量和组成为：葡萄糖5%，酵母膏0.5%和牛肉膏1%；pH值为7.0；

S2.将步骤S1培养好的菌种按体积比为5%接入种子罐，培养至对数生长期，培养条件为通风量为1VVM，搅拌速度为200r/min，培养温度为32℃，培养时间为48h；培养基质量含量和组成为：葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，磷酸氢二钾0.8%，磷酸二氢钾 0.5%，氯化钠0.1%，酵母膏1%；

S3.将步骤S2的种子液按10%的接种量接入发酵罐，培养基质量含量和组成为：葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，磷酸氢二钾0.8%，磷酸二氢钾 0.5%，氯化钠0.1%，酵母膏1%；培养条件为通风量为0.8VVM，搅拌速度为180r/min，培养温度为32℃，培养时间为3天，发酵结束后得到含生物助悬剂的发酵液；

S4.将步骤S3所得的发酵液于4000 rpm离心20 min，收集上清；

S5.将S4收集的上清液用截留分子量为1万的超滤膜进行一次浓缩，一次浓缩液的体积为所用上清液体积的1/3，将一次浓缩液再在60℃真空浓缩至所用上清液体积的1/10；

S6.向S5的二次浓缩液中加入5体积无水乙醇，4℃低温沉淀12小时后，4000 rpm离心20 min，收集沉淀物真空干燥得生物助悬剂。

实施例5

将实施例3制备的生物助悬剂应用于炉甘石混悬剂中，通过沉降容积比和重分散性考察其混悬效果。

沉降容积比测定方法为：取充分混匀的混悬液50ml置于量筒内，量筒中混悬液原始高度记为H0，静置一定时间后，混悬液沉降物高度为H，则其沉降容积比F=(H/H0)×100%，F值越大，混悬液就愈稳定。

重新分散性测定方法为：取静置一定时间发生沉降的混悬液，用手上下振摇数次，观察底部沉降物是否容易消失。

将炉甘石和氧化锌分别研磨并过150目筛。依照处方称取研细的炉甘石15g和氧化锌5g，混合均匀。取5ml甘油和20ml蒸馏水混合均匀后，逐渐加入炉甘石和氧化锌混合的粉末，并研磨成糊状，然后逐渐加入含本发明的生物助悬剂0.5g的水溶液80ml，再充分研匀，得炉甘石混悬剂。另外一份操作相同，加入不含本发明的生物助悬剂的蒸馏水80ml，充分研匀，得炉甘石混悬剂对照物。再分别取充分混匀的两份炉甘石混悬液分别静置12、24、48和168小时，分别测定其沉降容积比。结果表明加了本发明的生物助悬剂的混悬液沉降容积比分别为94%、90%、88%和68%，而未加生物助悬剂的沉降容积比分别为61%，25%，22%，10%以下，从结果可以看出本发明生物助悬剂具有良好的助悬性能，添加以后能明显提高悬浮液的稳定性。通过测定两种混悬剂的重新分散性也发现，不加生物助悬剂后，混悬剂重新分散性不好，而加入本发明生物助悬剂的混悬液较容易重新分散。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 一种阴沟肠杆菌HYN-P47及其制备的生物助悬剂

<130> 2019

<141> 2019-07-04

<150> 2019105997955

<151> 2019-07-04

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1381

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter)

<400> 2

ttgctctcgg gtgagagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg 60

gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga 120

ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg 180

gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga 240

gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc 300

ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg 360

ggaggaaggt gttgtggtta ataaccacag caattgacgt tacccgcaga agaagcaccg 420

gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact 480

gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct 540

gggaactgca ttcgaaactg gcaggctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg 600

tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca 660

aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 720

cacgccgtaa acgatgtcga tttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa 780

cgcgttaaat cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg 840

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc 900

tggtcttgac atccacagaa ctttccagag atgcattggt gccttcggga actgtgagac 960

aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga 1020

gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt taggccggga actcaaagga gactgccagt 1080

gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg accagggcta 1140

cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca 1200

taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct 1260

agtaatcgta gatcagaatg ctacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1320

tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt aaccttcggg agggccggct 1380

t 1381

Claims (10)

1.一种阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HYN-P47，其特征在于：2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2019247。

2.一种生物助悬剂，其特征在于：所述生物助悬剂是通过权利要求1所述的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HYN-P47对原料发酵后加工制备的，所述原料分为A组和B组，A组为葡萄糖、酵母膏、牛肉膏；B组为葡萄糖，硫酸铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠，酵母膏。

3.如权利要求2所述的一种生物助悬剂，其特征在于：所述A组原料的质量体积比g/ml，分别为葡萄糖1-5%，酵母膏0.1-0.5%和牛肉膏0.2-1%；所述B组原料的质量体积比g/ml，分别为葡萄糖 2-4%，硫酸铵0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.3-0.8%，磷酸二氢钾 0.1-0.5%，氯化钠0.1%，酵母膏0.5-1%。

4.如权利要求2-3任一项所述的一种生物助悬剂，其特征在于：所述A组原料的pH值为7.0。

5.一种如权利要求2所述的生物助悬剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.用接种环从斜面挑取阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HYN-P47菌种接种于三角摇瓶中，三角瓶中培养基由A组原料制成，振荡培养；

S2.将步骤S1培养好的菌种接入种子罐，种子罐中培养基由B组原料制成，培养至对数生长期得种子液；

S3.将S2种子液接入发酵罐，发酵罐中培养基由B组原料制成，发酵结束后得到含生物助悬剂的发酵液；

S4.将S3制得的发酵液于离心机上离心10~20 min，收集上清液；

S5.将S4收集的上清液用超滤膜进行一次浓缩得一次浓缩液，一次浓缩液再在60~70℃真空中进行二次浓缩得二次浓缩液；

S6.向S5的二次浓缩液中加入3~5倍体积无水乙醇，4℃沉淀12小时后离心，收集沉淀物干燥后得生物助悬剂。

6.如权利要求5所述的一种生物助悬剂的制备方法，其特征在于：所述S2中菌种的接入量按体积比占比为1-5%，即菌种量体积与接种后培养液的体积比， V_菌种/（V_菌种+V_{种子培养基}）；所述S3中种子液接入量按体积比占比为1-10%，即种子液体积与接种后发酵液的体积比，V_种子液/ V_种子液+V_{发酵培养基}。

7.如权利要求5所述的一种生物助悬剂的制备方法，其特征在于：所述S2种子罐培养条件：通风量为1~2VVM，搅拌速度为150~200r/min，培养温度为32℃，培养时间为36~48h。

8.如权利要求5所述的一种生物助悬剂的制备方法，其特征在于：所述S3发酵罐发酵条件：通风量为0.8~1.2VVM，搅拌速度为120~180r/min，培养温度为32℃，培养时间为3天。

9.如权利要求5所述的一种生物助悬剂的制备方法，其特征在于：所述S5中超滤膜的截留分子量为1万。

10.如权利要求5所述的一种生物助悬剂的制备方法，其特征在于：所述S5一次浓缩液的体积为所用上清液体积的1/3，二次浓缩液体积为所用上清液体积的1/10。

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