CN112522248B - 一种包裹型阴沟肠杆菌y16固体菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种包裹型阴沟肠杆菌y16固体菌剂的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用。按重量份数比，将海藻酸盐和谷物粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂。所述固体菌剂可以阴沟肠杆菌Y16对进行物理和化学保护作用，提高其在土壤的存活能力，可以提高植物对土壤重金属的修复效果，具有较大的应用前景。

Description

一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及功能微生物菌剂技术领域，更具体地，涉及一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用。
背景技术
镉属于高毒性金属，人类活动导致了镉从多途径(采矿、施肥和污水灌溉等)迁移到农田，影响土壤环境质量和农产品安全，其中中国南方地区农田土壤的镉含量相对偏高。农田土壤中镉含量的增加造成种植在这些土壤的农作物面临镉超标的风险，如水稻和小麦的镉超标。根际促生菌是一种生存在植物根系土壤的友好型细菌，它能分泌ACC脱氨酶、吲哚乙酸和细胞分裂素等物质，促进植物生长，降低植物非生物胁迫(盐胁迫、重金属胁迫和养分胁迫等)和提高植物抗病能力。此外，根际促生菌分泌的低分子有机酸和表面活性剂不仅能活化土壤中的难溶态镁、钾、钙等矿质营养元素，提高根际土壤的养分，还能通过酸化、沉淀、络合和氧化还原反应的作用改变重金属在土壤的生物有效性。因此，根际促生菌在重金属污染土壤修复领域具有前景。
产铁载体菌(SPB)作为一种常见的根际促生菌，在强化重金属超富集植物提取土壤重金属污染应用中有很强的潜力。例如：专利CN110616164A公开了一株可活化难溶性磷、镉的产铁载体菌-阴沟肠杆菌(Enterobacte cloacae)Y16，该产铁载体菌能提高土壤铁元素的生物有效性，帮助在缺铁土壤生长的植物获取铁营养，促进植物生长，并通过分泌表面活性剂，活化土壤中的难溶态重金属镉，提高土壤重金属镉的生物有效态，有助于超富集植物对土壤重金属镉的吸收和转运。但是，产铁载体菌在土壤环境易中受到微生物间生态位的竞争压力和外部干燥的环境等压力胁迫下往往存活能力极低，这会严重影响到产铁载体菌参与的植物重金属修复过程。因此，研发合适的菌剂载体提供适应的生态位，并对产铁载体菌进行物理和化学保护作用，提高产铁载体菌在土壤的存活能力极为重要。目前，多用生物炭做为细菌的吸附载体制备成固体菌剂，但是由于生物炭对土壤重金属具有极强的物理化学吸附特性，阻碍了植物对土壤中重金属的提取过程，因此并不适用于植物重金属修复过程，因此研制出适用于植物重金属修复的固体菌剂，提高植物对土壤重金属的提取效率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供由上述制备方法制备得到的包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂。
本发明的第三个的目的在于提供所述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法，按重量份数比，将海藻酸盐和谷物粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂；所述海藻酸盐、谷物粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2～5：5～10：80～100：1～3。
由于固体菌剂其组成成分须对土壤环境和微生物无害，因此本发明固体菌剂采用的海藻酸盐是一种天然的阴离子聚合物，通常从褐藻中提取，与二价钙离子结合形成低毒性的温和凝胶，对促生菌具有包裹保护作用。谷物粉不仅能为促生菌提供碳源，还能增加土壤有机质，促进植物生长；乳清粉可有效降低后续冷冻干燥过程中形成的冰晶对促生菌的损害，提高促生菌的在固体菌剂的再水合化的复苏能力，具有延长菌剂的保存时间，提高促生菌的存活能力的作用。制备得到的固体菌剂可以阴沟肠杆菌Y16对进行物理和化学保护作用，提高其在土壤的存活能力，提高植物对土壤重金属的修复效果。
优选地，所述海藻酸盐为海藻酸钠。
优选地，所述谷物粉为黑麦粉。
优选地，所述阴沟肠杆菌Y16菌液浓度为107～108CFU/mL。
进一步优选地，所述阴沟肠杆菌Y16菌液浓度为108CFU/mL。
优选地，所述钙盐为氯化钙。
优选地，所述钙盐溶液浓度为0.1mol/L～0.3mol/L。
进一步优选地，所述钙盐溶液浓度为0.1mol/L。
优选地，所述海藻酸盐、谷物粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2：7.5：100：2。
优选地，所述真空冷冻干燥为-45～-55℃下真空冷冻干燥2～3d。
进一步优选地，所述真空冷冻干燥为-50℃下真空冷冻干燥2d
本发明还提供上述任一所述的制备方法制备得到的包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂。
优选地，所述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂粒径约为2毫米。
本发明还提供上述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂在强化植物重金属修复效果中的应用。
优选地，所述植物为龙葵。
优选地，所述重金属为镉。
优选地，所述土壤为农田土壤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过将阴沟肠杆菌Y16与一定比例的海藻酸盐，谷物粉，乳清粉混匀，滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，冷冻干燥后制备成包裹型固体菌剂。所述固体菌剂可以阴沟肠杆菌Y16对进行物理和化学保护作用，提高其在土壤的存活能力，可以提高植物对土壤重金属的修复效果，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为两种固体菌剂的外观。
图2为添加剂对菌剂释菌能力的影响。
图3为添加剂对菌剂保存时间的影响。
图4为龙葵各处理组生物量。
图5为龙葵各处理组镉积累量。
图6为龙葵各处理组镉富集系数。
图7为包裹型菌剂的SEM扫描电镜。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
供试菌株：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Y16，简称EC菌株，所述菌株于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60524。
实施例1不同类型菌剂的制备
将EC菌从斜面培养基接种到LB液体培养基中，在28℃，150r/min摇床条件培养14-18h，4000r/min离心10min收集菌体，用无菌水等体积重悬备用(菌液浓度为108CFU/mL)。
粉末型菌剂制备：称取70g的黑麦粉末与20g的硅藻土，均匀混合，高温灭菌，冷却后将固体粉末与EC菌液按1：1的比例搅拌混合，在28℃，150r/min摇床条件培养3d，然后加入5g的麦芽糖粉和5g的乳清粉均匀混合，-50℃下进行真空冷冻干燥2d。
包裹型菌剂制备：称取将2g的海藻酸钠和7.5g的黑麦粉放置于100mL无菌水溶剂搅拌混合，高温灭菌，冷却后加入2g的乳清粉，将黏稠的溶液与EC菌液按1：1的比例搅拌混合，利用滴管吸取溶液，缓慢滴入0.1mol/L的氯化钙溶液，形成胶粒状固体小球，-50℃下进行真空冷冻干燥2d。
如图1所示，由海藻酸钠和黑麦粉为主体制备成的称为包裹型菌剂，由黑麦粉和硅藻土制备成的称为粉末型菌剂。两种固体菌剂在外观上有明显差异，包裹型菌剂为颗粒状小球，直径约为2毫米，粉末型菌剂为粉末状固体。
实施例2添加剂对菌剂的释菌能力的影响
将麦芽糖和乳清粉做为固体菌剂的添加剂，测试它们对固体菌剂的释菌能力和保存时间的影响。我们设置不添加的空白组(H)，添加麦芽糖组(M)，添加乳清粉组(R)以及添加麦芽糖和乳清粉(MR)这四个实验组，制备方式如实施例1所示。称取1g菌剂悬浮于无菌水中，28℃，150r/min摇床条件培养48h，每间隔6h取溶液，利用抗生素平板对溶液中的目标菌株数量进行计数。如图2所示，与不添加的空白组相比，添加麦芽糖和乳清粉能从不同程度提高了菌剂的释菌数量，其中，添加乳清粉R组和添加麦芽糖和乳清粉MR组均能至少提高了一个数量级的释菌数量，所有处理组在18-20h之后达到稳定的数量级并趋于稳定。另外，我们利用同样的平板计数方法，每隔一段时间对菌剂的存活能力进行了实验。如图3所示，不添加的空白组H组在保存30d之后，固体菌剂的存活数量出现急剧下降的现象，添加麦芽糖的M组的细菌数量虽然也降低了，但是在麦芽糖的作用下得到一定的缓解，而添加乳清粉的R组和添加麦芽糖和乳清的MR组的两个处理组保持了稳定的细菌数量，因此，证实添加麦芽糖和乳清可以延长菌剂的保存时间，提高促生菌的存活能力，通过实验结果观察，我们意外发现，相对于麦芽糖，添加乳清粉对提升菌剂释菌能力和保存能力的贡献是最大的，因此，从取得的效果来看，选择乳清粉做为固体菌剂的添加剂具有最高的性价比。
实施例3施加不同菌剂对龙葵生物量的影响
盆栽设计包括不加菌组(CK)、菌液组(EC)与粉末型菌剂(HMR)、包裹型菌剂(HHR)单独或交互组合，共计6个处理组，每个处理组3个平行，共计18盆。采用直径为18cm的花盆，每盆装有1.5kg农田土壤(总镉含量为：2.249mg/kg，pH值为6.33，有效磷浓度为22.4mg/kg，速效钾的浓度为42.55mg/kg，DTPA态镉的浓度为0.44mg/kg)，调节盆栽中持水率约80％。菌悬浮液的制备：将EC菌液从斜面培养基接种到LB液体培养基中，28℃，150r/min摇床培养14-18h，4000r/min离心10min收集菌体，用无菌水等体积重悬备用(菌液浓度为108CFU/mL)。菌液通过灌根的接种方式注入到龙葵根部土壤，菌剂通过与土壤均匀混合的接种方式加入到龙葵根部土壤。等待龙葵生长45d后分别收集龙葵茎叶、根以及根际土。如图4所示，与施加菌液组相比，添加两种固体菌剂均能增加龙葵总生物量(地上部+根部)，依次为HMR(+64.25％)>HHR(+18.58％)。其中，龙葵地上部的生物量增长以粉末型菌剂HMR组合的增加最为显著，依次为HMR(+65.56％)>HHR(+19.81％)。龙葵根部的生物量增长以粉末型菌剂HMR组合的增加最为显著，为HMR(+36.00％)。证实施加固体菌剂能提高龙葵生物量，促进龙葵的生长，这可能是菌剂载体提高促生菌在土壤的存活能力，提供了物理和化学保护并为促生菌提供生长所需的营养。另外，与不加菌的空白组相比，不加菌的菌剂载体组均能提高了龙葵的生物量，说明制备菌剂的载体材料并不会抑制龙葵的生长。
实施例4不同菌剂对龙葵镉积累量的影响
收获龙葵茎叶和根，放置烘箱中在105℃下杀青0.5h，然后在60℃下完全烘干。称取适量样品，经浓硝酸消解后测得溶液重金属浓度，并通过换算得到龙葵镉积累量。如图5所示，与施加菌液组相比，添加两种固体菌剂均能增加龙葵总镉积累量(地上部+根部)，依次为HHR(+35.30％)>HMR(+13.30％)。其中，龙葵地上部的镉积累量以包裹型菌剂HHR组的增加最为显著，依次为HHR(+28.10％)>HMR(+12.79％)。龙葵根部的镉积累量以包裹型菌剂HHR组合的增加最为显著，依次为HHR(+192.02％)>HMR(+24.47％)。证实施加固体菌剂能进一步提高龙葵对土壤重金属镉的提取，其中，包裹型HHR固体菌剂效果最优。如图6所示，与施加菌液组相比，添加包裹型菌剂HHR组合能增加龙葵的总镉富集能力(地上部+根部)，为HHR(+83.90％)，其中，龙葵地上部的镉富集系数以包裹型菌剂HHR组合的增加最为显著，为HHR(+20.98％)。龙葵根部的镉富集系数以包裹型菌剂HHR组合的增加最为显著，为HHR(+168.90％)。而粉末型菌剂组HMR组合的龙葵镉富集系数则出现降低，因此，施加包裹型菌剂HHR组合较粉末型菌剂HMR组合在提高龙葵根部对土壤重金属镉的富集能力的效果上更优。
实施例5包裹型菌剂HHR组合的SEM扫描电镜
将包裹型菌剂HHR组合放置于铜台制样，进行SEM扫描电镜观测。如图7所示，左边为不加菌的菌剂载体，表面粗糙，带有褶皱，右边为加菌的固体菌剂HHR组合，我们可以看到促生菌密集分布在菌剂的表面。

Claims (6)

1. 一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法，其特征在于，按重量份数比，将海藻酸钠和黑麦粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入氯化钙溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂；所述海藻酸钠、黑麦粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2：7.5：100：2；所述阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60524。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阴沟肠杆菌Y16菌液浓度为107～108 CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钙溶液浓度为0.1mol/L～0.3mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥为-45～-55℃下真空冷冻干燥2～3d。
5.权利要求1～4任一所述的制备方法制备得到的包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂。
6.权利要求5所述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂在强化植物重金属修复效果中的应用。
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