CN106011040B - 一株降解氧氟沙星的苍白杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株降解氧氟沙星的苍白杆菌，属于微生物技术领域，其分类命名为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，菌株号为OF‑13，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10539，保藏日期为2015年2月9日。在实验室摇瓶条件下该菌株对500ug/L氧氟沙星的降解率达97.2％，解决了含抗生素废水对微生物产生抑制而影响其处理效果的问题。该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低、效率高、无二次污染，具有很好的应用前景。

Description

一株降解氧氟沙星的苍白杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一株降解氧氟沙星的苍白杆菌其应用。
背景技术
抗生素是指具有水溶性和脂溶性医学特征的一类化学物质，不仅能杀灭细菌，而且对霉菌、支原体、衣原体等致病微生物也具有良好的抑制和杀灭作用，可作为治疗各种细菌感染或以致病微生物感染的药物而在医药业得到广泛使用。通常抗生素污染物蒸气压较小、疏水性不强，主要存在于水环境中，水中含有多种难降解的生物毒性物质和浓度较高的活性抗生素，抑制了废水生化处理中微生物的生长，因此现有的水处理技术很难将抗生素彻底清除，一部分抗生素又会随着处理后的废水进入水和土壤中。低浓度抗生素的长期存在对微生物群落有一定的影响，大量研究表明，抗生素的使用能诱导病原菌产生一些能够抵抗抗生素的病原菌，通常水生系统中每升范围内微克量的抗生素就会导致耐药菌株的增加，从而破坏了生态系统的平衡，一旦这些耐药基因转移给致病菌，该影响就会通过食物链对高级生物发生作用，更增加了对人和动物健康的威胁。另外，畜用抗生素也会通过肉类食品进入人类食物链，致使各种肉类及奶制品中抗生素含量常常超标，引起人的过敏反应，严重时甚至会造成食物中毒，而且部分抗生素药物可能具有致畸、致癌、致突变作用，严重干扰了人类各项生理机能，威胁人类健康。
氧氟沙星(OFLX)是当前广泛应用于临床的第三代喹诺酮抗生素(氟喹诺酮类)的代表药物之一。由于氧氟沙星的喹诺酮环的稳定性和抗水解能力使其成为持久性污染物，目前已多次在水体中被检测出来。微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，已在很多方面得到应用，所以筛选出氧氟沙星降解菌对于处理氧氟沙星生产废水具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株降解氧氟沙星的苍白杆菌，具有较高降解氧氟沙星的性能。
本发明还要解决的技术问题是提供上述苍白杆菌的应用，利用微生物的方法来降解废水中的污染物，适用于现代废水处理工艺，使废水达标排放，同时降低生产和使用成本。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株降解氧氟沙星的苍白杆菌，其分类命名为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，菌株号为OF-13，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC NO.10539，保藏日期为2015年2月9日。菌株OF-13是发明人于2015年1月在江苏省南京市发现并筛选得到的，所述的菌株OF-13其主要生物学特性为革兰氏阴性，以周生鞭毛运动，专性好氧，严格呼吸代谢，氧化酶和接触酶阳性，不产生吲哚，不水解纤维素和七叶灵。在添加50mg/L无水哌嗪为底物的情况下，可以很好地降解氧氟沙星。测得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1355bp，其基因序列如SEQ ID No：1所示。
一种固定化微球，将所述的苍白杆菌固定于微球上。
其中，所述的固定化微球按照如下步骤制备得到：
(1)将菌株OF-13接种于LB液体培养基中于30℃下培养至对数期；
(2)将步骤(1)得到的菌液固液分离后去除掉清液，用无菌水洗涤菌体，再用无菌水重悬菌体；
(3)将步骤(2)得到的菌体液与含有Fe3O4和海藻酸钠的水溶液混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的CaCl2水溶液，于4℃交联钙化8h后得到海藻酸钙凝胶固定化微球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。
步骤(1)中，所述的LB培养基配方为：NaCl 10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，pH7.0。
步骤(3)中，所述的菌体液与含有Fe3O4和海藻酸钠的水溶液的体积比为1:20；其中，所述的菌体液中，菌体的浓度OD600nm＝1.0，所述的含有Fe3O4和海藻酸钠的水溶液中，Fe3O4的浓度为100mg/L，海藻酸钠的浓度为6wt％。
步骤(3)中，所述的CaCl2水溶液中，CaCl2的浓度为4wt％。
上述苍白杆菌在降解氧氟沙星中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述固定化微球在降解氧氟沙星中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，氧氟沙星存在的环境优选为水体。
具体的应用方法优选为：先将固定化小球在废水中曝气10h进行活化，活化过程中水温28±2℃，曝气量在1.5L/min，然后在温度为28±2℃、pH值为6.8-7.2，添加无水哌嗪使哌嗪浓度为50mg/L，在氧氟沙星进水浓度500μg/L的情况下，每升氧氟沙星废水采取200ml的固定化小球来处理，同时，水力停留时间为72h，在这种情况下氧氟沙星的去除率在90％以上，有较好的去除效果。
有益效果：本发明所述的氧氟沙星降解菌株OF-13能以氧氟沙星和无水哌嗪发生共代谢生长。本发明提供了一种菌株OF-13所制备的固定化小球，实验室生物降解实验结果表明，固定化小球对500μg/L氧氟沙星的降解率达到90％以上。该发明生产的降解菌OF-13的固定化小球具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，可以降解废水中的氧氟沙星，适合在含有氧氟沙星的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。
附图说明
图1菌株OF-13菌体结晶紫染色照片(1000x)；
图2固定化小球对氧氟沙星降解去除率随时间变化的示意图；
图3为固定化小球对氧氟沙星不同进水浓度的降解去除率。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：氧氟沙星降解菌株OF-13的分离和鉴定。
取氧氟沙星富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含500ug/L氧氟沙星的无机盐固体培养基上，其配方为：每升含1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O、1.0gNaCl、1.0g(NH4)2SO4，0.05g无水哌嗪，20g琼脂，pH 7.0，30℃培养7天。7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于5ml的LB液体培养基中培养24小时后，于8000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入5ml的无菌水摇匀，仍于8000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入5ml无菌水悬浮该菌。吸取1ml该菌液加入100ml氧氟沙星浓度为500ug/l的无机盐液体培养基中，其配方为：每升含1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2gMgSO4·7H2O、1.0g NaCl、1.0g(NH4)2SO4，0.05g无水哌嗪，pH 7.0，于160r/min，30℃条件下振荡培养72h后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。其菌体革兰氏染色照片(1000x)如图1所示，鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum)；命名为：OF-13。主要生物学特性为革兰氏阴性，以周生鞭毛运动，专性好氧，严格呼吸代谢，氧化酶和接触酶阳性，不产生吲哚，不水解纤维素和七叶灵。能以氧氟沙星和无水哌嗪发生共代谢生长。如图2所示，在实验室摇瓶条件下游离细菌和固定化小球对500ug/L氧氟沙星的降解率均可达到90％以上。
实施例2：菌株OF-13制备成固定化小球的方法。
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30℃，160r/min条件下振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌液于10000r/min的条件下离心2min，倒掉上清液，加入相同体积的无菌水，摇匀后10000r/min离心2min，如此洗两遍，用相同体积的无菌水悬浮，制成菌体液。
3)取1ml菌体液与20ml含有100mg/L纳米Fe3O4的6％海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的4％CaCl2溶液，于4℃交联钙化8h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。
步骤1)中所述的LB培养基为：NaCl 10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，pH7.0。
实施例3：固定化小球在氧氟沙星降解中的应用方法。
先将固定化小球在废水中曝气10h进行活化，活化过程中水温28±2℃，曝气量在1.5L/min，然后在温度为28±2℃、pH值为6.8-7.2，添加无水哌嗪使哌嗪浓度为50mg/L，在氧氟沙星进水浓度500μg/L的情况下，每升氧氟沙星废水采取200ml的实施例2所制备的固定化小球来处理，同时，水力停留时间为72h，如图2所示，在这种情况下氧氟沙星的去除率在90％以上，有较好的去除效果；而图3显示了对于不同进水浓度的氧氟沙星的去除情况，研究表明，氧氟沙星的去除率随着进水浓度的升高而降低，当进水的氧氟沙星浓度在低于2000μg/L的范围内时，氧氟沙星都有较高的去除率，可以达到70％以上。
通过以上实验可以看出，在温度为28±2℃、pH值为7.0左右，添加无水哌嗪使哌嗪浓度为50mg/L，水力停留时间为72h的条件下，500～2000μg/L的氧氟沙星废水采取200ml/L的固定化微生物小球来处理，都有较好的去除效果。

Claims (10)

1.一株降解氧氟沙星的苍白杆菌，其分类命名为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，菌株号为OF-13，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10539，保藏日期为2015年2月9日。
2.一种固定化微球，其特征在于，将权利要求1所述的苍白杆菌固定于微球上。
3.根据权利要求2所述的固定化微球，其特征在于，所述的固定化微球按照如下步骤制备得到：
(1)将菌株OF-13接种于LB液体培养基中于30℃下培养至对数期；
(2)将步骤(1)得到的菌液固液分离后去除掉清液，用无菌水洗涤菌体，再用无菌水重悬菌体；
(3)将步骤(2)得到的菌体液与含有Fe3O4和海藻酸钠的水溶液混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的CaCl2水溶液，于4℃交联钙化8h后得到海藻酸钙凝胶固定化微球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。
4.根据权利要求3所述的固定化微球，其特征在于，步骤(1)中，所述的LB培养基配方为：NaCl 10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，pH7.0。
5.根据权利要求3所述的固定化微球，其特征在于，步骤(3)中，所述的菌体液与含有Fe3O4和海藻酸钠的水溶液的体积比为1:20；其中，所述的菌体液中，菌体的浓度OD600nm＝1.0，所述的含有Fe3O4和海藻酸钠的水溶液中，Fe3O4的浓度为100mg/L，海藻酸钠的浓度为6wt％。
6.根据权利要求3所述的固定化微球，其特征在于，步骤(3)中，所述的CaCl2水溶液中，CaCl2的浓度为4wt％。
7.权利要求1所述的苍白杆菌在降解氧氟沙星中的应用。
8.权利要求2所述的固定化微球在降解氧氟沙星中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，氧氟沙星存在的环境为水体。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，菌株OF-13能以氧氟沙星和无水哌嗪发生共代谢生长。
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