CN110592068B - 原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂及制备方法与应用 - Google Patents

原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂及制备方法与应用。本发明通过将大环内酯类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液、磁介质菌菌液、营养载体、吸附载体、表面活性剂混合，发酵，得到复合制剂。本发明的大环内酯类抗生素降解菌经定向诱导、能量供给菌伴生、载体耦合可显著提高菌种降解效能，提高降解菌株在原位土壤环境中的定殖、增殖能力；本发明的表面活性剂可化解水分张力，清除包裹在土壤颗粒表层的疏水基团，增强大环内酯类抗生素残留向富含降解菌群的耦合载体中迁移；并利用磁介质菌和吸附载体的磁吸附力提高迁移速率，加快四环素类抗生素残留的降解。从而该修复剂对大环内酯类抗生素降解效率高。

Description

原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂及制备方法 与应用
技术领域
本发明属于环境保护中土壤有机污染物治理领域，特别涉及一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂及制备方法与应用。
背景技术
大环内酯类抗生素是由链霉菌产生的弱碱性抗菌素，因分子中含有一个内酯结构的14或16元环而得名。作用机制是作用于细菌细胞核糖蛋白体50s亚单位，阻碍细菌蛋白质合成，属于生长期抑制剂。它能够有效抑制革兰氏阳性菌以及一些革兰氏阴性菌，被广泛地应用于人类以及畜禽兽细菌感染的治疗和预防，例如牛、羊、猪和家禽的呼吸道疾病、肠道感染和乳腺炎等。红霉素及其衍生物是本类药物最典型的代表，其他还包括阿奇霉素、泰乐菌素、阿维菌素等。研究显示，大环内酯类抗生素在人和动物机体内都不能够被完全代谢。在人和禽畜排泄物中残留浓度较高，而长期使用这些排泄物作为土壤肥料可能导致大环内酯类抗生素在土壤中的积累，对生态环境的负面影响逐渐显现，成为人们日益关注的热点环境问题。
大环内酯类抗生素在土壤中降解的速率，是决定其在环境中的持久性、有效性和危害性的关键因素。而它在土壤中的降解与它们的化学结构、所处的温度，以及其他一些因素如湿度、降雨以及土壤的性质等有关。大环内酯类抗生素在土壤中的降解过程包括生物降解、水解和光降解。其中生物降解是最重要的途径。影响微生物降解的因素除了土壤pH、水分、温度、氧气、环境介质以及环境中其他抗生素的存在以外，最主要的是降解微生物在土壤中的定殖增殖能力、外源性同化作用的供给以及环境适应性问题。目前，虽然有研究报道大环内酯类抗生素单一降解菌株在水介质、堆肥中的降解作用，但效率较低。主要是单一菌株处理技术已很难适应土壤复杂多样的生态环境，迫切需要越来越多的生物组合处理技术。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂。
本发明的又一目的在于提供所述原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂在消解大环内酯类抗生素上的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将营养载体、吸附载体和表面活性剂混合均匀，进行除菌处理，得到耦合载体；
(2)在除菌后的耦合载体中接入大环内酯类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液和磁介质菌菌液，得到混合物I；发酵，得到原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂。
步骤(1)优选如下：将营养载体、吸附载体和表面活性剂混合均匀，用水调节含水率，接着进行除菌处理，得到耦合载体。
所述的营养载体的组成按质量百分比计，如下：氨基酸粉4～12％、糖蜜粉8～14％、蛋白胨4～9％、酵母提取物2～4％、骨粉4～8％、稻壳55～65％。
所述的吸附载体的组成按质量百分比计，如下：磁铁矿粉8～16％、Fe3O4磁性纳米颗粒0～12％、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子0～8％、麦饭石粉25～35％、硅藻土粉25～30％、生物碳15～25％。
所述的表面活性剂优选为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(分子式C20H37NO4S，CAS:268-36-07-7)、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(CDEA，分子式C11H23CON(CH2CH2OH)2，CAS:68603-42-9)、十二烷基硫酸钠(SDS，分子式C12H25NaO4S，CAS:151-21-3)中的一种或至少两种。
所述的表面活性剂为两种以上形成的混合物时，各组分质量份数相同。
所述的混合物I中各成分的组成按质量百分比计，优选如下：菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的大环内酯类抗生素降解菌菌液10～15％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的能量供给菌菌液4～8％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磁介质菌菌液5～10％、营养载体49～65％、吸附载体10～20％、表面活性剂5～7％；优选如下：菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的大环内酯类抗生素降解菌菌液10～15％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的能量供给菌菌液4～8％、菌体浓度为(0.8～1.2)×1012cfu/mL的磁介质菌菌液5～10％、营养载体49～65％、吸附载体10～20％、表面活性剂5～7％。所述的混合物I是忽略不计用以调节含水率的水的。
所述的含水率优选为45～55％。
所述的大环内酯类抗生素降解菌菌液的菌体浓度优选为1.2×1012cfu/mL。
所述的大环内酯类抗生素降解菌优选为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)GB-01、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 17759、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)TS1、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)ATCC BAA-248、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C3(保藏编号为CGMCCNo.13022，于2016年9月21日保藏位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Ery-E、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CICC 10368、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putda)ACCC 10081、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)XP12、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)FY、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)AVM1、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)G10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)G1、苍白杆菌(Ochrobactrum haematophilum)AW1-12、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CICC20697中的一种或至少两种组成；优选为至少六种。
所述的大环内酯类抗生素降解菌菌液优选通过包含如下步骤的方法得到：
①所述的大环内酯类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
②再于30～37℃，120～150r/min条件下继续培养3～5天。
或是通过包含如下步骤的方法得到：
A、将所述的大环内酯类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
B、然后通过含大环内酯类抗生素的培养基进行驯化培养；
C、驯化得到的菌培养至对数增长期；
D、再于30～37℃，120～150r/min条件下继续培养3～5天。
所述的大环内酯类抗生素降解菌为混合菌时，是将大环内酯类抗生素降解菌中的各个菌分别通过振荡培养，培养至对数增长期，如步骤①、步骤A、步骤C；有驯化步骤时，是将各个菌分别进行驯化，如步骤B；然后按等体积比混合再继续培养，如步骤②、步骤D。
步骤①和步骤A中所述的培养的条件优选为于28～30℃，130～150r/min条件下培养。
步骤①和步骤A中所述的培养中的培养基为LB液体培养基或YPD液体培养基。LB液体培养基适合于细菌的培养，YPD液体培养基适合于酵母的培养。
步骤B中所述含大环内酯类抗生素的培养基的组成如下：大环内酯类抗生素110～120mg/L、土150～200g/L，水余量；更优选组成如下：大环内酯类110～120mg/L、土167g/L，水余量。
所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素。
所述的驯化培养的条件优选为于28～30℃，130～150r/min条件下培养5～6天。
所述的驯化培养的次数为3～8次；优选为5～6次。
步骤C中所述的培养的条件优选为于34～37℃，120～130r/min条件下培养48～70h；更优选为于34～37℃，120r/min条件下培养48～70h。
步骤②和步骤D中所述的继续培养的条件优选为于30～37℃，120～150r/min条件下继续培养3～5天。
所述的能量供给菌菌液的菌体浓度优选为1×1012cfu/mL。
所述的能量供给菌为由枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 10628、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ACCC 04259、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ACCC 10158、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)ACCC10387、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)SCTCC 100664中的一种或至少两种组成。
所述的能量供给菌菌液优选通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将能量供给菌培养至对数增长期，再于30～37℃，130～150r/min条件下培养3～4天，得到能量供给菌菌液；CM 0002改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5。
所述的能量供给菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于30～37℃，130～150r/min条件下培养3～4天。
所述的将能量供给菌培养至对数增长期中的培养条件为：于30～37℃，110～130r/min条件下震荡培养48～72h。
所述的磁介质菌菌液的菌体浓度优选为1×1012cfu/mL。
所述的磁介质菌菌液为副球菌(Paracoccus sphaerophysae)ACCC 05413、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yabuuchiae)ACCC 19937、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CICC23919、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)CICC 10828中的一种或至少两种组成。
所述的磁介质菌菌液优选通过如下方法得到：用磁介质菌改良培养基将磁介质菌培养至对数增长期，再于28～38℃，130～150r/min条件下培养3～4天，得到磁介质菌菌液；磁介质菌改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、酪氨酸0.5g/L、氯化亚铁0.1g/L。
所述的磁介质菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于28～38℃，130～150r/min条件下培养3～4天。
所述的将磁介质菌培养至对数增长期中的培养条件为：于28～37℃，130～150r/min条件下震荡培养48～72h。更优选为：于28～37℃，140r/min条件下震荡培养48～72h。
步骤(1)中所述的除菌优选为通过蒸汽灭菌实现。
所述的蒸汽灭菌的时间优选为1～2h。
步骤(2)中所述的发酵的条件优选在密闭式固体发酵反应器中发酵，每隔6h翻堆一次。
一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂，通过上述制备方法得到。
所述原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂在环境修复中的应用，特别适用于大环内酯类抗生素污染土壤修复中的应用。
本发明的优点和技术效果如下：
(1)本发明为大环内酯类抗生素污染土壤的原位消解提供了一种高效复合制剂；
(2)本发明的大环内酯类抗生素降解菌经定向诱导、能量供给菌伴生、载体耦合可显著提高菌种降解效能，提高降解菌株在原位土壤环境中的定殖、增殖能力；
(3)本发明的表面活性剂可化解水分张力，清除包裹在土壤颗粒表层的疏水基团，增强大环内酯类抗生素抗生素残留向富含降解菌群的耦合载体中迁移。并利用磁介质菌和吸附载体的磁吸附力提高迁移速率，加快大环内酯类抗生素残留的降解；
(4)本发明的高效复合制剂在原位消解大环内酯类抗生素抗生素残留的同时，还可提供作物营养，促进作物生长。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围并不限于所述内容。
实施例中所用菌株可由四川省微生物资源平台菌种保藏中心(SICC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、美国模式菌种收集中心(ATCC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)获得。
Fe3O4磁性纳米颗粒、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子由西安瑞禧生物科技有限公司可由提供；其余原料均由市场商业途径获得。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
液体CM 0002改良培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH 7.0～7.5。
实施例1
1、大环内酯类抗生素降解菌群的制备
将洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)GB-01(已在文献“Ali S W,Li R,Zhou W Y,et al.Isolation and characterization of an abamectin-degradingBurkholderia cepacia-like GB-01strain.[J].Biodegradation,2010,21(3):441-452.”中公开)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 17759、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)TS1(已在文献“孙瑞珠,马玉龙,张娟,等.一株泰乐菌素高效降解菌的分离鉴定及其降解特性[J].微生物学通报,2014,41(4):681-690.”中公开)、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)ATCC BAA-248、假单胞菌(Pseudomonassp.)C3、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Ery-E(已在文献“毛菲菲等.红霉素降解菌的筛分及其降解特性的研究.环境科学与技术,2013，36(07)：9-12.”中公开)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CICC 10368、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putda)ACCC 10081、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)XP12(已在文献“解开治,徐培智,陈建生,等.恶臭假单胞菌XP12对拟除虫菊酯类农药的酶促降解特性及其应用研究[J].广东农业科学,2009(12):156-160.”中公开)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)FY(已在文献“刘力嘉,谢丽，张作义等.泰乐菌素高效降解菌的筛选及降解特性研究.农业环境科学学报,2011,30(5):1027-1030”中公开)、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)AVM1(已在文献“李玉华.阿维菌素降解菌的筛选及其降解特性研究[D].扬州大学学位论文.”中公开)、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)G10(已在文献“闫彩虹,王志强.阿维菌素降解菌的分离鉴定及降解特性研究[J].南京农业大学学报,2016,39(01):127-132.”中公开)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)G1(已在文献“王帅,高圣风,高学文,等.枯草芽孢杆菌脂肽类抗生素发酵和提取条件[J].中国生物防治学报,2007,23(4):342-347.”中公开)、苍白杆菌(Ochrobactrum haematophilum)AW1-12(已在文献“胡秀虹,黄剑.阿维菌素降解菌AW1-12的筛选与分类鉴定[J].西南农业学报,2013,26(2):583-586.”中公开)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CICC 20697等15种单个降解菌分别置于培养基中培养至对数期，其中细菌用LB液体培养基培养(培养在28℃、150r/min震荡条件下进行)，制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1011cfu/mL。之后将各单一降解菌种子原液按照等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床30℃、150r/min液体发酵5天制备形成大环内酯类抗生素降解菌群，菌体浓度约为1.2×1012cfu/mL。
2、能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的能量供给菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)ACCC10628、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ACCC 04259分别以同样的接种量加入同样体积的CM 0002改良培养基(pH 7.0)，30℃、120r/min震荡培养72h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床30℃、150r/min液体发酵4天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
3、磁介质菌菌液的制备
分别将LB琼脂斜面培养基上生长良好的磁介质菌副球菌(Paracoccussphaerophysae)ACCC 05413、好鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yabuuchiae)ACCC 19937分别以同样的接种量加入同样体积的磁介质菌CM 0003改良培养基[配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L、酪氨酸(Tyrosine)0.5g/L、氯化亚铁(FeCl2)0.1g/L]，28℃、140r/min震荡培养72h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床30℃、150r/min液体发酵4天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
4、原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备
将49％营养载体(氨基酸粉12％、糖蜜粉8％、蛋白胨5％、酵母提取物2％、骨粉8％、稻壳65％)、20％吸附载体(磁矿粉16％、Fe3O4磁性纳米颗粒12％、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子7％、麦饭石粉25％、硅藻土粉25％、生物碳15％)、7％表面活性剂[聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(分子式C20H37NO4S，CAS:268-36-07-7)按等质量进行混合]按质量百分比混合均匀形成耦合载体，调节含水率为45％后装入密闭式固体发酵反应器中搅拌蒸汽灭菌2h，待自然冷却至35℃时，分别按15％大环内酯类抗生素降解菌群(步骤1)、4％能量供给菌菌液(步骤2)、5％磁介质菌菌液(步骤3)喷雾接种于已灭菌的耦合载体中，在密闭式发酵反应器中发酵，每隔6h翻堆一次。待发酵产物水分含量小于30％，重金属含量符合GB/T23349-2009标准，有效活菌数大于2×1011cfu/g时，即制得原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂。
实施例2
1、大环内酯类抗生素降解菌群的制备
将洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 17759、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C3、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CICC 10368、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)FY(已在文献“刘力嘉,谢丽，张作义等.泰乐菌素高效降解菌的筛选及降解特性研究.农业环境科学学报,2011,30(5):1027-1030.”中公开)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CICC 20697等5种单个降解菌分别经LB液体培养基培养至对数期(培养在29℃，130r/min震荡条件下进行)，制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1011cfu/mL。之后将各单一降解菌种子原液按照等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床30℃，150r/min液体发酵5天制备形成大环内酯类抗生素降解菌群，菌体浓度约为1.2×1012cfu/mL。
2、能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的能量供给菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)ACCC10628、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ACCC 04259、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)SCTCC 100664分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH 7.0),30℃、120r/min震荡培养72h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床30℃，150r/min液体发酵4天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
3、磁介质菌菌液的制备
分别将LB琼脂斜面培养基上生长良好的优选磁介质菌副球菌(Paracoccussphaerophysae)ACCC 05413、好鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yabuuchiae)ACCC 19937分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0003改良培养基[配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L、酪氨酸(Tyrosine)0.5g/L、氯化亚铁(FeCl2)0.1g/L]，28℃，140r/min震荡培养72h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床30℃，150r/min液体发酵4天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
4、原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备
将49％营养载体(氨基酸粉12％、糖蜜粉8％、蛋白胨5％、酵母提取物2％、骨粉8％、稻壳65％)、20％吸附载体(磁矿粉16％、Fe3O4磁性纳米颗粒12％、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子7％、麦饭石粉25％、硅藻土粉25％、生物碳15％)、7％表面活性剂[聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(分子式C20H37NO4S，CAS:268-36-07-7)按等质量进行混合]按质量百分比混合均匀形成耦合载体，调节含水率45％后装入密闭式发酵反应器中搅拌蒸汽灭菌2h，待自然冷却至35℃时，分别按15％大环内酯类抗生素降解菌群(步骤1)、4％灭活的能量供给菌菌液(步骤2)、5％灭活的磁介质菌菌液(步骤3)喷雾接种于已灭菌的耦合载体中，在密闭式发酵反应器中发酵，每隔6h翻堆一次。待发酵产物水分含量小于30％，重金属含量符合GB/T23349-2009标准，有效活菌数大于2×1011cfu/g时，即制得原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂。
实施例3
1、大环内酯类抗生素降解菌群的制备
将假单胞菌(Pseudomonas sp.)C3、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CICC10368、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)FY、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)CICC 20697等四种单个降解菌分别经LB细菌液体培养基培养至对数期，培养在29℃，130r/min震荡条件下进行。接着，进行驯化：A、取0.1mL各菌培养液于250mL三角瓶中，其中已装有高浓度(12mg/L)红霉素土壤悬浮液(土壤悬浮液是土水按质量比1:5配比，灭菌得到)100mL，进行野生驯化5天(驯化条件为28℃、140r/min震荡条件下进行)；B、取0.1mL野生驯化液重复步骤A 6次后在LB液体培养基中37℃，120r/min震荡培养48h制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1011cfu/mL；C、将各单一降解菌种子原液按照等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床37℃，120r/min液体发酵3天制备形成红霉素降解菌群，菌体浓度约为1.2×1012cfu/mL。
2、能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的能量供给菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)ACCC10628、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ACCC 04259、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ACCC 10158、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)ACCC10387、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)SCTCC 100664等分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH 7.5)，37℃，120r/min震荡培养48h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床37℃，130r/min液体发酵3天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
3、磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的磁介质菌副球菌(Paracoccussphaerophysae)ACCC05413、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yabuuchiae)ACCC 19937、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC 23919、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)CICC 10828等分别以同样的接种量加入同样体积的液体磁介质菌CM 0003改良培养基[配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L、酪氨酸(Tyrosine)0.5g/L、氯化亚铁(FeCl2)0.1g/L]，37℃，140r/min震荡培养48h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床，28℃，130r/min液体发酵4天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
4、原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备
将61％营养载体(氨基酸粉4％、糖蜜粉14％、蛋白胨9％、酵母提取物4％、骨粉4％、稻壳65％)、10％吸附载体(磁矿粉8％、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子7％、麦饭石粉35％、硅藻土粉25％、生物碳25％)、5％表面活性剂[椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(CDEA，分子式C11H23CON(CH2CH2OH)2，CAS:6501)]按质量百分比混合均匀形成耦合载体，调节含水率50％后装入密闭式发酵反应器中搅拌蒸汽灭菌1.5h，待自然冷却至35℃时，分别按15％红霉素降解菌群(步骤1)、4％能量供给菌菌液(步骤2)、5％磁介质菌菌液(步骤3)喷雾接种于已灭菌的耦合载体中，在密闭式发酵反应器中发酵，每隔6h翻堆一次。待发酵产物水分含量小于30％，重金属含量符合GB/T23349-2009标准，有效活菌数大于2×1011cfu/g时，即制得原位消解土壤红霉素污染的复合制剂。
实施例4
1、大环内酯类抗生素降解菌群的制备
将越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)TS1、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)ATCC BAA-248、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C3、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Ery-E、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)XP12、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)FY、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)G10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)G1、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CICC 20697等9种单个降解菌分别经LB液体培养基培养至对数期，培养在28℃，150r/min震荡条件下进行。接着，进行驯化：A、取0.15mL各单个降解菌富集菌悬液于250mL三角瓶在灭菌土水比1:5的高浓度泰乐菌素(115mg/L)土壤悬浮液100mL中进行野生驯化6天(驯化条件为29℃、150r/min震荡条件下进行)；B、取0.15mL野生驯化液重复步骤A 6次后在LB液体培养基中35℃，120r/min震荡培养60h制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1011cfu/mL；C、将各单一降解菌种子原液按照等体积比混合均匀置于摇床35℃，130r/min液体发酵4天制备形成泰乐菌素降解菌群，菌体浓度约为1.2×1012cfu/mL。
2、能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的能量供给菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)ACCC10628和产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ACCC 10158分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH 7.2)，34℃，120r/min震荡培养68h，再以等体积比混合均匀置于摇床35℃，140r/min液体发酵3天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
3、磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的磁介质菌鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasyabuuchiae)ACCC 19937、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC 23919、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)CICC 10828等分别以同样的接种量加入同样体积的液体磁介质菌CM0003改良培养基[配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L、酪氨酸(Tyrosine)0.5g/L、氯化亚铁(FeCl2)0.1g/L]，30℃、140r/min震荡培养60h，再以等体积比混合均匀置于摇床38℃，140r/min液体发酵4天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
4、原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备
将65％营养载体(氨基酸粉10％、糖蜜粉12％、蛋白胨6％、酵母提取物3％、骨粉6％、稻壳63％)、12％吸附载体(磁矿粉12％、Fe3O4磁性纳米颗粒12％、麦饭石粉35％、硅藻土粉26％、生物碳15％)、6％表面活性剂[椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(CDEA，分子式C11H23CON(CH2CH2OH)2，CAS:6501)、十二烷基硫酸钠(SDS，分子式C12H25NaO4S，CAS:151-21-3)按等质量进行混合]按质量百分比混合均匀形成耦合载体，调节含水率55％后装入密闭式发酵反应器中搅拌蒸汽灭菌1h，待自然冷却至35℃时，分别按8％泰乐菌素降解菌群(步骤1)、4％能量供给菌菌液(步骤2)、5％磁介质菌菌液(步骤3)喷雾接种于已灭菌的耦合载体中，在密闭式发酵反应器中发酵，每隔6h翻堆一次。待发酵产物水分含量小于30％，重金属含量符合GB/T23349-2009标准，有效活菌数大于2×1011cfu/g时，即制得原位消解土壤泰乐菌素污染的复合制剂。
实施例5
1、大环内酯类抗生素降解菌群的制备
将洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 17759、越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)TS1、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putda)ACCC 10081、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)AVM1、蜡样芽孢杆菌(Bacillaceae cereus)G10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)G1、苍白杆菌(Ochrobactrum haematophilum)AW1-12等7种单个降解菌将其中的单个细菌分别用LB液体培养基培养培养至对数期培养至对数期，培养在30℃，140r/min震荡条件下进行。接着，进行驯化：A、取0.2mL各单个降解菌富集菌悬液于250mL三角瓶在灭菌土水比1:5的高浓度阿奇霉素(115mg/L)土壤悬浮液100mL中进行野生驯化6天(驯化条件为30℃、130r/min震荡条件下进行)；B、取0.1mL野生驯化液重复步骤A 6次后在LB或YPD液体富集培养基(细菌用LB液体培养基培养)中34℃，120r/min震荡培养70h制备形成单一降解菌种子原液，菌体浓度约为1×1011cfu/mL；C、将各单一降解菌种子原液按照等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床34℃，140r/min液体发酵4天制备形成阿奇霉素降解菌群，菌体浓度约为1.2×1012cfu/mL。
2、能量供给菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的能量供给菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)ACCC10628、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ACCC 10158、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)SCTCC 100664等分别以同样的接种量加入同样体积的液体CM 0002改良培养基(pH 7.4)，36℃，120r/min震荡培养50h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床34℃，140r/min液体发酵4天制备形成能量供给菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
3、磁介质菌菌液的制备
将LB琼脂斜面培养基上生长良好的优选磁介质菌副球菌(Paracoccussphaerophysae)ACCC 05413、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yabuuchiae)ACCC 19937、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC 23919等分别以同样的接种量加入同样体积的液体磁介质菌CM 0003改良培养基[配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L、酪氨酸(Tyrosine)0.5g/L、氯化亚铁(FeCl2)0.1g/L]35℃，140r/min震荡培养54h，再以等体积比接种于三角瓶混合均匀置于摇床34℃，140r/min液体发酵3天制备形成磁介质菌菌液，菌体浓度约为1×1012cfu/mL。
4、原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备
将52％营养载体(氨基酸粉11％、糖蜜粉14％、蛋白胨5％、酵母提取物4％、骨粉6％、稻壳60％)、13％吸附载体(磁矿粉8％、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子7％、麦饭石粉35％、硅藻土粉25％、生物碳25％)、7％表面活性剂[十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物(分子式C20H37NO4S，CAS:268-36-07-7)]按重量百分比混合均匀形成耦合载体，调节含水率55％后装入密闭式发酵反应器中搅拌蒸汽灭菌2h，待自然冷却至35℃时，分别按10％阿奇霉素降解菌群(步骤1)、8％能量供给菌菌液(步骤2)、10％磁介质菌菌液(步骤3)喷雾接种于已灭菌的耦合载体中，在密闭式发酵反应器中发酵，每隔6h翻堆一次。待发酵产物水分含量小于30％，重金属含量符合GB/T23349-2009标准，有效活菌数大于2×1011cfu/g时，即制得原位消解土壤阿奇霉素污染的复合制剂。
应用实例
取新鲜土样过4mm筛后于室温下放置3d，待微生物活化后，在50kg鲜土中分别加入甲醇配制成200mg/L的标准红霉素溶液、泰乐菌素溶液、阿维菌素溶液和阿奇霉素溶液，使土壤中红霉素、泰乐菌素、阿维菌素、阿奇霉素的底物浓度均为10mg/kg，等甲醇挥发完全后装入5L的塑料桶中(每桶3kg模拟的污染鲜土)。试验共设11个处理：
处理1，未增施复合制剂的对照；
处理2，增施实施例1步骤4制备的所得的复合制剂，施用量为250kg/667m2；
处理3，增施实施例1步骤1制备的大环内酯类抗生素降解菌群，施用量为250kg/667m2；
处理4，增施实施例2步骤4制备的所得的复合制剂，施用量为250kg/667m2；
处理5，增施实施例2步骤1制备的大环内酯类抗生素降解菌群，施用量为250kg/667m2；
处理6，增施实施例3步骤4制备的所得的复合制剂，施用量为250kg/667m2；
处理7，增施实施例3步骤1制备的大环内酯类抗生素降解菌群，施用量为250kg/667m2；
处理8，增施实施例4步骤4制备的所得的复合制剂，施用量为250kg/667m2；
处理9，增施实施例4步骤1制备的大环内酯类抗生素降解菌群，施用量为250kg/667m2；
处理10，增施实施例5步骤4制备的所得的复合制剂，施用量为250kg/667m2；
处理11，增施实施例5步骤1制备的大环内酯类抗生素降解菌群，施用量为250kg/667m2；
每处理设3次重复。将土壤含水量调至饱和持水量的45％，并用湿布盖于土表，置于室温下培养(25℃)。4种大环内酯类抗生素红霉素(Erythromycin,95.30％)、泰乐菌素(Tylosin,91.70％)、阿维菌素(Abamectin,95.00％)和阿奇霉素(Azithromycin,98.00％)，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。4天后采集各处理土壤样品，应用郭欣妍等(郭欣妍,王娜,郝利君,等.超高效液相色谱/串联质谱法同时测定水、土壤及粪便中25种抗生素[J].分析化学,2015(1):13-20)方法检测各处理土壤中红霉素、泰乐菌素、阿维菌素和阿奇霉素的含量。
结果表明(表1)：添加复合制剂的处理2、处理4、处理6、处理8和处理10的土壤中红霉素、泰乐菌素、阿维菌素、阿奇霉素分别较对照处理1降解7.78～9.03mg/kg、5.45～7.36mg/kg、6.00～7.97mg/kg、6.93～8.67mg/kg，降解率分别达到86.1～99.9％、72.4～97.7％、71.0～94.3％、78.1～97.7％。添加抗生素降解菌群的处理3、处理5、处理7、处理9和处理11的土壤中红霉素、泰乐菌素、阿维菌素、阿奇霉素分别较对照处理1降解6.00～8.18mg/kg、4.08～6.75mg/kg、5.22～7.58mg/kg、6.51～8.09mg/kg，降解率分别达到66.4～90.5％、54.2～89.6％、61.8～89.7％、73.4～91.2％。说明外源增施原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂均可极显著的促进大环内酯类抗生素的降解(P<0.01)。
表1不同种类大环内酯类抗生素的降解效果(mg/kg)
Figure BDA0002209432780000121
注：表中数据为三个土壤样品测定的平均值，同一列数值后不同小写字母表示处理间差异性显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异性显著(P<0.01)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将营养载体、吸附载体和表面活性剂混合均匀，进行除菌处理，得到耦合载体；
（2）在除菌后的耦合载体中接入大环内酯类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液和磁介质菌菌液，得到混合物I；发酵，得到原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂；
所述的营养载体的组成按质量百分比计，如下：氨基酸粉4～12%、糖蜜粉8～14%、蛋白胨5～9%、酵母提取物2～4%、骨粉4～8%、稻壳60～65%；
所述的吸附载体的组成按质量百分比计，如下：磁铁矿粉8～16%、Fe3O4磁性纳米颗粒12%、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子0～7%、麦饭石粉25～35%、硅藻土粉25～26%、生物碳15～25%；或如下：磁铁矿粉8～16%、Fe3O4磁性纳米颗粒0～12%、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子7%、麦饭石粉25～35%、硅藻土粉25～26%、生物碳15～25%；
所述的表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸与2-氨基乙醇的1:1型化合物、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠中的一种或至少两种；
所述的混合物I中各成分的组成按质量百分比计，如下：菌体浓度为1.2×1012cfu/mL的大环内酯类抗生素降解菌菌液10～15％、菌体浓度为1×1012cfu/mL的能量供给菌菌液4～8％、菌体浓度为1×1012cfu/mL的磁介质菌菌液5～10％、营养载体49～65％、吸附载体10～20％、表面活性剂5～7％；
所述的大环内酯类抗生素降解菌选自以下任一组合：
1）洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）GB-01、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）ATCC 17759、越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）TS1、越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）ATCC BAA-248、假单胞菌（Pseudomonas sp.）C3、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）Ery-E、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）CICC 10368、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putda）ACCC 10081、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XP12、无丙二酸柠檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus）FY、蜡样芽孢杆菌（Bacillaceae cereus）AVM1、蜡样芽孢杆菌（Bacillaceae cereus）G10、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtlis）G1、苍白杆菌（Ochrobactrum haematophilum）AW1-12、人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropi）CICC 20697；
2）洋葱伯克霍尔德菌ATCC 17759、假单胞菌C3、恶臭假单胞菌CICC 10368、无丙二酸柠檬酸杆菌FY、人苍白杆菌CICC 20697；
3）经红霉素驯化后的假单胞菌C3、恶臭假单胞菌CICC 10368、无丙二酸柠檬酸杆菌FY、人苍白杆菌CICC 20697；
4）经泰乐菌素驯化后的越南伯克霍尔德氏菌TS1、越南伯克霍尔德氏菌ATCC BAA-248、假单胞菌C3、恶臭假单胞菌Ery-E、恶臭假单胞菌XP12、无丙二酸柠檬酸杆菌FY、蜡样芽孢杆菌G10、枯草芽孢杆菌G1、人苍白杆菌CICC 20697；
5）经阿奇霉素驯化后的洋葱伯克霍尔德菌ATCC 17759、越南伯克霍尔德氏菌TS1、恶臭假单胞菌ACCC 10081、蜡样芽孢杆菌AVM1、蜡样芽孢杆菌G10、枯草芽孢杆菌G1、苍白杆菌AW1-12；
所述的能量供给菌为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）ACCC 10628和产氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes）ACCC 04259，或是枯草芽胞杆菌ACCC 10628、产氨短杆菌ACCC 04259和产氨短杆菌SCTCC 100664，或是枯草芽胞杆菌ACCC 10628、产氨短杆菌ACCC04259、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes） ACCC 10158、短小芽胞杆菌（Bacilluspumilus）ACCC10387和产氨短杆菌（Brevibacteriumammoniagenes）SCTCC100664，或是枯草芽胞杆菌ACCC 10628和产氨棒杆菌ACCC 10158，或是枯草芽胞杆菌ACCC10628、产氨棒杆菌ACCC 10158和产氨短杆菌SCTCC 100664；
所述的磁介质菌为副球菌（Paracoccus sphaerophysae）ACCC 05413和鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas yabuuchiae）ACCC 19937，或是副球菌ACCC 05413、鞘氨醇单胞菌ACCC19937、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）CICC 23919和洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）CICC 10828，或是鞘氨醇单胞菌ACCC 19937、荧光假单胞菌CICC23919和洋葱伯克霍尔德氏菌CICC 10828，或是副球菌ACCC 05413、鞘氨醇单胞菌ACCC19937和荧光假单胞菌CICC 23919。
2.根据权利要求1所述的原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法，其特征在于：
步骤（1）如下：将营养载体、吸附载体和表面活性剂混合均匀，用水调节含水率，接着进行除菌处理，得到耦合载体。
3.根据权利要求1所述的原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法，其特征在于：
所述的大环内酯类抗生素降解菌菌液通过包含如下步骤的方法得到：
①所述的大环内酯类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
②再于30～37℃，120～150r/min条件下继续培养3～5天；
或是通过包含如下步骤的方法得到：
A、将所述的大环内酯类抗生素降解菌通过振荡培养，培养至对数增长期；
B、然后通过含大环内酯类抗生素的培养基进行驯化培养；
C、驯化得到的菌培养至对数增长期；
D、再于30～37℃，120～150r/min条件下继续培养3～5天；
所述的能量供给菌菌液通过如下方法得到：用CM 0002改良培养基将能量供给菌培养至对数增长期，再于30～37℃，130～150r/min条件下培养3～4天，得到能量供给菌菌液；CM0002改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、乳糖10g/L、pH7.0～7.5；
所述的磁介质菌菌液通过如下方法得到：用磁介质菌改良培养基将磁介质菌培养至对数增长期，再于28～38℃，130～150 r/min条件下培养3～4天，得到磁介质菌菌液；磁介质菌改良培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、酪氨酸0.5g/L、氯化亚铁0.1g/L。
4.根据权利要求3所述的原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法，其特征在于：
所述的大环内酯类抗生素降解菌为混合菌时，是将大环内酯类抗生素降解菌中的各个菌分别通过振荡培养，培养至对数增长期；有驯化步骤时，是将各个菌分别进行驯化，然后按等体积比混合再继续培养；
所述的能量供给菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于30～37℃，130～150r/min条件下培养3～4天；
所述的磁介质菌为混合菌液时，是将各个菌分别培养至对数增长期，然后按等体积比混合，再于28～38℃，130～150r/min条件下培养3～4天。
5.根据权利要求3所述的原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂的制备方法，其特征在于：
步骤①和步骤A中所述的培养的条件为于28～30℃，130～150r/min条件下培养；
步骤B中所述含大环内酯类抗生素的培养基的组成如下：大环内酯类抗生素110～120mg/L、土150～200g/L，水 余量；
所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素；
所述的驯化培养的条件为于28～30℃，130～150r/min条件下培养5～6天；
所述的驯化培养的次数为3～8次；
步骤C中所述的培养的条件为于34～37℃，120～130r/min条件下培养48～70h；
步骤②和步骤D中所述的继续培养的条件为于30～37℃，120～150r/min条件下继续培养3～5天；
所述的将能量供给菌培养至对数增长期中的培养条件为：于30～37℃，110～130r/min条件下震荡培养48～72h；
所述的将磁介质菌培养至对数增长期中的培养条件为：于28～37℃，130～150r/min条件下震荡培养48～72h。
6.一种原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的制备方法得到。
7.权利要求6所述原位消解土壤大环内酯类抗生素污染的复合制剂在环境修复中的应用。
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