CN101701200A - 一株阴沟肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保藏号为CGMCC No.3162的一株阴沟肠杆菌，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，红白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆状。应用时，菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，反复活化五次后，菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，将菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液，其中，A培养基为加入0.1％鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛+0.1％鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
Description
技术领域
本发明涉及一株微生物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
腐胺的化学名称为1，4-丁二胺，生物化学试剂和药物中间体。也是尼龙-46、尼龙-6及尼龙-66的原料，尤其是尼龙-46广泛用于汽车、摩托车的零部件材料，以代替金属；尼龙-66用于电子产品的材料；酸性气体吸收剂。目前，制备方法有四种：(1)丙烯腈与氰化氢反应，生成乙二氰，在催化剂作用下加氢而得；(2)以吡咯为原料，在碳酸钠存在下与盐酸羟胺反应，生成丁二肟，再在钠汞齐作用下，在无水乙醇中加热而得；(3)以2，5-二氨基戊酸为原料，加热催化脱羧而得。由此可见，目前腐胺的生产方式能源消耗量大，对环境也有污染。我国腐胺需求量大，但国内企业生产能力和产品质量有限，从国外进口价格很高。
通过微生物代谢产生腐胺(鸟氨酸在微生物产生的鸟氨酸脱羧酶的作用下，脱羧产生腐胺)，获得高浓度腐胺液，然后分离腐胺，可降低腐胺的生产成本和能源消耗，也成为研究的主要课题。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前腐胺生产存在的问题，提供一种微生物并通过该微生物代谢产生腐胺，获得高浓度腐胺液。
本发明的目的是这样实现的：一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)xlcad001，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3162，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，红白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆状，该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ890353。
在本发明中，VRBDA培养基为：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
一株保藏号为CGMCC No.3162的阴沟肠杆菌的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液，高浓度腐胺液的腐胺含量为4452.74μg/ml；
所述的A培养基为加入0.1％L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
在本发明中，肠细菌增菌肉汤培养基为：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，在115℃灭菌15min，pH值7.2～7.4。
本发明的优点在于：由于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)xlcad001产腐胺能力强，在上述方法制得的培养液中，腐胺含量可达到4452.74μg/ml，用此方法生产腐胺将极大降低生产成本和减少污染。
附图说明
图1是阴沟肠杆菌在普通显微镜下的照片；
图2是标样的高效液相色谱图；
图3是高效液相检测阴沟肠杆菌培养液的色谱图；
图4是高效液相检测腐胺的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
菌株的筛选和保藏
培养基
肠道菌增菌肉汤培养基：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，在115℃灭菌15min，pH值7.2～7.4。
下层培养基：蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化钠2.5g，葡萄糖0.5g，吐温1g，硫酸镁0.4g，硫酸锰0.03g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，碳酸钙0.1g，硫酸亚铁0.04g，维生素B10.01g，磷酸吡哆醛0.05g，琼脂18克，鸟氨酸(115℃灭菌15min)；5克，1000ml蒸馏水，pH5.0，在115℃高压灭菌15分钟；
上层培养基：溴甲酚紫0.06g，琼脂20g，1000ml蒸馏水，pH5.0，在121℃灭菌10min；
VRBDA琼脂培养基为：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
在无菌条件下取20克传统中式香肠，无菌条件下剪碎后置于装有180ml已灭菌生理盐水的三角瓶中，室温230转摇床摇10分钟，取1ml接种于肠道菌增菌肉汤培养基中，37℃培养24小时，取1ml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100cfu/ml浓度，涂布于产腐胺检测下层培养基上，37℃培养48小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟内结果记录完毕，显紫色的菌落为阳性，显黄色为阴性，其中，阳性为能产生腐胺的菌株，阴性为不能产生腐胺的菌株。
挑取阳性菌株，在VRBDA固体培养基纯化三次以上，用肠细菌增生肉汤培养基37℃培养24小时，离心后获得阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)xlcad001菌株。
该菌株的菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，红白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆状。
该菌株根据Gen bank比对结果，命名阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)xlcad001，2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3162。该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ890353。
该菌株加入无菌甘油，在-80℃冰箱保存。
实施例2
高浓度腐胺培养液制备方法
培养基
肠道菌增菌肉汤培养基(同实施例1)；
制备方法
从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液.
所述的A培养基为加入0.1％鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
实施例3
腐胺含量检测方法(高效液相检测)
1、生物胺标准溶液的配制
准确称取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL，制成1mg/ml储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO4配制成终浓度分别为5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液，避光、4℃冰箱保存。
2、样品溶液的衍生化
取实施例2的样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得样品溶液的衍生物。
3、标准溶液标样的衍生化
分别取5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶液的衍生物。
4、检测方法为：
Agilent 1100检测系统，AgilentZORBAX XDB-C18(4.6×250mm，2，5μm)，流速为1mL·min-1，紫外检测波长为254nm，进样量20μL，柱温30℃，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
在图2的生物胺标样的高效液相图中：1为色胺，2为苯乙胺，3为腐胺，4为尸胺，5为组胺，6为酪胺，7为亚精胺，8为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图3所示。由图3可见，样品溶液中含有腐胺。
利用上述的检测方法检测，响应值为24296892.9(参见图4)，根据标准曲线计算得到结果为445.274μg/mg，但由于在检测过程中把原样稀释了10倍，所以最终腐胺含量为4452.74ug/mg。
以上各实施例不是对本发明的具体限定。
Claims (4)
1.一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3162，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，红白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆状，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890353。
2.根据权利要求1所述的一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于：VRBDA琼脂培养基为：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
3.一株保藏号为CGMCC No.3162的阴沟肠杆菌的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液，高浓度腐胺液的腐胺含量为4452.74μg/ml；
所述的A培养基为加入0.1％L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
4.根据权利要求3所述的一株保藏号为CGMCC No.3162的阴沟肠杆菌的应用，其特征在于：所述的肠细菌增菌肉汤培养基为：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，115℃灭菌15min。
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