CN101701201B - 一株粪肠球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保藏号为CGMCC No.3164的一株粪肠球菌，菌落在MRS琼脂培养基上，37℃培养24h富集，为乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，在普通显微镜下椭圆形。应用时，菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，反复活化五次后，将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液。其中，A培养基为0.1％酪氨酸的MRS液体培养基；B培养基为：0.005％磷酸吡哆醛和0.1％酪氨酸的MRS液体培养基。
Description
技术领域
本发明涉及一株微生物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
酪胺的化学名称为对羟基-β苯乙胺，是合成药物的重要中间体，可以作为生化试剂，目前，我国酪胺及其衍生物的需求量大，但国内尚无企业能生产出合格产品，从国外进口价格很高。
传统的酪胺生产是采用化学合成方法，对环境污染大，生产效率低，难以提纯。以酪氨酸为前体，利用微生物产生的酪氨酸脱羧酶，通过微生物代谢生产酪胺，获得高浓度酪胺液，然后分离酪胺，可降低酪胺的生产成本和能源消耗，也成为研究的主要课题。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前酪胺生产存在的问题，提供一种微生物并通过该微生物代谢产生酪胺，获得高浓度酪胺液。
本发明的目的是这样实现的：一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)xltyr001，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3164，菌落在MRS琼脂培养基上，37℃培养24h，在MRS液体培养基中富集，乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，该菌株在普通显微镜下椭圆形，其16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890356。
在本发明中：所述的MRS液体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH值6.2～6.4；所述的MRS琼脂培养基在MRS液体培养基加入1.8％琼脂。
一种保藏号为CGMCC No.3164的菌株的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液，高浓度酪胺液的酪胺含量为4025.92μg/ml。
在制备高高浓度酪胺液中，所述的A培养基为：加入0.1％酪氨酸的MRS液体培养基；所述的B培养基为：加入0.005％磷酸吡哆醛、0.1％酪氨酸的MRS液体。
本发明的优点在于：由于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)xltyr001产酪胺能力强，在培养液中，酪胺含量可达到4025.92μg/ml，用此方法生产酪胺将极大降低生产成本和节约能源。
附图说明
图1是粪肠球菌在普通显微镜下的照片；
图2是检测粪肠球菌酪氨酸脱羧酶基因扩增DNA片断的电泳图；
图3是生物胺标样高效液相色谱图；
图4是高效液相检测粪肠球菌培养液色谱图。
图5为高效液相色谱检测酪胺标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)xltyr001的筛选和保藏
培养基：
MRS液体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH值6.2～6.4，115℃灭菌15min。
下层培养基为：蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化钠2.5g，葡萄糖0.5g，吐温1g，硫酸镁0.4g，硫酸锰0.03g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，碳酸钙0.1g，硫酸亚铁0.04g，维生素B10.01g，磷酸吡哆醛0.05g，琼脂18克。酪氨酸5克，1000ml蒸馏水。pH 5.2，115℃高压灭菌15分钟。
上层培养基为：溴甲酚紫0.06g，琼脂20g，1000ml蒸馏水，pH5.2，121℃灭菌10min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入1.8％琼脂。
分离方法：
在无菌条件下取20克传统中式香肠，剪碎后置于装有180ml已灭菌生理盐水的三角瓶中，室温下230转摇床摇10分钟，取1ml接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时，取1ml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100cfu/ml浓度，涂布于下层培养基上，37℃培养72小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟内记录结果，显紫色的菌落为阳性，显黄色为阴性，其中，阳性为产生酪胺菌株，阴性为不产胺菌株。
挑取阳性菌株，在MRS固体培养基上37℃培养24h，至少纯化三次，接种于MRS液体培养基37℃培养24小时，离心后获得菌株，加入无菌甘油，-80℃冰箱保存。
该菌乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，该菌株在普通显微镜下呈椭圆形。
该菌株根据Genbank比对结果，命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)xltyr001，于2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No.3164，其16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890356。
实施例2
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)xltyr001的基因检测。
引物及引物的来源
TD2：5‘-ACATAGTCAACCATRTTGAA-3’；
TD5：5‘-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3’；
检测方法：
25μl反应体系包括：GoTaq Green Master Mix12.5μl，每种引物各1.0μl，DNA模版2μl，去离子双蒸水8.5μl.
PCR扩增程序：94℃预变性5min，35个循环包括：94℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸60s，最终72℃延伸7min，冷却至4℃。
实施例3
高浓度酪胺培养液制备方法从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液，高浓度酪胺液的酪胺含量为4023.94μg/ml。
培养基：MRS液体培养基(同实施例1)；所述的A培养基：0.1％酪氨酸的MRS液体培养基；所述的B培养基：0.005％磷酸吡哆醛+0.1％酪氨酸的MRS液体培养基。
实施例4.
酪胺含量检测方法(高效液相检测)
1、生物胺标准溶液的配制
准确称取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL，制成1mg/ml储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO4配制成终浓度分别为5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液，避光、4℃冰箱保存。
2、样品溶液的衍生化
取实施例3的样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得样品溶液的衍生物。
3、标准溶液标样的衍生化
分别取5.0、10、20、30、40、50μg/ml标准溶液样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶液的衍生物。
4、检测方法
方法为：
Waters Alliance2695液相检测系统，色谱柱为AgilentZORBAXXDB-C18(4.6×250mm2，5μm)，流速为1mL·min-1，紫外检测波长为254nm，进样量20μL，柱温30℃，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。
梯度洗脱程序
在图3的生物胺标样的高效液相图中：1为色胺，2为苯乙胺，3为腐胺，4为尸胺，5为组胺，6为酪胺，7为亚精胺，8为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图4所示。由图4可见，样品溶液中含有酪胺。
利用上述的检测方法检测，响应值为9412881.128(参见图5)，根据标准曲线计算得到结果为402.592μg/mg，但由于在检测过程中把原样稀释了10倍，所以最终酪胺含量为4025.92ug/mg。
Claims (3)
1.一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3164，菌落在MRS琼脂培养基上，37℃培养24h，在MRS液体培养基中富集，乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，该菌株在普通显微镜下椭圆形，其16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890356。
2.根据权利要求1所述的一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其特征在于：所述的MRS琼脂培养基在MRS液体培养基加入1.8％琼脂；所述的MRS液体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH值6.2～6.4。
3.一种保藏号为CGMCC No.3164的一株粪肠球菌产生高浓度酪胺液的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml，在相同培养基反复活化五次后，将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液，高浓度酪胺液的酪胺含量为4025.92μg/ml；
所述的A培养基为：加入0.1％酪氨酸的MRS液体培养基；所述的B培养基为：加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％酪氨酸的MRS液体培养基。
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