CN103184180B - 一株产甘露醇布氏乳杆菌及发酵产甘露醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株产甘露醇布氏乳杆菌，名称为布氏乳杆菌Y-4，其分类命名为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），保藏编号为CGMCC NO. 7300，保藏日期：2013年3月13日，其特点是以东北酸菜为原料，采取富集培养、初筛、复筛等方法进行筛选和纯化获得，根据生理生化特征及16SrDNA序列分析，确定该菌株为新种，本发明得到的菌株生长性能稳定，温度30℃和pH值为5.0时甘露醇产量最高，具有良好的研究和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及菌种的筛选，尤其是一株产甘露醇布氏乳杆菌及发酵产甘露醇的方法。
背景技术
甘露醇（Mannitol）又名甘露糖醇、木蜜醇，是一种六元醇，为山梨醇的同分异构体。纯净的甘露醇为无色至白色针状或为斜方柱状晶体或晶体性粉末，无臭，具有清凉甜味，是多元糖醇中唯一的一种不具吸湿性的晶体，广泛应用于食品、医药、轻工和化工领域。
目前，应用较为广泛的制备甘露醇方法为化学合成法，是以蔗糖、淀粉或葡萄糖为原料通过催化加氢制备得到。甘露醇的氢化作用一般需要在高压高温、金属催化和通氢气的条件下进行，具有原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，适合于大规模生产等特点，但是其产率较低，且有山梨醇伴生，造成后面的分离纯化成本较高的问题。另一种方法是天然物提取，目前主要采用重结晶或者电渗析脱盐法从海藻、海带中提取甘露醇，该方法可得到单一的甘露醇，精制纯度高，但收率低、精制工序繁琐、生产成本高、原料来源受地区限制。
自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。微生物发酵生产甘露醇，具有反应选择性高、温和、能耗低、设备投资小的优点，但高产甘露醇菌株尚未得到，近年来，国内外都在对微生物发酵制备甘露醇的技术进行研究。2002年Niklas von Weymarn等人利用异型乳酸菌Lactobacillusfermentum 发酵生产甘露醇，袁其朋等人用发酵乳杆菌转化甘露醇。目前，对布氏乳杆菌产甘露醇的相关报道较少。
甘露醇在国内外已成功应用于食品工业、医药工业、化工行业，并取得了很好的经济效益，在我国，对于微生物法生产甘露醇的研究刚刚起步，并没有取得很大的成就，造成这种情况的主要原因是培养条件并非最优和菌株的种类，其主要的原因是原始菌株种类和数量的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一株产甘露醇布氏乳杆菌，该菌株在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO. 7300，本菌株的甘露醇的产率为64.82%。
本发明的另一目的是提供产甘露醇布氏乳杆菌发酵产甘露醇的方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一株产甘露醇布氏乳杆菌，名称为布氏乳杆菌Y-4，其分类命名为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），保藏编号为CGMCC NO. 7300，保藏日期：2013年3月13日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述菌株的生理生化特征如下：+代表阳性：
一种产甘露醇布氏乳杆菌发酵产甘露醇的方法，步骤如下：布氏乳杆菌Y-4经活化后在发酵培养基中培养，条件为：温度为25-35℃、pH5.0、接种量为8-15wt%、静置条件下发酵40-50h。
而且，所述发酵培养基为：将果糖按2-5%的比例添加到MRS液体培养基。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明获得的菌株根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版描述，并做16S rDNA序列对比分析，确定该菌株属于布氏乳杆菌，目前我国关于布氏乳杆菌的研究较少，因此本申请筛选的菌种在一定程度上为我国的细菌菌种资源做出贡献，本发明筛选得到的布氏乳杆菌菌株在理论研究中具有极其重要的价值，对推动甘露醇工业生产有很好的实施前景。
2、本发明筛选的微生物转化制备甘露醇：在温度为30℃、pH 5.0、装液量为50mL、接种量为10%、静置条件下发酵48h，按HPLC法测定发酵液中甘露醇的含量，并计算其转化率，分析测定转化率，转化率为64.82%。
附图说明：
图1为菌株CGMCC NO. 7300的菌落图；
图2为菌株CGMCC NO. 7300的菌体图；
图3为本发明甘露醇标品的高效液相色谱图；
图4为本发明利用布氏乳杆菌转化发酵得到产物甘露醇的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一、原料的确定
原料取自东北家庭自制酸菜，以溴甲酚绿为显色剂，配以MRS培养基配方形成初筛培养基，利用乳酸菌发酵葡萄糖产酸，溴甲酚绿遇酸显示黄色，筛选出乳酸菌，再以果糖为底物，进行发酵生成产物，通过高效液相色谱法判断是否存在产甘露醇乳酸菌菌株，工艺为：
（1）菌种初筛：酸菜汁经预处理后取1mL至盛有（25mL/250mL）富集培养基中培养，30℃，静置培养48h；
富集培养基（g/100mL）：蛋白胨 1.0，牛肉膏 1.0，酵母提取物0.5，K2HPO4 0.2，柠檬酸二铵 0.2，乙酸钠 0.5，葡萄糖2.0，MgSO4·7H2O 0.058，MnSO4·4H2O 0.019，抗败血酸 0.05；115℃灭菌20min；
保藏培养基：MRS琼脂斜面固体培养基；
初筛培养基（g/100mL）：MRS中加入溴甲酚绿显示剂，30℃，静置培养48h；
经过初筛（含有溴甲酚绿的MRS平板），有八株菌株在初筛平板中有黄色显色圈，说明这八株菌能够产生乳酸，将这8株菌命名为 Y-1，Y-2，Y-3，Y-4，Y-5，Y-6，Y-7，Y-8；
（2）菌种复筛：初筛获得的菌种以果糖作为底物发酵，利用高效液相色谱法测定是否产甘露醇。
种子培养基（g/100mL）：MRS液体培养基；
液体发酵培养基（g/100mL）：蛋白胨 1.0，牛肉膏 1.0，酵母提取物 0.5，K2HPO4 0.2，柠檬酸二铵 0.2，乙酸钠 0.5，葡萄糖2.0，MgSO4·7H2O 0.058，MnSO4·4H2O 0.019，抗败血酸 0.05，果糖 2；115℃灭菌20min；
测得只有Y-4产甘露醇，其含量为26.34g/L。
二、菌种的筛选和鉴定
1. 产甘露醇乳酸菌的筛选
（1）取酸菜加适量灭菌水混匀后，取1mL悬浮液放入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，取1mL至盛有（25mL/250mL）富集培养基中培养，30℃，静置培养48h。
（2）将富集培养液经梯度稀释后，选择合适的稀释度稀释液涂布于初筛平板上，30℃静置培养48h，取出。挑选出有黄色显色圈的菌落转接MRS平板纯化，将单菌落接至MRS斜面培养基。
（3）选用生长正常的斜面，接入液态发酵培养基，30℃，静置培养48h。
（4）用移液枪吸取1mL样品（枪头剪口）于EP管中，12000转/分离心1min，去上清液，利用高效液相色谱法法检测是否产甘露醇。
2. 菌种的鉴定
⑴菌落形态观察：将斜面菌点接至有MRS培养基的平皿中，于30℃静置培养48h，观察菌落形态。
⑵菌体形态观察：利用细菌革兰氏染色方法进行染色，油镜下观察菌株的个体形态。
⑶形态特征：菌落形态呈圆形，乳白色，较光滑，凸起，边缘整齐，不透明；菌体为短杆状，长度0.2~0.8μm，革兰氏染色阳性，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。
⑷生理生化特征
注：（+）代表阳性
⑸菌株的16S rDNA鉴定：
a.基因组DNA的提取，本实验的引物采用16S rDNA通用引物。
上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCA
下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT
b. 采用50μL的PCR扩增体系：
c. 用于扩增目的基因的PCR条件：
通过将16S rDNA序列的扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，得到其大小为1500bp左右，符合使用细菌16S rDNA引物的预期扩增结果。最终选取最好的条带进行回收，将回收的DNA送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。通过Nucleotide BLAST分析，与布氏乳杆菌菌株的16SrDNA序列同源性为99%以上，可初步确定Y-4菌株为布氏乳杆菌。
筛选出的布氏乳杆菌菌种的保藏信息如下：名称为布氏乳杆菌Y-4，其分类命名为布氏乳杆菌 Lactobacillus buchneri，保藏编号为CGMCC NO. 7300，保藏日期：2013年3月13日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3. 产物鉴定及转化率的测定分析
取发酵液样品1mL于EP管中，12000r/min离心1min，HPLC法检测发酵液中甘露醇含量，根据果糖消耗量，计算出甘露醇相对果糖的转化率。
色谱条件：TSK-GEL Amide-80 Series色谱柱(4.6mm×100mm，5.0μm)，乙腈、去离子水超声15min脱气，流动相乙腈：水=90：10；检测器为视差检测器；流速1mL/min；柱温为80℃；进样量20μL。
精密称取甘露醇1.00mg置于1.5mL的EP管中，加去离子水1mL溶解，精确吸取20、40、60、80、100μL的对照品溶液到1.5mL的EP管中，并用去离子水稀释至100μL，然后吸取20μL进行测定。以峰面积（Y）对含量（X）做回归计算。结果表明，在0.2~1mg/mL范围内，甘露醇有良好的线性关系，回归方程为：Y=328211X+14051，R2=0.9966。
精密称取果糖1.00mg置于1.5mL的EP管中，加去离子水1mL溶解，精确吸取20、40、60、80、100μL的对照品溶液到1.5mL的EP管中，并用去离子水稀释至100μL，然后吸取20μL进行测定。以峰面积（Y）对含量（X）做回归计算。结果表明，在0.2~1mg/mL范围内，果糖有良好的线性关系，回归方程为：Y=252110X-11170，R2=0.9992。
三、利用布氏乳杆菌Y-4转化发酵制备甘露醇的方法，步骤如下：
⑴培养基的配置：斜面培养基（MRS)（1000mL）：蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母提取物 5.0g，K2HPO4 2.0g，柠檬酸二铵 2.0g，乙酸钠 5.0g，葡萄糖 20.0g， MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.19g，吐温-80.0 mL，琼脂20g，溶化后分装，115℃灭菌，15 min；摇瓶发酵培养基：将果糖铵2%的比例添加到MRS液体培养基，115℃灭菌，15min；
⑵种子制备：将保存的布氏乳杆菌Y-4接种于斜面培养基上，置30℃恒温箱培养48h，获得母斜面，选用生长正常斜面，接入摇瓶发酵培养基；
⑶微生物转化制备甘露醇：在温度为30℃、pH 5.0、装液量为50mL、接种量为10%、静置条件下发酵48h，按HPLC法测定发酵液中甘露醇的含量，并计算其转化率。分析测定转化率，转化率为64.82%。
Claims (1)
1.一株产甘露醇布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）Y-4，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO. 7300，保藏日期：2013年3月13日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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