CN104312953A - 一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法,属于微生物领域。本发明方法为从基因型着手筛选多拷贝基因的细菌,考察其代谢瓜氨酸的能力,从而筛选到能高效利用瓜氨酸的乳酸菌,通过共培养降低瓜氨酸的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法,属于微生物领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种致癌物质,被人体过量持续摄入可能会引发肺癌、肝癌等严重性肿瘤疾病,并且对人体的免疫系统造成伤害。氨基甲酸乙酯广泛存在于各种酒类饮料和发酵食品中,酱油属于发酵食品,在其中检测出了氨基甲酸乙酯。
酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要形成途径是瓜氨酸与乙醇反应生成,而酱醪中的乳酸菌是通过精氨酸脱亚氨基途径(ADI途径)消耗精氨酸,产生瓜氨酸。ADI途径(图1)由ADI(arcA编码),OTC(arcB编码),CK(arcC编码)三个酶催化的反应组成。其中ADI酶催化精氨酸转化为瓜氨酸,OTC酶催化瓜氨酸转化为鸟氨酸,CK酶降解鸟氨酸产生ATP、CO2和NH3。筛选能够充分利用瓜氨酸的微生物,以用于降低酱油中瓜氨酸的含量,是减少和控制酱油中氨基甲酸乙酯的有效措施之一。
酱油中的常见的微生物如乳酸菌(魏斯氏菌、乳酸足球菌以及嗜盐四联球菌等)和葡萄球菌,芽孢菌等都存在ADI途径,可以利用精氨酸,在特定条件下积累瓜氨酸。目前,尚未有关于有效筛选降解瓜氨酸的微生物的应用实例。
本发明旨在提供一种能够高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法,以ADI途径七个基因为筛子,并通过精氨酸、瓜氨酸代谢能力分析验证了所筛选得到的微生物降解瓜氨酸的能力。
发明内容
本发明提供了一种高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法。所述方法主要包括以下步骤:(1)分离样品中的细菌并提取各细菌基因组;(2)以基因组为模版,设计引物PCR验证所筛选细菌基因组中是否含有arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2这7个基因,挑选基因组中有这7个基因的细菌,进入下一步筛选;(3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨基酸检测培养基培养所得微生物,检测精氨酸和瓜氨酸的分解、积累情况,筛选能利用精氨酸和瓜氨酸且不积累瓜氨酸的微生物。
所述arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-7所示。
所述步骤(2)采用的引物如表1所示。
所述氨基酸检测培养基含有(g/L):酵母膏5.0,牛肉膏5.0,胰蛋白胨5.0,NaCl 180.0,葡萄糖0.5,Tween-80 1.0,MgSO4·7H2O 0.2,MnSO4·H2O 0.05,FeSO4 0.4,柠檬酸三胺2.0,CaCO3 0.1,吡哆醛-5-磷酸0.05,K2HPO4 2.0,pH6.0,氨基酸5.0。
在本发明的一种实施方式中,所述细菌为乳酸菌。
在本发明的一种实施方式中,筛选得到符合条件的嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)BBE R23,于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),中国武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2013480。所得嗜盐四联球菌在添加了精氨酸的正常培养条件下,不积累瓜氨酸;在高盐胁迫的培养条件下该菌仍具有快速降解精氨酸的能力,同时不积累瓜氨酸;在高盐胁迫的培养条件下该菌能彻底消耗培养基中含有的3g/L瓜氨酸;当其与积累瓜氨酸的乳酸足球菌共培养时,可以显著降低培养液中由乳酸足球菌产生的瓜氨酸。
本发明提供了一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法。该方法为从基因型着手筛选多拷贝基因的细菌,考察其代谢瓜氨酸的能力,从而筛选到能高效利用瓜氨酸的乳酸菌,通过与产瓜氨酸的微生物进行共培养,可以降低瓜氨酸的含量。
附图说明
图1ADI途径
图2A:37℃下共培养对乳酸足球菌ADI途径的影响;对照组:不添加T.halophilus,实验组为添加T.Halophilus;其中精氨酸的变化量为精氨酸的消耗量,瓜氨酸和鸟氨酸的变化量为两种氨基酸的生成量;
B:16℃下共培养对乳酸足球菌ADI途径的影响;对照组:不添加T.halophilus,实验组为添加T.Halophilus;其中精氨酸的变化量为精氨酸的消耗量,瓜氨酸和鸟氨酸的变化量为两种氨基酸的生成量;
C:共培养对乳酸足球菌瓜氨酸积累效率的影响;对照组:不添加T.halophilus,实验组为添加T.Halophilus;瓜氨酸的积累效率为每摩尔精氨酸转化生成的瓜氨酸的摩尔数。
图3嗜盐四联球菌R23和C3 ADI途径基因簇解析及验证。
具体实施方式
嗜盐四联球菌分离平板:100g/LNaCl,溴甲酚紫0.06g/L,50μ/ml制霉菌素,100g/L生酱油,琼脂20g/L)。培养条件:30℃,5-7天。
可培养乳酸菌分离平板:MRS培养基,2g/L琼脂,购于OXIOD公司
可培养细菌分离平板:营养肉汤培养基:10g/L蛋白胨,5g/L牛肉膏,10g/LNaClMRS培养基为培养乳酸杆菌专用。
嗜盐四联球菌分离培养基:改良MRS:100g/L NaCl,溴甲酚紫0.06g/L,50μ/ml制霉菌素,100g/L生酱油),30℃,5-7天。
氨基酸检测培养基(g/L):酵母膏5.0,牛肉膏5.0,胰蛋白胨5.0,NaCl 180.0,葡萄糖0.5,Tween-80 1.0,MgSO4·7H2O 0.2,MnSO4·H2O 0.05,FeSO4 0.4,柠檬酸三胺2.0,CaCO3 0.1,吡哆醛-5-磷酸0.05,K2HPO4 2.0,pH6.0,氨基酸5.0。
嗜盐四联球菌的培养条件为:将保藏的嗜盐四联球菌在含100g/LNaCl的MRS固体培养基上划线,于30℃静置培养4天,挑取单菌落接入含10%NaCl的MRS液体培养基,30℃静置培养四天,离心10min(6000rpm,4℃)后收集菌体,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0)悬浮菌体。
实施例1酱油中可培养微生物分离
从酿造酱油的成曲中取样稀释分别涂布到MRS和营养肉汤培养基平板上,37℃富集培养5天。挑选不同菌落形态的单菌落接种到含有MRS和营养肉汤培养基平板上,划线分离作纯培养。四天后,将纯培养物接种到MRS和营养肉汤液体培养基中培养四天富集菌体,提取基因组。以细菌16S rDNA的PCR通用引物PCR获得16S rDNA,通过16S rDNA测序结果与数据库比对,确定分离的培养物有魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌、嗜盐四联球菌。
Pediococcus acidilacticiBBE 1120保藏编号为CCTCC NO:M 2013732。
Tetragenococcus halophilusBBE R23于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),中国武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2013480。
Tetragenococcus halophilusBBE C3于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),中国武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2013479。
实施例2ADI途径基因分析
根据NCBI GenBank中公布的关于魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌的数据:魏斯氏菌(Weissella confusa LBAE C39-2)GenBank Assembly ID:GCA_000239955.2,魏斯氏菌(Weissella cibaria KACC 11862)GenBank Assembly ID:GCA_000193635.2,葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureusNCTC 8325)GenBank Assembly ID:GCA_000013425.1,乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici DSM 20284)GenBank Assembly ID:GCA_000146325.1,嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus NBRC 12172)GenBank:AP012046.1,分析可知魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌的ADI途径关键基因都只存在单拷贝,即,仅具备arcA、arcB、arcC这三个基因。嗜盐四联球菌T.halophilus NBRC12172途径组成包括arc operon上的arcA,arcB,arcC基因以及arc operon以外的额外两个拷贝的arcB,arcC基因,即具备arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2这7个基因。这种ADI途径基因的拷贝数可能与菌株利用瓜氨酸的能力有关。
实施例3嗜盐四联球菌ADI途径基因簇解析及验证
挑取-80℃甘油管保藏的从成曲中筛选得到的Tetragenococcus halophilus BBER23(CCTCC NO:M 2013480)、Tetragenococcus halophilusBBE C3(CCTCC NO:M 2013479),在10%NaCl的MRS固体培养基上划线。30℃培养四天后,挑取单菌落进行菌落PCR,引物见表1,验证是否有arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2基因。PCR结果显示嗜盐四联球菌R23基因组存在一个完整的arc operon(arcA、arcB、arcC)和额外两个拷贝的arcB基因和arcC基因;嗜盐四联球菌C3基因组不存在一个完整的arc operon(缺失arcA、arcB、arcC),但存在arc operon以外两个拷贝的arcB1、arcC1基因。
表1实施例中用到的引物
实施例4嗜盐四联球菌及酱油可培养微生物精氨酸代谢能力分析
将活化好的嗜盐四联球菌R23(CCTCC NO:M 2013480)、C3(CCTCC NO:M 2013479)单菌落分别接种于100g/LNaCl的MRS液体培养基中,30℃静置培养四天,离心10min(4000rpm,4℃)取菌体,加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0)悬浮菌体。
向5mL离心管中分别加入4mL含0.5%的精氨酸的氨基酸检测培养基,接种400μL的菌液,接种后OD600为3.0。在30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜氨酸以及鸟氨酸含量。结果表明R23培养液中精氨酸含量降到0,瓜氨酸积累量为0,鸟氨酸大量积累;而C3则不能利用精氨酸。因此,在高盐条件下这株嗜盐四联球菌R23能利用精氨酸转化成瓜氨酸,瓜氨酸又转化成鸟氨酸,其间不积累瓜氨酸。具体数值如下:
表2不同盐浓度下Tetragenococcus halophilus精氨酸代谢
仅具有一个完整arc基因簇,即完整ADI途径的Weissella和Staphylococcus在相同的培养条件下均有不同程度的瓜氨酸积累。在高盐胁迫的培养条件下,Weissella和Staphylococcus的精氨酸利用能力剧烈下降,Pediococcus在精氨酸利用能力下降的同时由精氨酸转化生成瓜氨酸的得率大幅提高。
实施例5嗜盐四联球菌及酱油可培养微生物降解瓜氨酸能力分析
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌R23、C3单菌落分别接种于100g/LNaCl的MRS液体培养基中,30℃静置培养四天,离心10min(4000rpm,4℃)取菌体,加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0)悬浮菌体。
向5mL离心管中分别加入4mL含3g/L的瓜氨酸的氨基酸检测培养基,接种400μL的菌液,接种后OD600为3.0。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中瓜氨酸和鸟氨酸含量,观测到嗜盐四联球菌R23培养液中瓜氨酸大量降低,鸟氨酸大量积累;而嗜盐四联球菌C3能部分利用瓜氨酸,但瓜氨酸到鸟氨酸的转化率明显低于R23。因此,在高盐条件下这株嗜盐四联球菌R23能利用瓜氨酸全部转化成鸟氨酸,这样即可大量减少环境中的瓜氨酸含量。具体数值如下:
表3不同盐浓度下Tetragenococcus halophilus瓜氨酸代谢
表4不同盐浓度下Weissella和Staphylococcus瓜氨酸代谢
Pediococcus在高盐环境下积累瓜氨酸,Staphylococcus在没有盐和180g/L的高盐环境下均不能利用瓜氨酸,而Weissella在没有盐的环境下不利用瓜氨酸,在高盐环境下瓜氨酸转化为鸟氨酸的转化率为12.5%,远低于Tetragenococcus halophilus。
实施例6Tetragenococcus halophilus R23与产瓜氨酸的Pediococcus共培养
高盐稀态酱油的制备过程中,发酵前七天是瓜氨酸的快速生成时期。乳酸足球菌是其中一类主要菌群,其具有ADI途径,并且能够在高盐条件下,积累大量的瓜氨酸,是造成酱油发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸积累的主要菌群。
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌R23单菌落接种于100g/L NaCl的MRS液体培养基中,30℃静置培养四天,离心10min(6000rpm,4℃)取菌体,用pH7.0的PBS缓冲液漂洗菌体两次,弃上清,收集菌体。
从乳酸足球菌甘油管中取菌液划线至MRS固体培养基,于37℃ CO2培养箱中培养培养20h,挑取单菌落接种至50mLMRS培养基中,于37℃ CO2培养箱中培养20h。离心培养液,8000rpm,5min。弃上清,用pH7.0的PBS缓冲液漂洗菌体两次,弃上清,收集菌体。
将收集的两种菌体一定比例混合添加入NaCl浓度180g/L、精氨酸浓度5g/L、pH5.5的MRS培养基中培养,其中乳酸足球菌的菌量为1.5×109CFU/mL,嗜盐四联球菌的菌量为8.0×108CFU/mL。培养7d后,取样测定精氨酸,瓜氨酸和鸟氨酸的含量。其中,向NaCl浓度180g/L,精氨酸浓度5g/L,pH5.5的MRS培养基中只添加乳酸足球菌,而不添加嗜盐四联球菌,作为对照。结果表明嗜盐四联球菌与Pediococcus共培养确实能减少瓜氨酸的生成量,如图1、2、3所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法,所述方法主要包括以下步骤:(1)分离样品中的细菌,并提取分离得到的细菌的基因组;(2)以基因组为模版,设计引物PCR验证所筛选细菌基因组中是否含有arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2这7个基因,挑选基因组中有这7个基因的细菌,进入下一步筛选;(3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨基酸检测培养基培养所得微生物,检测精氨酸和瓜氨酸的分解、积累情况,筛选能利用精氨酸和瓜氨酸且不积累瓜氨酸的微生物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-7所示。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氨基酸检测培养基按g/L计含有:酵母膏5.0,牛肉膏5.0,胰蛋白胨5.0,NaCl 180.0,葡萄糖0.5,Tween-80 1.0,MgSO4·7H2O 0.2,MnSO4·H2O 0.05,FeSO4 0.4,柠檬酸三胺2.0,CaCO3 0.1,吡哆醛-5-磷酸0.05,K2HPO4 2.0,精氨酸或瓜氨酸5.0,pH6.0。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细菌为乳酸菌。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细菌为嗜盐四联球菌。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)精氨酸和瓜氨酸的检测,是将培养液离心,去除菌体,将上清液用高效液相色谱检测精氨酸和瓜氨酸的含量。
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GR01 | Patent grant | ||
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