CN113584137A - 一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物，其序列为：PTP1‑F:5’‑NACHACHGGCCAHACRAA‑3’;PTP2‑R:5’‑GTHGAYATHATGGTMTTYAT‑3’;其中，简并碱基代码Y=C/T，R=A/G，H=A/C/T，B=G/T/C，N=A/G/C/T。本发明还公开了设计出的简并引物在筛选瓜氨酸降解菌方面的应用。本发明首次依据具有瓜氨酸利用能力的PTP基因设计出一对简并引物，该简并引物为具有筛选功能的通用引物，无须针对某一菌种设计特定的探针引物，方便快捷，通用性好，工作效率高，具有良好的筛选和鉴定功能；为后续探究不同菌种来源的PTP基因利用瓜氨酸能力大小的差异和受环境因素影响大小的比较提供菌种保障，为减少或消除发酵过程中生成的氨基甲酸乙酯提供了新的解决思路和方法。

Description

一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种用于快速筛选瓜
氨酸降解菌的简并引物，本发明还涉及利用该简并引物筛选瓜氨酸利用菌种的方法。
背景技术
瓜氨酸（Citrulline, CIT）是一种非编码型α-氨基酸，它对于人的健康具有极其重要的影响。瓜氨酸涉及到人类的一系列生理代谢过程，因而受到了营养学和医学界的广泛关注。但随着近年来研究的不断深入，瓜氨酸被发现会给发酵食品带来严重的安全隐患。
瓜氨酸和乙醇的自发反应被认为是多种酒精饮料（如葡萄酒等）及发酵调味品（如酱油等）中生成氨基甲酸乙酯的主要途径。氨基甲酸乙酯（简称EC，又称脲烷、乌拉坦）在人体内代谢过程中被转化为N-羟基-氨基甲酸乙酯或乙烯基氨基甲酸乙酯，进而造成碱基颠换或碱基对置换，使DNA损坏而诱发癌变，故而氨基甲酸乙酯在2007年由国际癌症研究机构认定是一种2A类致癌物。2002年，联合国粮农组织制定了国际标准，氨基甲酸乙酯的含量不得超过20μg／L。
近年来，随着人们食品安全意识的增强，对食品中EC的关注度逐渐提升，EC也成为了国外限制我国发酵食品和酒精饮料出口的重要贸易壁垒，EC的产生机制及消除策略逐渐成为近年来食品发酵工业的研究热点。由于EC是一种非常稳定的化合物，一旦形成，极难再被降解。因此，对EC最有效的消除策略就是在EC产生前对其前体物进行控制或直接消除。
作为发酵过程中EC产生的主要前体物，瓜氨酸并非常见氨基酸，它不在蛋白质合成中发生作用，因此发酵过程中通过蛋白质水解不能直接获得瓜氨酸。但是，一些细菌，尤其是乳酸菌，能够通过精氨酸脱亚氨基途径（Arginine deiminase pathway, 简称ADIpathway）将精氨酸转化为瓜氨酸，并释放到环境中。
研究发现，一些细菌在arc基因簇（编码ADI途径关键功能蛋白）下游，存在着一个编码未知功能转运蛋白（putative transport protein）的基因，目前推测此转运蛋白与胞外瓜氨酸的转运有关。通过对Lactobacillus sakei CTC494中编码该putative transportprotein的PTP基因进行敲除，发现Lactobacillus sakei CTC494失去了再利用环境中瓜氨酸的能力，从而确定了该基因与胞外瓜氨酸的利用有关，且不同菌种的PTP基因表现出降解瓜氨酸的能力大小差异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能精确、快速筛选具有PTP基因
，即具有瓜氨酸降解能力的菌种的简并引物，本发明的另一目的在于还提供利用该简并引物筛选瓜氨酸降解菌的方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物，
其序列为：
PTP1-F:5’-NACHACHGGCCAHACRAA-3’
PTP2-R:5’-GTHGAYATHATGGTMTTYAT-3’
其中，简并碱基代码Y=C/T，R=A/G，H=A/C/T，B=G/T/C，N=A/G/C/T。
本发明设计出的简并引物在筛选瓜氨酸降解菌方面的应用。
利用上述简并引物筛选瓜氨酸降解菌的方法如下：
从发酵食品中筛取单菌落，提取待检测单菌落的基因组DNA，利用所述简并引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。
所述目的条带的具体位置是1000bp左右。
本发明的优点在于首次依据具有瓜氨酸利用能力的PTP基因设计出一对简并引物，采用该简并引物可对PTP1-F和PTP2-R筛选瓜氨酸降解菌。该简并引物为具有筛选功能的通用引物，无须针对某一菌种设计特定的探针引物，方便快捷，通用性好，工作效率高，具有良好的筛选和鉴定功能。
本发明设计出的简并引物为后续探究不同菌种来源的PTP基因利用瓜氨酸能力大小的差异和受环境因素影响大小的比较提供菌种保障，为减少或消除发酵过程中生成的氨基甲酸乙酯提供了新的解决思路和方法。
附图说明
图1和图2为利用本发明的简并引物扩增从发酵制品中分离的待测单菌落NDA得到的PTP基因片段的琼脂糖凝胶电泳。
图3为利用本发明的简并引物筛选的菌种LC-1、DJ-2、JY-3和PC-4的16S rDNA PCR扩增产物的电泳图谱。
图4为利用本发明的简并引物筛选的菌种LC-1构建的系统发育树。
图5为利用本发明的简并引物筛选的菌种DJ-2构建的系统发育树。
图6为利用本发明的简并引物筛选的菌种JY-3构建的系统发育树。
图7为利用本发明的简并引物筛选的菌种PC-4构建的系统发育树。
图8为利用本发明的简并引物筛选的菌种对胞外瓜氨酸利用能力的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受以下实施例的限制。
本发明所述实施例中所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
本实施例所使用的细菌基因组提取试剂盒购自天根生物公司，使用方法参考商品说明书；
DNA Marker DL2000购自擎科生物技术有限公司；
2*Es Taq MasterMix(Dye) DNA Polymerase购自康为世纪生物科技有限公司；
2*pfu PCR MasterMix高保真酶购自杭州宝赛生物科技有限公司。
引物合成和测序服务由擎科生物技术有限公司提供。
实施例1 简并引物对的设计
由于氨基酸密码子具有简并性，即不同的密码子可能对应同一个氨基酸。
本发明通过将Lactobacillus sakei CTC494中的PTP基因序列导入GeneBank数据库[美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，简称NCBI)，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov]进行blast分析，得到一批具有与PTP基因序列相似度高的基因序列的菌种及其氨基酸序列。通过软件MEGA7对不同菌种PTP基因的氨基酸序列进行多序列比对，找出保守氨基酸序列Motif，由此获得合适的简并引物：
PTP1-F:5’-NACHACHGGCCAHACRAA-3’
PTP2-R:5’-GTHGAYATHATGGTMTTYAT-3’
其中，简并碱基代码Y=C/T，R=A/G，H=A/C/T，B=G/T/C，N=A/G/C/T。
实施例2 利用实施例1得到的简并引物筛选瓜氨酸降解菌
从发酵制品腊肠、大酱、酱油和泡菜中划线分离出待检测单菌落，利用上述简并引物对PTP1-F和PTP2-R进行菌落PCR，菌落PCR反应体系为50μl，具体为：DNA模板<50 ng，上游引物和下游引物各1μl，2*Es Taq MasterMix(Dye) DNA Polymerase 25μl，灭菌超纯水补至50μl。
PCR反应条件为：98℃预变性3min，95℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸2min。菌落PCR扩增结束后取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。
根据扩增产物是否含有约1000bp的DNA片段来判定待测菌株是否含有PTP基因；即若在1000bp位置处出现电泳条带，则判定该菌株具有PTP基因，反之则无。由图1和图2可以看出，共有4株待测菌株在1000bp位置处出现电泳条带，即通过简并引物对进行菌落PCR筛选，从腊肠中筛出的一株菌株命名为LC-1；从大酱中筛出的一株菌株命名DJ-2；从酱油中筛出的一株菌株命名JY-3；从泡菜中筛出的一株菌株命名PC-4。
实施例3 对实施例2筛选出的菌种进行分类鉴定
序列比对和系统发育树的构建
菌种活化：将通过简并引物PTP1-F和PTP2-R扩增后，扩增产物中含有约1000bp的DNA片段的4株菌株，即菌株LC-1、LC-2、JY-3和PC-4接种于MRS培养基中，在30℃ 180rpm培养条件下活化。
细菌基因组DNA的提取：按照细菌DNA提取试剂盒说明书，提取其基因组DNA。
16S rDNA的PCR扩增：以提取的细菌基因组DNA为模板，通用引物27F和1492R为引物，进行16S rDNA PCR，配制反应体系为50μl，具体为：2*pfu PCR MasterMix高保真酶25 μl，模板DNA<50 ng，引物27F 1μl，引物1492R 1μl，灭菌超纯水补至50 μl。
PCR反应条件为：98℃预变性3 min，95℃变性 30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增结束后取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。
扩增结果如图3，将扩增产物有约1500bp DNA片段的PCR原液送至测序公司测序。
将测序成功的拼接序列提交NCBI数据库，利用BLAST软件进行分析，选择相似菌株通过MEGA7计算进化距离，采用NJ算法构建系统发育树，与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的种。
从图4可以看出，LC-1为Lactobacillus sakei，命名为Lactobacillus sakei-LC-1。
从图5可以看出，DJ-2为Weissella confusa，命名为Weissella confusa-DJ-2。
从图6可以看出，JY-3为Pediococcus acidilactici，命名为Pediococcus acidilactici-JY-3。
从图7可以看出，PC-4为Lactobacillus brevis，命名为Lactobacillus brevis-PC-4。
对筛选到的菌种采用甘油管保藏法，即40%甘油与菌液等体积均匀混合，于-80℃冰箱保藏。
实施例4 本发明方法的有效性验证
对筛到的四种菌种进行活化并扩培，利用化学法通过分光光度计检测其对胞外瓜氨酸的利用能力。
具体方法是：
甘油保藏菌在MRS培养基中活化12h后，按1%接种量转接到100ml MRS液体培养基中，30℃，180rpm，培养至OD600=0.8-1.0。将上述培养液离心收集菌体，50ml含10mM瓜氨酸的MRS液体培养基重悬，每种菌设计三组平行实验，继续30℃，180rpm培养。于0h、4h、8h分别取样，离心取上清，将上清液稀释200倍制成待测样品。取待测样品5ml，加入H2SO4-H3PO4混合酸（V(H2SO4)：V(H3PO4)=1:3）2ml，30g/L二乙酰一肟0.25ml，避光沸水浴反应30min，冷却至室温，测定490nm处吸光度，Flask MRS液体培养基作对照校准。
测定结果如图8所示，所筛到的菌种在一定时间内均表现出对胞外瓜氨酸的降解能力，即胞外瓜氨酸含量呈下降趋势，其中，以Lactobacillus brevis-PC-4胞外瓜氨酸含量降低程度最大，Weissella confusa-DJ-2在第4h时胞外瓜氨酸含量降至最低。
综上，本发明所筛到的具有PTP基因的菌种均表现出对瓜氨酸利用能力，且在与不含PTP基因的菌种，如大肠杆菌的比较中发现，不具有PTP基因的菌种胞外瓜氨酸含量始终高于有PTP基因的菌种。
通过上述实验可以证明，本发明设计的简并引物具有较强的通用性，特异性和准确性。
虽然本发明以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内都可做各种改动与修饰，因此本说明的保护范围应该以权利要求书所界定为准。
序列表
<110> OrganizationName : 河南农业大学
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物及其应用
<130> AppFileReference : 2021
<140> CurrentAppNumber :
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<213> OrganismName : 人工序列()
reequencet ring 60
ptpfnachac hggccahacr aa 37
<212> Type : DNA/RNA
000
000
000
000
<211> --------
<213> OrganismName : 人工序列()
reequencet ring 60
ptprgthgay athatggtmt tyat 39
<212> Type : DNA/RNA
000
000
000

Claims (2)

1.一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物，其特征在于：所述简并引物的序列为：
PTP1-F:5’-NACHACHGGCCAHACRAA-3’
PTP2-R:5’-GTHGAYATHATGGTMTTYAT-3’
其中，简并碱基代码Y=C/T，R=A/G，H=A/C/T，B=G/T/C，N=A/G/C/T。
2.权利要求1的简并引物在筛选瓜氨酸降解菌方面的应用。
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