CN110218709B - 一种耐热漆酶及其基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热漆酶及其基因与应用。所述漆酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。编码漆酶的基因其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，基因的全长序列如SEQ ID NO.1所示。发酵培养包含Lac2基因的细胞，收集粗酶发酵液，并通过硫酸铵沉淀、离子交换层析等纯化手段分离出该细胞发酵培养所产的主要漆酶：Lac2漆酶。本发明耐热漆酶在70℃下仍具有较高活性，在70℃下仍能高效降解孔雀石绿。本发明的Lac2基因编码的漆酶具有很好热稳定性且具有良好的pH、有机溶剂和抑制剂耐受性，具有很好的工业应用前景，能够为漆酶的工业化应用提供稳定的新型漆酶酶源，实现较好的经济效益和社会效益。

Description

一种耐热漆酶及其基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热漆酶及其基因与应用。

背景技术

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）又名苯二酚双氧氧化还原酶（para-benzenediol：dioxygen oxidoreductase），属于蓝色多铜氧化酶（blue multi-copper oxidase）家族。漆酶在催化底物的过程中，不需要H₂O₂，产物只生成H₂O，因此被称为“绿色催化剂”。漆酶具有广泛的底物范围，因此在纺织、造纸、食品、有机物合成、生物降解、环境修复等领域具有广阔的应用前景。

漆酶广泛存在于真菌中，担子菌门的白腐真菌是主要的漆酶生产菌，如栓菌属（Trametes）、侧耳属（Pleurotus）和齿毛菌属（Cerrena）。几乎所有的真菌分泌一种以上的漆酶同工酶；不同漆酶在表达调控、催化特性、热稳定性、对酸碱、有机溶剂及抑制剂耐受性等方面存在差异，而这些性质与实现漆酶的工业化应用紧密联系。现有的研究表明，真菌漆酶一般在50℃以下的稳定性好，而在60℃及以上则容易失活。例如，齿毛菌（Cerrena sp.）HYB07的主要漆酶Lac7在60℃及以下较为稳定，但在70℃保温20 min，酶活力完全丧失。Cerrena unicolor C-139的漆酶在70 ℃的半衰期为15 min，在70℃保温60 min后只有5%的酶活力剩余。来源于Cerrena unicolor strain137的两种漆酶LaccI和LaccII，LaccI在70℃保温20 min后酶活力完全丧失，LaccII在70℃保温60 min后仅剩余10%的酶活力。

尽管漆酶在各领域都具有很重要的用途，但漆酶的稳定性仍是限制其工业化应用的主要因素。要实现漆酶的应用价值，必须寻找出更多稳定性好的酶源，如高温下的应用需要耐热漆酶。

发明内容

本发明的目的在于主要提供一种耐热型漆酶及其基因与应用，扩展漆酶基因资源库，为实现漆酶在工业上的应用提供更有价值的酶源。

本发明提供的一种耐热漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供的一种编码耐热漆酶的基因，所述的编码耐热漆酶的基因为Lac2，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的Lac2基因全长序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的耐热漆酶的制备方法：发酵培养包含Lac2基因的细胞，收集包含Lac2耐热漆酶的发酵液，并通过硫酸铵沉淀、离子交换层析等纯化方法分离出所述的耐热漆酶。

本发明的具体的技术方案详述如下：

本发明涉及从白腐真菌一色齿毛菌(Cerrena unicolor)中克隆Lac2基因，该菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为CGMCC 5.1011。

本发明涉及从一色齿毛菌中克隆的Lac2的基因和cDNA序列。实施方式之一，提取一色齿毛菌的基因组DNA和总RNA，以总RNA为模板形成cDNA 第一链。提取的一色齿毛菌的总RNA送往北京诺禾致源进行高通量转录组测序，分析转录组测序结果，获取漆酶基因信息，根据转录组预测的漆酶开发阅读框的cDNA序列信息，设计引物，通过RT-PCR获得Lac2的cDNA序列，以基因组为模板，PCR扩增得到Lac2的基因序列。所述的基因序列包含SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。所述的cDNA序列包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。SEQ IDNO.1中的DNA序列由2265个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第一位到2265位碱基，包含2265个碱基对。该序列包含了12个内含子，分别为5’端第181位到第235位碱基，第304位到第353位碱基，第476位到第528位碱基，第642位到第693位碱基，第758位到第813位碱基，第907位到第963位碱基，第1121位到第1183位碱基，第1385位到第1438位碱基，第1496位到第1554位碱基，第1768位到第1816位碱基，第1934位到第1991位碱基，第2110位到第2169位碱基。其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，由1599个碱基组成。

SEQ ID NO.3由532个氨基酸组成，自N’第1-15位氨基酸残基是信号肽序列；成熟酶为517 个氨基酸。

本发明还涉及了所述漆酶的制备方法，发酵培养一色齿毛菌，收集发酵液后，进行硫酸铵沉淀和阴离子交换层析柱等步骤得到其主要漆酶，并通过MALDI-TOF MS/MS鉴定该纯酶为上述的Lac2漆酶。

本发明所述的漆酶以ABTS、邻苯二酚及愈创木酚为底物，最适反应pH分别为3.0、5.5、5.5，最适反应温度为55、45、60 ℃。在pH 5.0-9.0条件下保温24 h及48 h，其剩余活力仍能够保持在80-96%之间，pH稳定性好。同时具有很好的热稳定性，其t _{1/2, 60℃}为7.792 h，t _{1/2, 70℃}为1.673 h。其还能够耐受多种金属离子，Ca²⁺、K⁺、Mn²⁺、Pb²⁺和Zn²⁺对其活力有促进作用，而Cu²⁺和Co²⁺对其活力没有明显影响。其还能 够耐受多种有机溶剂，10%的甲醇、乙醇、二甲基亚砜、异丙醇、丙酮和乙腈对其活力影响不大，与无有机溶剂时相似。有机溶剂浓度升高到25%时，其酶活力仍保持在50%以上。其对L-cys、EDTA、SDS和Triton-X 100的耐受性好，0.1mM 和1 mM的L-cys对其酶活力几乎没有影响，在0.05 mM SDS和0.5、1 mM的Triton-X 100中，其剩余酶活力在84%以上。本发明所述的Lac2漆酶在70℃时仍能对100mg/L孔雀石绿进行高效脱色。

本发明的优点在于：本发明所述的耐热漆酶（Lac2漆酶）是一种新型的耐热性漆酶兼具良好的pH、有机溶剂和抑制剂耐受性，能够为漆酶的工业化应用提供稳定的新型漆酶酶源，减低成本，实现较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1 发酵培养基碳源优化。

图2 发酵培养基最佳碳源（甘油）量优化。

图3 发酵培养基氮源优化。

图4 发酵培养基最佳氮源（蛋白胨）浓度优化。

图5 Lac2漆酶纯化结果的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白质Marker；1：齿毛菌5.1011发酵液总蛋白；2：DEAE阴离子交换柱分离出的Lac2；3：经过N-glycopeptidase F去糖基化酶（Takara）处理后的Lac2漆酶。

图6 Lac2漆酶与ABTS、catechol（邻苯二酚）、guaiacol（愈创木酚）反应的最适pH。

图7 Lac2漆酶与ABTS、catechol（邻苯二酚）、guaiacol（愈创木酚）反应的最适温度。

图8 Lac2漆酶的pH稳定性。

图9 Lac2漆酶的温度稳定性。

图10 金属离子对Lac2漆酶活性的影响。

图11 有机溶剂对Lac2漆酶活性的影响。

图12 抑制剂等对Lac2漆酶活性的影响。

图13 不同温度下Lac2漆酶、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况。图中MG表示未加漆酶处理的孔雀石绿，B1、B2、B3分别表示30 ℃下Lac2、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况，C1、C2、C3分别表示50℃下Lac2、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况，其中C2颜色为粉色；D1、D2、D3分别表示70℃下HYB07漆酶、Lac2、Trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况，其中D1颜色为较深的蓝色，D3颜色为紫色。

图14不同温度下Lac2漆酶、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿的脱色率。

图15-A 30℃温度下Lac2漆酶、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿脱色的全波长扫描。

图15-B 50℃温度下Lac2漆酶、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿脱色的全波长扫描。

图15-C 70℃温度下Lac2漆酶、HYB07漆酶、Trametes漆酶对孔雀石绿脱色的全波长扫描。

具体实施方式

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以下根据具体的实施例充分说明本发明，但本发明不仅限于此。

1.菌株和载体

一色齿毛菌（Cerrena unicolor）5.1011菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（编号为CGMCC 5.1011），以下将其命名为齿毛菌5.1011。大肠杆菌Top10，克隆载体PMD18-T购自TaKaRa公司。Cerrena sp. HYB07菌株来源于福州大学生物科学与工程学院。

2.试剂

2× EasyTaq PCR superMix、cDNA 合成试剂盒（TransScript One-Step Removaland cDNA Synthesis SuperMix）和蛋白marker购自TransGen Biotech公司，Fungal DNAKit、Gel Extraction kit购自OMEGA公司，ABTS（2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）和孔雀石绿购自Sigma公司，Rapid PNGase F购自TaKaRa公司，其他试剂购自上海生工或者进口。

3.漆酶

HYB07漆酶：由Cerrena sp. HYB07发酵制备所得（Yang et al. (2014)Purification and Characterization of a Novel Laccase from Cerrena sp. HYB07with Dye Decolorizing Ability. PLoS One, 9(10): e110834）。

Trametes漆酶（Laccase from Trametes versicolor，CAS No. 80498-15-3）：购自Sigma-Aldrich。

4.培养基

LB培养基参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。

一色齿毛菌5.1011产漆酶发酵培养基中含有（1 L）：甘油20 g；蛋白胨15 g；KH₂PO₄ 6 g；MgSO₄·7H₂O 4.14 g；CaCl₂ 0.3 g；NaCl 0.18 g；CuSO₄·5H₂O 0.0625 g；ZnSO₄·7H₂O 0.018 g和维生素B1 0.015 g。

齿毛菌HYB07产漆酶发酵培养基（1L）：糊精60 g、蛋白胨10 g、酒石酸铵1.6 g、KH₂PO₄ 6.0 g、MgSO₄.7H₂O 4.2 g、CaCl₂ 0.3 g、NaCl 0.2 g、CuSO₄.5H₂O 62.5 mg、ZnSO₄.7H₂O 18.0 mg、VB1 15.0 mg。

5. 本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

6.本发明所有相关的酶活、酶活力、酶活性均指漆酶活性，均采用以下方法之一检测：

（1）、ABTS为底物，在2.0 mL的反应体系中含0.975 mL 0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 3.0），1.00 mL 0.5 mmol/L ABTS和25 µL适当稀释的酶液。55℃恒温水浴锅中准确反应5 min后，测定反应体系在420 nm处吸光值的变化量。酶活力的定义：每分钟催化1 µmol ABTS氧化所需酶量为1个酶活力单位(U)。

（2）、Guaiacol（愈创木酚）为底物，2.0 mL反应体系含1.86 mL 0.05 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液、100 µL 20 mmol/L 愈创木酚溶液和40 µL适当稀释的酶液。40℃恒温水浴锅中准确反应5 min后，测定反应体系在465 nm处吸光值的变化量。以灭活的酶液作为空白。酶活力的定义：在pH 4.5，40℃条件下，每分钟催化1 µmol愈创木酚氧化所需酶量为1个酶活力单位（U）。

（3）、Catechol（邻苯二酚）为底物，反应体系2.0 mL，其中含0.9 mL 0.05 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.5）、1.0 mL 5 mmol/L邻苯二酚溶液和100 µL适当稀释的酶液。40℃恒温水浴锅中准确反应10 min后，测定反应体系在400 nm处吸光值的变化量。以灭活的酶液作为空白。酶活力的定义：在pH 4.5，40℃条件下，每分钟催化1 µmol邻苯二酚氧化所需酶量为1个酶活力单位（U）。

实施例1 产酶培养基碳氮源优化

（1）齿毛菌的培养与漆酶发酵

从4℃保藏的斜面培养基上挑取一色齿毛菌5.1011的菌丝在PDA固体培养基平板上划线，26℃恒温培养箱中培养4 d。用直径1 cm打孔器打孔，取5个菌饼至50 mL/150 mLPDA液体培养基中，200 rpm，30℃，摇床培养2 d，制备一级种子液。按8%的接种量，取4 mL一级种子液至100 mL/250 mL液体PDA培养基中，200 rpm，26℃，摇瓶培养2 d，制备二级种子液。按8%（v/v）的比例将二级种子液接种到发酵培养基中，培养条件不变，进行产酶发酵培养。

（2）发酵培养基碳源优化

以2%（w/v）的碳源浓度进行发酵培养基的碳源种类优化，其他培养基成分保持不变。选择的碳源有：非糖类（ 甘露醇、甘油）、单糖（葡萄糖），二糖（乳糖、蔗糖）和多糖（纤维素、麦芽糊精、玉米糊精、β-糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉）。在所测试碳源中，甘油为最佳碳源。以甘油为碳源发酵，在15 d可以达到最高酶活121.76 U/mL，明显高于其它碳源的最高酶活力。其次是麦芽糊精，在第9 d达到最高酶活力为36.95 U/m。以甘露醇为碳源时，该齿毛菌在第17 d达到最高酶活力为38.74 U/mL，在玉米淀粉为碳源的培养基中13 d达最高酶活力为18.51 U/mL，在玉米糊精为碳源的培养基11 d达最高酶活力为17.57 U/mL，而在其他碳源中的最高酶活力均较低。因此，确定甘油为该齿毛菌发酵的最佳碳源。

以甘油为最佳碳源，以1%、2%、3%和5% (w/v)浓度进行碳源浓度的优化，确定最佳碳源浓度。该齿毛菌在不同甘油浓度下，漆酶酶活在第9 d均能大幅度提升。在1%甘油在第11 d能达到最高酶活力为40 U/mL，第15 d酶活开始下降，而3%和5%甘油中在第17 d达到最大酶活力，分别为63和34 U/mL，因此确定2%甘油为发酵产酶的最佳碳源。

（3）发酵培养基氮源优化

以2%甘油为最佳碳源，进行发酵培养基的氮源优化。改变发酵培养基的氮源种类，保持氮源浓度1.5%的含量不变。选择的氮源有：无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）、简单有机氮源（酒石酸铵）和复杂有机氮源（蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，豆饼粉）。总的来说，该齿毛菌在有机氮源中产酶情况较好，无机氮源最差，以蛋白胨为氮源时，漆酶产量最高，其次是牛肉膏，因此选择蛋白胨为该齿毛菌的最佳氮源。

以0.5%、1%、1.5%以及2%（w/v）浓度进行蛋白胨浓度的优化，绘制出产酶曲线，确定最佳氮源浓度。蛋白胨含量为1.5%时，产酶量最高，为123.5 U/mL，其次是氮源含量为1%，最高酶活力为66.8 U/mL，因此选择选择1.5%的蛋白胨为该齿毛菌的最佳氮源。

实施例2 转录组测序

（1）总RNA的提取分离

收集一色齿毛菌5.1011在产酶发酵培养基发酵到第六天的菌丝，抽滤干后立即加入液氮充分研磨，利用RNeasy Plant Mini Kit 试剂盒（Qiagen公司）提取齿毛菌5.1011的总RNA。用2%的琼脂糖电泳检测所提取RNA的降解程度，用NanoDrop 2000测OD260/280比值，检测RNA的纯度。

（2）转录组的建库与测序

样品检测合格后，送往北京诺禾致源公司进行无参转录组测序。用有Oligo(dT)的磁珠与mRNA的ployA进行A-T碱基配对，分离出mRNA。加入fragmentation buffer使原先平均长度为几kb的完整mRNA随机断裂成200 bp左右的小片段。在逆转录酶的作用下，利用随机引物，使mRNA为反转形成稳定的双链结构。将双链cDNA纯化后进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。PCR扩增，保证大部分片段在150~200 bp使用Ampure XP系统纯化PCR产物，获得最终文库。随后进行库检，经过定量后将文库稀释到1.5 ng/uL，再运用Agilent 2100检测文库的insert size，insert size符合预期后，运用qPCR方法准确定量文库的有效浓度。文库有效浓度大于2 nM，库检合格。根据有效浓度和目标下的机数据量需求将不同的文库pooling后进行Illumina HiSeq测序。

（3）Illumina HiSeq 测序分析

Illumina原始数据处理与质量评估：测序reads 错误率会随着测序的进行而升高，是由测序过程中化学试剂的消耗造成，因此需要对测序原始数据进行质量控制。Illumina测序得到的原始数据(raw reads)进行带有接头、ploy-N和低质量（质量值Qphred≤20的碱基数占整个reads的50％以上的reads）的raw reads的过滤得到clean reads，并计算出clean reads的Q20、Q30%（red 数值大于20、30 的碱基占总体碱基的百分比）、碱基错误率GC %以及碱基重复水平，进行质量控制，保证后续分析质量。后续分析均基于cleanreads。

转录组本拼接：无参数转录组需要对clean reads进行拼接以获取后续分析的参考序列。采用Trinity对clean reads进行拼接，然后用Corset程序（https://code.google.com/p/corset-proje）对转录本进行层次聚类，以聚类后序列为参考，进行后续分析。

基因功能注释：为了得到全面的基因功能信息，本发明进行了NR、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG、GO七大数据库的基因功能注释。

实施例3 Lac2漆酶基因序列的获得

（1）转录组漆酶基因信息的获取

在测序前完整mRNA片段被随机打断后上机测序，测序结束后经质量控制后得到的clean reads拼接成了不同的clusters。拼接的长度在200～40000 bp，长度不一。可能存在不同的cluster注释为同一种基因，但其比对到基因的位置可能有所不同，也可能有重叠部分。因此以注释为同一种漆酶基因为原则，将拼接结果（clusters）进行归类分析。

基于转录组注释结果的归类分析，预测出Lac2的cDNA序列信息。根据序列信息，设计包括完整开发阅读框在内的引物，引物序列如下。

Lac2-F: 5’-ATGGGCGTGGGTCTACTCTC-3’；

Lac2-R: 5’-TCATGATGCACTGGTCTGAGC-3’。

（2）PT-PCR获取Lac2漆酶cDNA序列

以实施例2提取的总RNA为模板，用TransScript One-Step Removal and cDNASynthesis SuperMix（TransGen Biotech公司）合成cDNA第一链。PCR反应体系（50 μL）为2xEasyTaq PCR SuperMix 25 μL，cDNA第一链模板1 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反正向引物（10 μmol/L）1 μL，ddH₂O 22μL。PCR程序为为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，65℃退火30s，72℃延伸2 min，循环扩增35次；最后72℃延伸10 min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，用Gel Extraction kit（OMEGA公司）回收凝胶中的目标基因并克隆到PMD18-T载体上。用化学转化法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在含有100 μg/mL ampicillin的LB平板上37℃培养过夜。通过蓝白斑筛选，挑取白色的单克隆进行菌落PCR验证（PCR反应程序与上述相同），并接种到2 mL含有100 μg/mL ampicillin的LB液体培养基中培养8-10 h后抽提质粒进行测序分析(Invitrogen公司)，获得Lac2的cDNA序列(SEQ ID NO.2)。

（3）PCR获取Lac2基因序列

收集一色齿毛菌5.1011在上述的二级种子液中培养2天的菌丝，抽滤干后立即加入液氮充分研磨，利用Fungal DNA Kit 试剂盒（OMEGA公司）提取齿毛菌5.1011的基因组DNA。以此为模板，Lac2-F/Lac2-R为引物，PCR反应体系（50 μL）为2x EasyTaq PCRSuperMix 25 μL，基因组DNA模板1 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反正向引物（10 μmol/L）1 μL，ddH₂O 22μL。PCR程序为： 95℃预变性3 min；94℃变性30 s，65℃退火30s，72℃延伸10 min，循环扩增35次；最后72℃延伸10 min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，回收凝胶中的目标基因并克隆到PMD18-T载体上，进行测序，获得Lac2的DNA序列（SEQ IDNO.1）。

（4）基于cDNA序列，预测Lac2蛋白由532个氨基酸残基组成(SEQ ID NO.3)，自N端第1-15位氨基酸残基是信号肽序列；成熟酶蛋白(除去信号肽序列后)包含517个氨基酸残基。通过Blast软件将Lac2编码蛋白同已知漆酶蛋白进行序列比对，可知其与其他来源白腐真菌的漆酶同源，其中与Cerrena sp. HYB07中的Lac4（AID59412.1）的相似性最高，为67%。

实施例4 Lac2漆酶的制备

（1）漆酶发酵液的制备

一色齿毛菌5.1011在实施例1的发酵条件下培养15天，12000 rpm离心10 min后取上清并用定性滤纸抽滤得到漆酶粗酶液。

（2）漆酶的分离纯化

将粗酶液按一级0-50%，二级50-90%进行硫酸铵分级沉淀。用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解硫酸铵沉淀所得的蛋白，置于2L 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中4℃过夜透析，每隔12 h更换50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。AKTA系统清洗好后，用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）的A液充满管路后装上HiTrap DEAE（5 mL）的阴离子交换层析柱并平衡柱子。将透析后的粗酶液用0.20 µm的滤膜进行抽滤后上样于DEAE平衡好的交换柱。待完全进样后，用A液平衡柱子，用B液含1 mol/L NaCl的50 mmol/LTris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗脱蛋白，设置B液含量为15%，流速为1 mL/min，收集有酶活的洗脱液。对每管洗脱液进行酶活测定，将高酶活组分置于4℃冰箱中保存备用。

按照说明书使用EasyⅡ Protein Quantitative Kit （BCA）试剂盒（Transgen）测定蛋白浓度。测出每一步纯化前后的漆酶酶活力和蛋白浓度后，计算出比活力和纯化倍数，结果如表1所示。漆酶经过硫酸铵和阴离子交换柱（DEAE）后比活力为521.6 U/mg，纯化倍数为8.69，回收率为29.53%。SDS-PAGE分析结果如图5所示，经DEAE分离后得到分子量在58.4-74.0 kDa之间的蛋白条带，按照说明书使用N-glycopeptidase F去糖基化酶（Takara）对该蛋白去糖基化处理后得到一条分子量约为50.0 kDa的蛋白，证实DEAE纯化后达到电泳纯，纯化漆酶的糖基化程度为16.8-48.0%，糖基化程度较高。

（3）Lac2漆酶的鉴定

将纯化后漆酶单一的胶条割胶后，将样品送至中科新生命(APTBIO)，利用MALDI-TOF MS/MS 鉴定为Lac2漆酶。

表1 一色齿毛菌5.1011漆酶分离纯化步骤及结果

实施例5 Lac2的酶学性质分析

（1）最适pH和温度

以ABTS、guaiacol、catechol为底物，测定Lac2的最适反应pH。Lac2对上述三种底物的最适反应pH分别为3.0、5.5、5.5。以ABTS、guaiacol、catechol为底物，在最适pH条件下测定温度（20-70℃）对Lac2催化上述三种底物的活力。结果表明Lac2与三种底物反应的最适温度分别为55、45、60 ℃。

（2）pH稳定性和温度稳定性

将Lac2酶液与pH 2.5-8.7柠檬酸-Na₂HPO₄ 缓冲液以体积比1:10混合后，置于30℃水浴锅中处理24 -48 h，以ABTS为底物，在最适的pH和温度下测定其剩余酶活，探究漆酶的pH稳定性。在pH 5.0-9.0条件下保温24 h及48 h，其剩余活力仍能够保持在80-96%之间，pH稳定性好。将该酶置于40、50、60、70℃水浴锅中保温0~11 h，每隔1 h以ABTS为底物，在其最适条件下测定其剩余酶活，探究漆酶的热稳定性，用Graphpad Prism 6软件拟合曲线，计算出热失活常数，结果如表2所示。结果表明，低于60℃时保温11 h，该酶仍能保持62%以上的活力。该酶在60℃的半衰期(t _1/2 )为7.792 h，70℃的半衰期(t _1/2 )为1.673 h，具有很好的热稳定性。相比而言，HYB07的主要漆酶Lac7在70℃保温20 min，酶活力完全丧失。

表2 Lac2的热失活参数

（3）金属离子、有机溶剂以及抑制剂对酶活力的影响

在ABTS为底物的测定酶活的反应体系中加入金属离子（Al³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、K⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Li⁺、Mg²、Mn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺），终浓度为10 mM，以探究金属离子对该酶活力的影响，以未添加金属离子的酶活力为参照，在最适反应条件下测定其剩余酶活。结果表明该酶能够耐受多种金属离子，Ca²⁺、K⁺、Mn²⁺、Pb²⁺和Zn²⁺对其活力有促进作用，而Cu²⁺和Co²⁺对其活力没有明显影响。

在ABTS反应体系中加入终浓度为10%、25%的有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈和二甲亚砜），以未添加有机溶剂的酶活力为参照，在最适反应条件下测定其剩余酶活力，以探究有机溶剂对该酶活力的影响。结果表明，该酶具有较强的有机溶剂耐受性，10%的甲醇、乙醇、二甲基亚砜、异丙醇、丙酮和乙腈对其活力影响不大，与无有机溶剂时相似。有机溶剂浓度升高到25%时，其酶活力仍保持在50%以上。

在反应体系中添加终浓度为0.1 mM、1 mM的NaN₃、L-Cys，1 mM、10 mM的EDTA，20mM、50 mM、100 mM的NaCl，0.05 mM、0.2 mM的SDS，0.5 mM、1 mM的Triton X-100，以未添加上述试剂的酶活为参照，最适反应条件下测定该酶的剩余酶活，探究其对该酶活性的影响。结果表明，该酶对L-cys、EDTA、SDS和Triton-X 100的耐受性好，0.1mM 和1 mM的L-Cys对其酶活力几乎没有影响，在0.05 mM SDS和0.5、1 mM的Triton-X 100中，其剩余酶活力在84%以上。

实施例6 比较不同漆酶的热稳定性

以下漆酶酶活测定均以ABTS为底物。本发明中的Lac2漆酶其60℃时保温11 h后仍能保持62%以上的活力，该温度的半衰期(t _1/2 )为7.792 h，而70℃的半衰期(t _1/2 )长达1.673h，具有很好的热稳定性。粗毛栓菌lg-9（黄峰等人，一种粗毛栓菌及其培养方法与应用，CN101280277A）与DMP底物反应的最适温度为85℃，但其在75℃时保温300 s后完全没有活性。来源于亮菌的重组漆酶（詹洁，亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用，CN105543250A）以ABTS为底物时其最适温度为55℃，与本发明所述的Lac2漆酶相同，不同的是CN 105543250A的漆酶其在30℃或40℃下保温1 h后酶活力仅剩余60%左右，而本发明中的Lac2漆酶在50℃及以下保温1h剩余酶活力在90%以上，保温11 h后其剩余酶活力仍在75%及以上。重组鸡腿菇漆酶（丁少军等人，一种漆酶基因Lac6及其表达蛋白的应用，CN103710363A）以ABTS为底物时其最适温度为65℃，其在50℃以下保温1 h的剩余酶活力在80%以上，但60 ℃时1 h后完全失活，70 ℃保温15 min后完全失活。

实施例7 比较不同漆酶的抗逆性

Lac2与其他漆酶的抗逆性相比较，结果如下：本发明中1 mM EDTA对Lac2没有影响，EDTA浓度升高到10 mM时，仍具有较高酶活力为79%，高浓度的EDTA抑制程度低。Ning等人纯化出的LAC-04漆酶，EDTA浓度为1.25 mM时相对酶活力为113%，而当浓度为10 mM时酶活力仅剩余42%（Ning, et al. (2016) An extracellular yellow laccase with potentdye decolorizing ability from the fungus Leucoagaricus naucinus LAC-04.International Journal of Biological Macromolecules, 93: 837-842）。从Thielavia sp.中分离纯化出的TaLac1漆酶，在10 mM的EDTA中剩余酶活力为63%（Mtibaà, et al.(2018) Purification and characterization of a fungal laccase from theascomycete Thielavia sp. International Journal of Biological Macromolecules,120: 1744-1751）。许多报道表明L-cys是漆酶有效的抑制剂，而本研究中0.1mM的L-cys对本研究中的Lac2几乎没有影响：L-cys浓度为1 mM时，仍对Lac2没有抑制作用，表明Lac2具有很强的抗L-cys抑制能力。从Trametes orientalis分离纯化的漆酶在0.1 mM的L-cys中剩余酶活力为30%（Zheng, et al. (2017) A novel laccase from white rot fungusTrametes orientalis: Purification, characterization, and application.International Journal of Biological Macromolecules, 102: 758-770）绒毛栓菌产的Tplac漆酶当抑制剂L-cys浓度为0.05、0.1、1.0 mM时，其漆酶剩余酶活力为 89.75%、78.74%、38.89%（司静，生产漆酶的菌株、利用菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶及其应用，104611235 A）。0.1mM L-cys对CotA漆酶活性几乎没有影响，当L-cys浓度为1mM时，剩余酶活力仅为26.97%（乔雄维，一种Cot漆酶及其应用，CN106047827A），而本发明中0.1mM 和1mM的L-cys均其酶活力几乎没有影响，具有显著的抗逆性。

实施例8 比较不同漆酶对孔雀石绿的脱色

将漆酶应用于染料孔雀石绿（MG）的降解，检验Lac2漆酶热稳定性在应用中的价值，同时与HYB07漆酶和Trametes veriscolor漆酶相比较。在漆酶介导孔雀石绿的降解过程中，孔雀石绿（MG）逐步去甲基化形成desmethyl MG，didesmethyl MG，tridesmethyl MG和tetradesmethyl MG等中间产物，而后被进一步降解（Yang et al. (2015) Laccase-Catalyzed Decolorization of Malachite Green: Performance Optimization andDegradation Mechanism. PLoS One, 10(5): e0127714）。

在30、50和70 ℃条件下，利用Lac2漆酶、HYB07漆酶及Trametes漆酶分别对孔雀石绿进行脱色。脱色反应体系中含有50 mm磷酸柠檬酸缓冲液（pH6.0）、100 mg/L MG和20 U/mL漆酶。以热灭活漆酶混合物作为阴性对照。6 h后，两种漆酶对孔雀石绿的脱色情况如图13所示，用酶标仪测定290~900 nm范围的吸收波长，绘制出脱色前后的全波长图谱（图15-A、B、C所示）。并根据MG的最大吸收波长614 nm，计算出漆酶对不同染料的脱色率，比较三种漆酶在不同温度下对孔雀石绿的脱色效果。

在30℃下，三种漆酶对MG的脱色效果类似，脱色率均在92%以上，脱色后MG的特征吸收峰消失，且没有新的吸收峰出现（图15-A）。当脱色温度为50℃时，三种漆酶对MG的脱色率均在90%以上，但HYB07漆酶降解MG溶液变成粉色，该粉色物质在560 nm处有最大吸收峰（图15-B）。前期研究表明，该现象是由于高温下HYB07漆酶的不稳定而导致MG的降解途径发生了阻断，进而导致粉色脱甲基产物（tetradesmethyl MG）积累（Yang et al. (2017)Immobilized Cerrena sp. laccase: preparation, thermal inactivation，andoperational stability in malachite green decolorization. Scientific Reports7: 16429）。这种现象没有在Lac2漆酶和Trametes漆酶降解孔雀石绿的过程中观察到。在70℃时，5.1011的Lac2漆酶仍能完全降解MG，而HYB07漆酶在高温下很快失活，反应结束后仍具有较深的颜色，最大吸收峰转移至590 nm，推测为didesmethyl MG的积累（Bongsup etal. (2003) Synthesis and characterization of N-demethylated metabolites ofmalachite green and leucomalachite green. Chemical Research in Toxicology,16: 285-294）。同样地，Trametes漆酶反应结束后，溶液为紫色，最大吸收峰也转移至590nm，但是较HYB07漆酶脱色后的最大吸收峰低，说明Trametes漆酶的热稳定性虽然较HYB07漆酶高，但其在70℃也容易失活，导致降解孔雀石绿发生了阻断，在该温度下不能使孔雀石绿完全脱色。本申请以高温下漆酶对孔雀石绿的脱色为例，说明Lac2的热稳定性使其在高温下较其他漆酶更具优势，更有操作稳定性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种耐热漆酶及其基因与应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggcgtgg gtctactctc acttcttcct actaccatac tcgctgtcgg ggtcagtgct 60

gccattggcc ctatctccga tttgaatatc gtcaataaaa acattactgc tgacggcttt 120

gaaaggccca ctgtccttgc agggggcacc ttcccaggcc ctctcatcat tggaaacaag 180

gtcaatattt ttctctcctt taattcgttg cattatctca cagttatgaa ttcagggtga 240

caatttccaa ctgaatgtca ttgaccagct cgtcgatgac cgtatgttga ctgcgacctc 300

catggtaagt caagccacct aacctaaaat ctatttactg atagttgctt ctagcactgg 360

catggtctat tccagaatgg gactaattgg gctgacggac ctccattcgt aacacagtgt 420

cctattgtag cgaatgactc tttcttgtat aatttcactg ttcctggcca agccggtagg 480

tggtctgtcc aacgttacta ttacaagata atcaagaatt atttttagga acgttctggt 540

accatagcca tctggagacc cagtactgcg atggtctccg gggtcctctt gttgtgtatg 600

atcctaacga cccaaacaag gacttgtatg acgttgacaa tggtaaatca gttgatcata 660

tgtatcgcga tctatctatt cattcgacga ttagagacta ccgttatcac ccttgcagac 720

tggtatcatg tactggcaca ggcggttgtc ggtgctgcgt gggtgtagtt cattctattc 780

atagggatca ctttcaattg acaacttcat ccagtatacc ggacagtacc cttatcaatg 840

gtttgggccg ctctcctggt aatctcgatg ccaacctatc ggtaattact gttgagagca 900

gtaaacggta tgtcggctca tttctctgac atttaccttc ggagataaac cttaactcta 960

tcagctaccg gttccgactg atctccatct cctgcgatcc gaatttcatc tcctccattg 1020

acaatcacaa catgacggtc attgaaaccg atggtgtaaa cacgaaatct ttggacgtgg 1080

actcaatcca gatctttgcc ggtcaacgat attccttcgt ggtaggtcac ctttgtagac 1140

ccaaccttta cgatgttgtt aatgcattgt tttttttttc gcagttggaa gccaaccaat 1200

ccgtagcgaa ctattggatc cgagctcagc caaataatgg aatggatacc tcgttcagcg 1260

gcggcctcaa ctctgctata ctccggtatt ccggggcacc cgacgaggga cctcaaacca 1320

accagacgcc tagtaccgct ccgctcctgg aaactaacct ccatcctttg gagtctctac 1380

cagtagtatg tgtatatttc gggacttgat actattcata tattgatccc ttcacgcagc 1440

ccgggtcgcc tgtccctggc ggtgcagatc tcgttcacaa cttcactctt gcttttgtca 1500

gtttctttcg tccgtcacag ctgttgggca aaaaacctga ctgtaacttc tctagtcttc 1560

tggtcgattc tccattgatg gcacatcatg gatcatacct tcaaacttca cgctgcctgt 1620

cttgctccaa atcctcagtg gtcagaccga cgcccatcag ctcttacccc agggaagcat 1680

actggatgtt ggattcgacc aggtagttga acttgtcttc cctcccggta ccgcaatcga 1740

aggatcacat cccttccacc ttcacggggt gagttaagcc gtacatatcc tcctccgact 1800

acgctaacag cttatagcac aacttttggg tggttcgggg tgcgggatcc gatcagtaca 1860

acttcgatga tcccatcgtg cgtgatgtag tcagcatcgg caataactcg gacttggtca 1920

caattcgcta tgttgtacgt tatgttttat atatttgcat acagtgttta attctcactc 1980

atcgttcgac agacggacaa cgccggtcct tggttccttc actgccatat cgactggcat 2040

ctccagaccg gcttcggaat tgtgcttgcg gagggtataa accaaacagc ggctcataac 2100

cctgtgcctc gtaagtgttt tcctcgtata acctcatatt cacattctga atcattatac 2160

cacgtactag cggcctggga tcaactttgt tcgaagtact ctgcaactct tcctaccaca 2220

gccgctgttg ccgtcgcgac tgcagctcag accagtgcat catga 2265

<210> 2

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggcgtgg gtctactctc acttcttcct actaccatac tcgctgtcgg ggtcagtgct 60

gccattggcc ctatctccga tttgaatatc gtcaataaaa acattactgc tgacggcttt 120

gaaaggccca ctgtccttgc agggggcacc ttcccaggcc ctctcatcat tggaaacaag 180

ggtgacaatt tccaactgaa tgtcattgac cagctcgtcg atgaccgtat gttgactgcg 240

acctccatgc actggcatgg tctattccag aatgggacta attgggctga cggacctcca 300

ttcgtaacac agtgtcctat tgtagcgaat gactctttct tgtataattt cactgttcct 360

ggccaagccg gaacgttctg gtaccatagc catctggaga cccagtactg cgatggtctc 420

cggggtcctc ttgttgtgta tgatcctaac gacccaaaca aggacttgta tgacgttgac 480

aatgagacta ccgttatcac ccttgcagac tggtatcatg tactggcaca ggcggttgtc 540

ggtgctgcta taccggacag tacccttatc aatggtttgg gccgctctcc tggtaatctc 600

gatgccaacc tatcggtaat tactgttgag agcagtaaac gctaccggtt ccgactgatc 660

tccatctcct gcgatccgaa tttcatctcc tccattgaca atcacaacat gacggtcatt 720

gaaaccgatg gtgtaaacac gaaatctttg gacgtggact caatccagat ctttgccggt 780

caacgatatt ccttcgtgtt ggaagccaac caatccgtag cgaactattg gatccgagct 840

cagccaaata atggaatgga tacctcgttc agcggcggcc tcaactctgc tatactccgg 900

tattccgggg cacccgacga gggacctcaa accaaccaga cgcctagtac cgctccgctc 960

ctggaaacta acctccatcc tttggagtct ctaccagtac ccgggtcgcc tgtccctggc 1020

ggtgcagatc tcgttcacaa cttcactctt gctttttctt ctggtcgatt ctccattgat 1080

ggcacatcat ggatcatacc ttcaaacttc acgctgcctg tcttgctcca aatcctcagt 1140

ggtcagaccg acgcccatca gctcttaccc cagggaagca tactggatgt tggattcgac 1200

caggtagttg aacttgtctt ccctcccggt accgcaatcg aaggatcaca tcccttccac 1260

cttcacgggc acaacttttg ggtggttcgg ggtgcgggat ccgatcagta caacttcgat 1320

gatcccatcg tgcgtgatgt agtcagcatc ggcaataact cggacttggt cacaattcgc 1380

tatgttacgg acaacgccgg tccttggttc cttcactgcc atatcgactg gcatctccag 1440

accggcttcg gaattgtgct tgcggagggt ataaaccaaa cagcggctca taaccctgtg 1500

cctccggcct gggatcaact ttgttcgaag tactctgcaa ctcttcctac cacagccgct 1560

gttgccgtcg cgactgcagc tcagaccagt gcatcatga 1599

<210> 3

<211> 532

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gly Val Gly Leu Leu Ser Leu Leu Pro Thr Thr Ile Leu Ala Val

1 5 10 15

Gly Val Ser Ala Ala Ile Gly Pro Ile Ser Asp Leu Asn Ile Val Asn

20 25 30

Lys Asn Ile Thr Ala Asp Gly Phe Glu Arg Pro Thr Val Leu Ala Gly

35 40 45

Gly Thr Phe Pro Gly Pro Leu Ile Ile Gly Asn Lys Gly Asp Asn Phe

50 55 60

Gln Leu Asn Val Ile Asp Gln Leu Val Asp Asp Arg Met Leu Thr Ala

65 70 75 80

Thr Ser Met His Trp His Gly Leu Phe Gln Asn Gly Thr Asn Trp Ala

85 90 95

Asp Gly Pro Pro Phe Val Thr Gln Cys Pro Ile Val Ala Asn Asp Ser

100 105 110

Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Val Pro Gly Gln Ala Gly Thr Phe Trp Tyr

115 120 125

His Ser His Leu Glu Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro Leu

130 135 140

Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp Pro Asn Lys Asp Leu Tyr Asp Val Asp

145 150 155 160

Asn Glu Thr Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Val Leu Ala

165 170 175

Gln Ala Val Val Gly Ala Ala Ile Pro Asp Ser Thr Leu Ile Asn Gly

180 185 190

Leu Gly Arg Ser Pro Gly Asn Leu Asp Ala Asn Leu Ser Val Ile Thr

195 200 205

Val Glu Ser Ser Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Ile Ser Ile Ser Cys

210 215 220

Asp Pro Asn Phe Ile Ser Ser Ile Asp Asn His Asn Met Thr Val Ile

225 230 235 240

Glu Thr Asp Gly Val Asn Thr Lys Ser Leu Asp Val Asp Ser Ile Gln

245 250 255

Ile Phe Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Glu Ala Asn Gln Ser

260 265 270

Val Ala Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Gln Pro Asn Asn Gly Met Asp Thr

275 280 285

Ser Phe Ser Gly Gly Leu Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Ser Gly Ala

290 295 300

Pro Asp Glu Gly Pro Gln Thr Asn Gln Thr Pro Ser Thr Ala Pro Leu

305 310 315 320

Leu Glu Thr Asn Leu His Pro Leu Glu Ser Leu Pro Val Pro Gly Ser

325 330 335

Pro Val Pro Gly Gly Ala Asp Leu Val His Asn Phe Thr Leu Ala Phe

340 345 350

Ser Ser Gly Arg Phe Ser Ile Asp Gly Thr Ser Trp Ile Ile Pro Ser

355 360 365

Asn Phe Thr Leu Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Gln Thr Asp

370 375 380

Ala His Gln Leu Leu Pro Gln Gly Ser Ile Leu Asp Val Gly Phe Asp

385 390 395 400

Gln Val Val Glu Leu Val Phe Pro Pro Gly Thr Ala Ile Glu Gly Ser

405 410 415

His Pro Phe His Leu His Gly His Asn Phe Trp Val Val Arg Gly Ala

420 425 430

Gly Ser Asp Gln Tyr Asn Phe Asp Asp Pro Ile Val Arg Asp Val Val

435 440 445

Ser Ile Gly Asn Asn Ser Asp Leu Val Thr Ile Arg Tyr Val Thr Asp

450 455 460

Asn Ala Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Trp His Leu Gln

465 470 475 480

Thr Gly Phe Gly Ile Val Leu Ala Glu Gly Ile Asn Gln Thr Ala Ala

485 490 495

His Asn Pro Val Pro Pro Ala Trp Asp Gln Leu Cys Ser Lys Tyr Ser

500 505 510

Ala Thr Leu Pro Thr Thr Ala Ala Val Ala Val Ala Thr Ala Ala Gln

515 520 525

Thr Ser Ala Ser

530

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggcgtgg gtctactctc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcatgatgca ctggtctgag c 21

Claims (5)

1.一种耐热漆酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种编码权利要求1所述耐热漆酶的基因，其特征在于：所述的编码耐热漆酶的基因为Lac2，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述基因，其特征在于：所述基因全长序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种如权利要求2所述基因的克隆方法，其特征在于：提取包含Lac2基因的细胞的基因组DNA和总RNA，以总RNA为模板形成cDNA第一链；通过高通量测序得到转录组序列，获取漆酶基因序列信息，通过RT-PCR获得Lac2的cDNA序列，并以基因组DNA为模板，PCR扩增得到Lac2的基因序列。

5.一种权利要求1所述的耐热漆酶在降解孔雀石绿的应用。

Images