CN111690622B

CN111690622B - 一种真菌来源的漆酶g2589及其基因和应用

Info

Publication number: CN111690622B
Application number: CN202010740712.2A
Authority: CN
Inventors: 罗会颖; 张亨; 姚斌; 王亚茹; 黄火清; 柏映国; 苏小运; 王苑; 涂涛; 张�杰
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2040-07-29
Also published as: CN111690622A

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域。具体地，本发明涉及一种真菌来源的漆酶g2589及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。该漆酶具有以下几个优点：酸性、较高的反应温度、较好的温度稳定性及pH稳定性。所有这些优点都意味着该漆酶可用于饲料、食品、医药等行业。

Description

一种真菌来源的漆酶g2589及其基因和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域。具体地，本发明涉及一种真菌来源的漆酶g2589及其基因和应用。

背景技术

漆酶(laccase,p-diphenol:dioxygen oxidoreductases,EC 1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，属于木质素分解酶系。漆酶具有广泛的底物谱，能够催化2,6-二甲氧基苯酚（DMP），丁香醛（SGZ），愈创木酚等芳香族化合物；催化2,2-叠氮基-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HOBT）、N-羟基邻苯二甲酰亚胺（NHPI）等非酚性底物；更能再介体存在的情况下氧化更加复杂的底物。因其底物的广谱性及绿色的催化特性，在环保、造纸、纺织、食品等领域具有非常高的应用价值。

真菌漆酶的反应条件一般在温和条件下进行，其反应的最适温度范围较窄，通常在25-50℃之间。最适反应pH通常为3.5-6.0，如云芝栓孔菌所产漆酶的最适pH为3.8,多孔菌为4.2。在漆酶的生产过程中，不仅要保证漆酶的高活性，还要考虑漆酶的稳定性，多数真菌漆酶pH稳定性并不理想，如白腐真菌糙皮侧耳所产漆酶在pH为3.0的高酸性环境下活性较强,但漆酶稳定性较差；而pH呈中性至碱性时，漆酶稳定性较强但活性非常低。另外，关于耐高温特性的真菌漆酶报道较少，目前高温漆酶大多数为细菌漆酶。漆酶的生产是工业化应用的基础，发掘性质优良的漆酶并提高其活性，将是今后不断研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种漆酶。

本发明的再一目的是提供上述漆酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述漆酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述漆酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备漆酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述漆酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品、饲料、医药等行业中应用的新的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，该酶全长603个氨基酸，N端22个氨基酸为信号肽序列（ SEQ ID NO.2）。

因此，成熟的漆酶g2589的理论分子量为64 kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3：

该漆酶的最适pH为4.5，在pH 4.0-pH 4.5范围内，该酶能够维持其70%以上的酶活力；最适温度70℃，在75℃时具有30%以上的酶活力。

本发明还提供了编码上述漆酶的基因。DNA全序列分析结果表明，漆酶g2589结构基因全长为1812bp，含有2个内含子，本发明通过PCR的方法分离克隆了这个漆酶基因g2589，漆酶g2589的cDNA全长为1809bp，其序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，信号肽的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

因此，成熟漆酶的编码序列如SEQ ID NO.6所示。

该漆酶的理论分子量为64 kDa，通过BLAST发现该酶属于漆酶。该漆酶在氨基酸水平上与Aspergillus sclerotioniger CBS 115572来源的漆酶TILA最为相近，相似度仅为69%，确定g2589是一种新的漆酶。

本发明还提供了包含上述漆酶基因的重组载体，优选为pPIC9-g2589。将本发明的漆酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将漆酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaBI和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9- g2589。

本发明还提供了包含上述漆酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/ g2589。

本发明还提供了一种制备漆酶的方法，包括以下步骤：

1) 用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2) 培养重组菌株，诱导重组漆酶的表达；以及

3) 回收并纯化所表达的漆酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/ g2589。

本发明还提供了上述漆酶的应用，运用基因工程手段来产业化生产漆酶。

本发明从蓝状菌Talaromyces leycettanusJCM 12802菌株中得到了一个新的漆酶基因，其编码的漆酶具有以下几个优点：酸性、较高的反应温度、较好的温度稳定性及pH稳定性。所有这些优点都意味着该漆酶可用于饲料、食品、医药等行业。

附图说明

图 1 显示本发明漆酶的SDS-PAGE电泳分析结果；

图2显示本发明的重组漆酶的最适pH值；

图3显示本发明的重组漆酶的pH稳定性；

图4显示本发明的重组漆酶的最适反应温度；

图5显示本发明的重组漆酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB (126蛋白胨、0.5%酵母提取物、126 NaCL，pH7.O)。

(2) BMGY培养基；1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，0.000049< Biotin，1% 甘油(v/v)。

(3) BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J．萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1漆酶编码基因g2589的克隆

蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM 12802基因组DNA提取

将液体培养3天的菌，12,000 rpm离心10 min，收集的菌丝体加入已高温灭菌的研钵中，用液氮迅速研磨至粉末，然后将研磨好的菌体转移至一个新的，装有15 ml CTAB裂解液50 mL离心管中，轻柔上下倒置混匀，置于65°C水浴锅保温3 h，每隔20 min，上下倒置轻柔混匀一次，以便充分裂解菌体。4°C、12,000 rpm离心10 min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，室温放置5 min。4°C、12,000 rpm离心10 min。取上清再加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置5 min。4°C、12,000 rpm离心10 min。以便尽量除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下l0000 rpm离心l0 min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量dd H₂O溶解，置于-20℃备用。

设计克隆引物g2589F和g2589R，以Talaromyces leycettanus JCM 12802基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：PCR反应参数为： 95°C 5 min; 94°C 30 sec,60°C 30 sec, 72°C 2 min, 35个循环，72°C 10 min。得到一约2000 bp片段，将该片段回收后送测序。

表1 本实验所需的引物

引物名称	引物序列(5'---3')	引物长度(bp)
			g2589F	GAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAAGTAGCCAGCTCGTCAGATCTAC	48
g2589R	GTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAAACGGCTAAGGAAGAAGCCAG	51

实施例2 漆酶cDNA的获得

提取Talaromyces leycettanus JCM 12802总RNA，利用Oligo (dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物g2589F和g2589R（见表1），扩增该单链cDNA，获得漆酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送睿博生物技术有限公司测序。

通过对漆酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有2个内含子， cDNA长1809bp，编码603个氨基酸，N端22个氨基酸为其信号肽序列，经Blast比对证明从Talaromyces leycettanus中分离克隆得到的编码漆酶的基因为新基因。

实施例3漆酶工程菌株的构建

（1）表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的漆酶g2589的cDNA为模板，设计合成了带有SnaB I 和 Not I限制性酶切位点的引物F和R（见表1），对g2589的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用SnaB I 和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9 (Invitrogen, San Diego)，漆酶g2589成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-g2589，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶DraI进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30°C培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

（2）高漆酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将 MD平板置于30°C培养箱中培养1~2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3 mL BMGY培养基的离心管中，30°C、220 rpm摇床培养48h；将摇床培养48 h的菌液3,000×g离心15 min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5%甲醇,0.1 mM CuSO₄的BMMY培养基，在30°C、220 rpm诱导培养；诱导培养48 h后，3,000×g离心5 min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高漆酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样的方法构建包含信号肽序列的重组表达载体，并转化宿主细胞。

实施例4重组漆酶的制备

（1）漆酶基因g2589在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300 mL BMGY液体培养基的1 L三角瓶中，30°C，220 rpm摇床振荡培养48 h；5,000 rpm离心5 min，轻柔弃上清，再向菌体加入200 mL含有0.5%甲醇,0.1 mM CuSO₄的BMMY液体培养基，30°C，220 rpm诱导培养72 h。诱导培养期间，间隔24 h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5%左右；(3) 12,000×g离心10 min，收集上清发酵液。检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

（2）重组漆酶的纯化

收集摇瓶表达的重组漆酶上清液，通过10 kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10 kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组漆酶g2589，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取漆酶g2589浓缩液2.0 mL经预先用20 mMTris-HCl (pH 8.0)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL 阴离子柱，然后用1 mol/L 的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析（图1）。泳道1为脱糖处理后的条带，26 KDa的条带为Endo H的标准条带。泳道2为未处理的漆酶条带。酵母表达纯化的漆酶有一定的糖基化，经脱糖处理后大小约为65 KDa，与理论分子量64 KDa相同，为所需要的漆酶。

实施例5重组漆酶部分性质分析

采用以ABTS(ε420＝36000M-1.cm-1)为底物，三氯乙酸终止法对本发明的漆酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 4.5，70°C条件下，2 mL的反应体系包括100 µL适当的稀释酶液，200 µL底物，反应5 min，加入0.5 mL 三氯乙酸（0.4mol/L）终止反应，冷却后420nm测定OD值。漆酶活性单位定义：在一定条件下，以1 min内催化氧化1μmolABTS的量为1个酶活单位(U)。

（1）漆酶g2589的最适pH及pH稳定性

经纯化的(实施例4)表达的漆酶g2589在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0 甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～l0.0是Tris-HCl系列缓冲液。纯化的漆酶g2589在不同pH的缓冲体系．70°C下测定的最适pH结果（图2）表明：漆酶g2589的最适pH为4.5，在pH4-4.5范围内，该酶能够维持其90%以上的酶活力。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37°C下处理60 min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图3），分析结果表明pH3.0-pH5.0, pH7.0-pH11.0之间能够维持80%以上的酶活力，pH6.0时有70%的酶活力。说明该酶具有优良的pH稳定性。

（2）漆酶g2589反应最适温度及热稳定性

纯化的漆酶在pH 4.5条件下，测定不同温度（30-80℃）下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为70℃，在65℃时依然具有90%以上的酶活力（图4）。耐温性测定为漆酶在不同温度下处理不同时间，再在70°C下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该漆酶在60、65、70℃下处理10min，剩余酶活在80%以上，即使该酶在65℃下处理1h，依然能够保持50%的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性（图5）。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种真菌来源的漆酶g2589及其基因和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 603

<212> PRT

<213> 蓝状菌(Talaromyces leycettanus)

<400> 1

Met Lys Thr Ser Leu Ser Gly Leu Thr Leu Leu Ala Leu Leu Cys Leu

1 5 10 15

Thr Gln Trp Ala His Gly Ser Ser Gln Leu Val Arg Ser Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Arg Phe Glu Ile Thr Leu Thr Trp Glu Asp Trp Ala Pro Ala

35 40 45

Gly Thr Ala Arg Lys Met Ile Leu Thr Asn Gly Gln Phe Pro Ala Pro

50 55 60

Thr Leu His Leu Lys Gln Gly Asp Asn Val Glu Phe Leu Val Thr Asn

65 70 75 80

Leu Leu Pro Phe Lys Thr Ser Val His Phe His Gly Ile Asp Gln Val

85 90 95

Asp Thr Pro Trp Ser Asp Gly Val Pro Gly Leu Ser Gln Arg Pro Ile

100 105 110

Glu Pro Gly Ser Val Phe Leu Tyr Lys Trp Lys Ala Thr Gln Tyr Gly

115 120 125

Ser Tyr Phe Tyr His Ala His Ser Arg Gly Gln Ile Glu Asp Gly Leu

130 135 140

Tyr Gly Ala Ile Tyr Ile Glu Pro Asp Asp Ser Val Glu Lys Pro Phe

145 150 155 160

His Met Ile Thr Gly Asn Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Leu Arg Ala

165 170 175

Glu Lys Ser Thr Thr Pro Ile Ile Leu Ser Asp Trp Arg Tyr Leu Thr

180 185 190

Ser Glu Gln Val Trp Asn Ala Glu Glu Ala Ser Gly Phe Asp Ala Tyr

195 200 205

Cys Val Asn Ala Leu Leu Ile Asn Gly Lys Gly Ser Val Asp Cys Leu

210 215 220

Pro Gln Asp Val Ile Asp Ala Phe Thr Asn Pro Ala Gln Lys Gln Val

225 230 235 240

Leu Asn Gly Ala Ser Leu Thr Asp Thr Gly Cys Leu Pro Pro Thr Thr

245 250 255

Arg Pro Ala Gln Gly Asp Phe Pro His Asn Phe Ser Ala Val Pro Pro

260 265 270

Thr Met Phe Ser Gly Cys Thr Pro Ser Arg Gly Pro Thr Glu Val Leu

275 280 285

Lys Val Asp Pro Arg Ala Gly Tyr Val Ser Tyr Asp Leu Ile Ser Thr

290 295 300

Ala Gly Val Ser Met Leu Thr Phe Ser Ile Asp Asp His Pro Met Tyr

305 310 315 320

Val Tyr Ala Ile Asp Gly Arg Tyr Ile Glu Pro Thr Leu Val Asp Ala

325 330 335

Ile Thr Ile Ala Asn Gly Asn Arg Tyr Ser Val Leu Val Lys Leu Asp

340 345 350

Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Thr Ile Arg Met Ala Asn Thr Gly Leu Asn

355 360 365

Gln Leu Val Tyr Thr Thr Ala Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Leu Glu

370 375 380

Thr Lys Arg Lys Pro Ser Val Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Gly Thr Asn

385 390 395 400

Thr Thr Ala Asp Thr Ile Phe Leu Asp Glu Ala Lys Ile Val Pro Phe

405 410 415

Pro Val Glu Ala Pro Ala Leu Asp Val Ala Gln Thr Phe Ile Leu Lys

420 425 430

Val Gly Arg Tyr Asn Ala Ser Tyr Arg Trp Thr Leu Gly Asn Ser Ser

435 440 445

Phe Pro Leu Ser Leu Glu Glu Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asn Arg Ser

450 455 460

Ala Asp Pro Lys Asp Leu Thr Ile Gln Thr Leu Asn Gly Thr Trp Val

465 470 475 480

Asp Ile Ile Val Asn Ala Ala Thr Pro Gln Pro Pro His Pro Ile His

485 490 495

Lys His Ser Asn Lys Phe Phe Val Ile Gly Arg Gly Asn Gly Ala Trp

500 505 510

Ser Tyr Ser Ser Val Ala Glu Ala Met Asn Tyr Ile Pro Glu Asn Phe

515 520 525

Asn Phe Gln Asn Pro Gln Ile Arg Asp Thr Phe Pro Thr Leu Pro Ala

530 535 540

Val Thr Gly Pro Thr Trp Met Ala Ile Arg Tyr Gln Val Val Asn Pro

545 550 555 560

Gly Ala Phe Leu Leu His Cys His Ile Gln Val His Leu Ser Gly Gly

565 570 575

Met Ala Leu Ala Ile Leu Asp Gly Val Asp Glu Trp Pro Glu Ile Pro

580 585 590

Glu Glu Tyr Gln Leu Ala Ser Ser Leu Ala Val

595 600

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 蓝状菌(Talaromyces leycettanus)

<400> 2

Met Lys Thr Ser Leu Ser Gly Leu Thr Leu Leu Ala Leu Leu Cys Leu

1 5 10 15

Thr Gln Trp Ala His Gly

20

<210> 3

<211> 581

<212> PRT

<213> 蓝状菌(Talaromyces leycettanus)

<400> 3

Ser Ser Gln Leu Val Arg Ser Thr Gly Asn Thr Val Arg Phe Glu Ile

1 5 10 15

Thr Leu Thr Trp Glu Asp Trp Ala Pro Ala Gly Thr Ala Arg Lys Met

20 25 30

Ile Leu Thr Asn Gly Gln Phe Pro Ala Pro Thr Leu His Leu Lys Gln

35 40 45

Gly Asp Asn Val Glu Phe Leu Val Thr Asn Leu Leu Pro Phe Lys Thr

50 55 60

Ser Val His Phe His Gly Ile Asp Gln Val Asp Thr Pro Trp Ser Asp

65 70 75 80

Gly Val Pro Gly Leu Ser Gln Arg Pro Ile Glu Pro Gly Ser Val Phe

85 90 95

Leu Tyr Lys Trp Lys Ala Thr Gln Tyr Gly Ser Tyr Phe Tyr His Ala

100 105 110

His Ser Arg Gly Gln Ile Glu Asp Gly Leu Tyr Gly Ala Ile Tyr Ile

115 120 125

Glu Pro Asp Asp Ser Val Glu Lys Pro Phe His Met Ile Thr Gly Asn

130 135 140

Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Leu Arg Ala Glu Lys Ser Thr Thr Pro

145 150 155 160

Ile Ile Leu Ser Asp Trp Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Gln Val Trp Asn

165 170 175

Ala Glu Glu Ala Ser Gly Phe Asp Ala Tyr Cys Val Asn Ala Leu Leu

180 185 190

Ile Asn Gly Lys Gly Ser Val Asp Cys Leu Pro Gln Asp Val Ile Asp

195 200 205

Ala Phe Thr Asn Pro Ala Gln Lys Gln Val Leu Asn Gly Ala Ser Leu

210 215 220

Thr Asp Thr Gly Cys Leu Pro Pro Thr Thr Arg Pro Ala Gln Gly Asp

225 230 235 240

Phe Pro His Asn Phe Ser Ala Val Pro Pro Thr Met Phe Ser Gly Cys

245 250 255

Thr Pro Ser Arg Gly Pro Thr Glu Val Leu Lys Val Asp Pro Arg Ala

260 265 270

Gly Tyr Val Ser Tyr Asp Leu Ile Ser Thr Ala Gly Val Ser Met Leu

275 280 285

Thr Phe Ser Ile Asp Asp His Pro Met Tyr Val Tyr Ala Ile Asp Gly

290 295 300

Arg Tyr Ile Glu Pro Thr Leu Val Asp Ala Ile Thr Ile Ala Asn Gly

305 310 315 320

Asn Arg Tyr Ser Val Leu Val Lys Leu Asp Lys Pro Ala Asp Asp Tyr

325 330 335

Thr Ile Arg Met Ala Asn Thr Gly Leu Asn Gln Leu Val Tyr Thr Thr

340 345 350

Ala Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Leu Glu Thr Lys Arg Lys Pro Ser

355 360 365

Val Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Gly Thr Asn Thr Thr Ala Asp Thr Ile

370 375 380

Phe Leu Asp Glu Ala Lys Ile Val Pro Phe Pro Val Glu Ala Pro Ala

385 390 395 400

Leu Asp Val Ala Gln Thr Phe Ile Leu Lys Val Gly Arg Tyr Asn Ala

405 410 415

Ser Tyr Arg Trp Thr Leu Gly Asn Ser Ser Phe Pro Leu Ser Leu Glu

420 425 430

Glu Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asn Arg Ser Ala Asp Pro Lys Asp Leu

435 440 445

Thr Ile Gln Thr Leu Asn Gly Thr Trp Val Asp Ile Ile Val Asn Ala

450 455 460

Ala Thr Pro Gln Pro Pro His Pro Ile His Lys His Ser Asn Lys Phe

465 470 475 480

Phe Val Ile Gly Arg Gly Asn Gly Ala Trp Ser Tyr Ser Ser Val Ala

485 490 495

Glu Ala Met Asn Tyr Ile Pro Glu Asn Phe Asn Phe Gln Asn Pro Gln

500 505 510

Ile Arg Asp Thr Phe Pro Thr Leu Pro Ala Val Thr Gly Pro Thr Trp

515 520 525

Met Ala Ile Arg Tyr Gln Val Val Asn Pro Gly Ala Phe Leu Leu His

530 535 540

Cys His Ile Gln Val His Leu Ser Gly Gly Met Ala Leu Ala Ile Leu

545 550 555 560

Asp Gly Val Asp Glu Trp Pro Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Gln Leu Ala

565 570 575

Ser Ser Leu Ala Val

580

<210> 4

<211> 1809

<212> DNA

<213> 蓝状菌(Talaromyces leycettanus)

<400> 4

atgaagacct cactcagtgg gttgacctta ctggcgttgc tgtgccttac gcagtgggca 60

cacggcagta gccagctcgt cagatctacc ggcaacaccg tgcggtttga gatcactttg 120

acatgggaag attgggctcc tgctggcact gccaggaaga tgattttaac aaatggccag 180

ttcccggccc cgacattgca cttgaagcaa ggagataacg ttgaattttt ggttaccaat 240

ttgcttccat ttaagacaag cgtccacttt cacggcattg atcaagtgga cacaccgtgg 300

tcagatggtg ttcctggtct gtcacagcgg ccaattgagc ctggttccgt gttcctctac 360

aaatggaaag caacgcagta tggaagctac ttctatcatg cccacagcag gggccagatt 420

gaagacggtc tttacggagc catatacatt gaacccgatg attcggttga gaagcctttt 480

cacatgatca caggcaattc aagcgaacta gacgcgatgt tgagggcgga gaagagcaca 540

accccgatca tactttcaga ttggcgttac ttgacctcgg agcaagtgtg gaatgctgag 600

gaggcaagcg ggtttgatgc atattgcgtt aatgcgcttt tgatcaacgg caaaggctct 660

gtcgactgtc tgcctcagga cgtgattgat gcatttacaa atccggctca aaagcaagtg 720

ctcaatggtg ctagtcttac agatacagga tgcctgcctc ctaccacgag gcctgcccag 780

ggagactttc ctcacaactt tagtgccgtt ccaccaacta tgttttctgg ctgcacgccg 840

tctcgaggcc caacagaagt gcttaaagtt gacccacgtg ctggttacgt gagctacgat 900

ctgatcagca cagctggcgt gtcgatgctc accttctcga tcgacgatca tccaatgtac 960

gtctatgcca tcgacgggag gtatattgaa cccactcttg tcgatgccat cacgatagcc 1020

aacgggaacc gttactcggt gctggtgaag ctcgacaagc cagcggatga ttatacgatt 1080

cgtatggcga acaccggtct caaccagctt gtgtatacca cggcaagctt gtcgtacaac 1140

agtctacttg agacgaaaag aaagccctct gtcccgtaca tcgacatcac cggcacaaat 1200

actaccgccg ataccatctt cctggatgaa gcgaaaatcg ttccgttccc tgttgaagct 1260

ccagctcttg atgttgctca gactttcatt ttgaaagttg gccgttacaa cgcttcatac 1320

cgctggacat taggcaactc tagcttccca ttgtccctag aggagactac cccactactc 1380

ttcaaccgct ccgcagaccc caaagacctt accatccaaa ccctcaacgg gacctgggtt 1440

gacattattg tcaatgctgc aactccccag ccacctcatc cgatccataa acactcgaat 1500

aagttcttcg tcatcggccg gggcaacgga gcatggagct actcctccgt ggcggaggct 1560

atgaactaca ttcccgagaa tttcaatttt cagaacccgc agatcaggga tacatttccc 1620

acacttcctg cggtgacagg acctacttgg atggccatca ggtaccaggt cgtcaaccct 1680

ggggcatttt tgctccattg tcacattcag gtgcatctta gtggcggtat ggccctggct 1740

attcttgacg gtgttgacga atggccggag attccggagg agtatcaact ggcttcttcc 1800

ttagccgtt 1809

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 蓝状菌(Talaromyces leycettanus)

<400> 5

atgaagacct cactcagtgg gttgacctta ctggcgttgc tgtgccttac gcagtgggca 60

cacggc 66

<210> 6

<211> 1743

<212> DNA

<213> 蓝状菌(Talaromyces leycettanus)

<400> 6

agtagccagc tcgtcagatc taccggcaac accgtgcggt ttgagatcac tttgacatgg 60

gaagattggg ctcctgctgg cactgccagg aagatgattt taacaaatgg ccagttcccg 120

gccccgacat tgcacttgaa gcaaggagat aacgttgaat ttttggttac caatttgctt 180

ccatttaaga caagcgtcca ctttcacggc attgatcaag tggacacacc gtggtcagat 240

ggtgttcctg gtctgtcaca gcggccaatt gagcctggtt ccgtgttcct ctacaaatgg 300

aaagcaacgc agtatggaag ctacttctat catgcccaca gcaggggcca gattgaagac 360

ggtctttacg gagccatata cattgaaccc gatgattcgg ttgagaagcc ttttcacatg 420

atcacaggca attcaagcga actagacgcg atgttgaggg cggagaagag cacaaccccg 480

atcatacttt cagattggcg ttacttgacc tcggagcaag tgtggaatgc tgaggaggca 540

agcgggtttg atgcatattg cgttaatgcg cttttgatca acggcaaagg ctctgtcgac 600

tgtctgcctc aggacgtgat tgatgcattt acaaatccgg ctcaaaagca agtgctcaat 660

ggtgctagtc ttacagatac aggatgcctg cctcctacca cgaggcctgc ccagggagac 720

tttcctcaca actttagtgc cgttccacca actatgtttt ctggctgcac gccgtctcga 780

ggcccaacag aagtgcttaa agttgaccca cgtgctggtt acgtgagcta cgatctgatc 840

agcacagctg gcgtgtcgat gctcaccttc tcgatcgacg atcatccaat gtacgtctat 900

gccatcgacg ggaggtatat tgaacccact cttgtcgatg ccatcacgat agccaacggg 960

aaccgttact cggtgctggt gaagctcgac aagccagcgg atgattatac gattcgtatg 1020

gcgaacaccg gtctcaacca gcttgtgtat accacggcaa gcttgtcgta caacagtcta 1080

cttgagacga aaagaaagcc ctctgtcccg tacatcgaca tcaccggcac aaatactacc 1140

gccgatacca tcttcctgga tgaagcgaaa atcgttccgt tccctgttga agctccagct 1200

cttgatgttg ctcagacttt cattttgaaa gttggccgtt acaacgcttc ataccgctgg 1260

acattaggca actctagctt cccattgtcc ctagaggaga ctaccccact actcttcaac 1320

cgctccgcag accccaaaga ccttaccatc caaaccctca acgggacctg ggttgacatt 1380

attgtcaatg ctgcaactcc ccagccacct catccgatcc ataaacactc gaataagttc 1440

ttcgtcatcg gccggggcaa cggagcatgg agctactcct ccgtggcgga ggctatgaac 1500

tacattcccg agaatttcaa ttttcagaac ccgcagatca gggatacatt tcccacactt 1560

cctgcggtga caggacctac ttggatggcc atcaggtacc aggtcgtcaa ccctggggca 1620

tttttgctcc attgtcacat tcaggtgcat cttagtggcg gtatggccct ggctattctt 1680

gacggtgttg acgaatggcc ggagattccg gaggagtatc aactggcttc ttccttagcc 1740

gtt 1743

Claims

1.一种漆酶g2589，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

2.一种漆酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的漆酶g2589。

3.根据权利要求2所述的漆酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQID NO.6所示。

4.包含权利要求2所述漆酶基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述漆酶基因的重组菌株。

6.一种制备漆酶g2589的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞；

（3）分离纯化获得漆酶g2589。