CN103459594A

CN103459594A - 具有提高的表达和/或活性的漆酶变体

Info

Publication number: CN103459594A
Application number: CN2012800134039A
Authority: CN
Inventors: H·王; M·沃德
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2012-03-20
Publication date: 2013-12-18
Also published as: EP2694647A1; US20140123404A1; WO2012138474A1

Abstract

本发明的组合物、方法和系统涉及与参考亲本漆酶相比显示提高的表达和/或活性的变体漆酶。所述变体漆酶包括影响糖基化、表面电荷或者表面疏水性而导致改进的酶表达和/或酶活性的突变。

Description

具有提高的表达和/或活性的漆酶变体

优先权

本申请要求2011年4月6日提交的美国临时申请系列号61/472,568的优先权，将该临时申请以引用方式整体并入本文。

技术领域

本发明的组合物、方法和系统涉及与参考亲本漆酶相比显示提高的表达和/或活性的变体漆酶。所述变体酶包括影响糖基化、表面电荷或者表面疏水性而导致改进的酶表达和/或酶活性的突变。

背景技术

漆酶是含铜酚氧化酶，已知在存在氧气的情况下是良好的氧化剂。漆酶存在于微生物、真菌和高等生物中。漆酶可用于多种应用，包括纸浆和纸张漂白、纸浆废水处理、脱墨、工业脱色、衣物洗涤剂中的漂白、口腔护理牙齿增白剂、作为聚合和氧化反应的催化剂或促进剂。

漆酶在许多工业中被广泛应用，包括洗涤剂工业、纸张和纸浆工业、纺织工业和食品工业。在一个应用中，酚氧化酶用作在洗涤剂清洗时从衣服上去除污渍（如食物污渍）的助剂。大多数漆酶在酸性pH范围内显示最佳pH，而在中性或者碱性pH下无活性。

已知的是漆酶由多种真菌产生，所述真菌包括曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、足孢子菌属(Podospora)、葡萄孢属(Botrytis)、侧耳属(Pleurotus)、层孔菌属(Fornes)、白腐菌属(Phlebia)、栓菌属(Trametes)、多孔属(Polyporus)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、丝核菌属(Rhizoctonia)、双极霉属(Bipolaris)、弯孢属(Curvularia)、壳单孢属(Amerosporium)、香菇属(Lentinus)、毁丝霉属(Myceliophtora)、鬼伞属(Coprinus)、草根霉属(Thielavia)、齿毛菌属(Cerrena)、链霉菌属(Streptomyces)和黑果菌属(Melanocarpus)物种。对于许多应用，漆酶的氧化效率可通过使用介质（也称为增强剂）来提高。

尽管有大量的微生物表达系统，但漆酶难以在培养物中高水平表达。具有高比活性的漆酶可能特别难以表达，在一些情况中表达水平小于1g/L，这对它们的大规模生产造成妨碍。

发明内容

本文描述组合物、方法和系统，它们涉及与参考亲本漆酶相比显示提高的表达和/或活性的变体漆酶。

在一个方面，提供衍生自亲本漆酶的变体漆酶，所述变体漆酶：(a)在与氨基酸序列SEQ ID NO:11第68位对应的位置处具有突变；(b)具有改变亲本漆酶的表面电荷的突变；(c)具有改变亲本漆酶的表面疏水性的突变；和/或(d)在与位于亲本漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基对应的氨基酸位置处具有突变；其中所述突变是置换成相对于所述亲本漆酶而言另一不同的氨基酸残基。

在一些实施例中，变体漆酶在与氨基酸序列SEQ ID NO:11第68位对应的位置处具有突变，其中所述突变是芳族氨基酸残基置换成非芳族氨基酸残基。在一些实施例中，所述突变是芳族氨基酸残基置换成脂族氨基酸残基。在一些实施例中，所述突变是芳族氨基酸残基置换成A、V、L或者I。在一些实施例中，所述突变相当于SEQ ID NO:11中的F68L。

在一些实施例中，变体漆酶具有改变亲本漆酶的表面电荷或者改变表面疏水性的突变，其中所述突变位于与SEQ ID NO:11中的第130、265、287、293位或者319位相当的位置处。

在一些实施例中，变体漆酶具有改变亲本漆酶的表面电荷或者改变表面疏水性的突变，其中所述突变位于与SEQ ID NO:11中的第130位相当的位置处。

在一些实施例中，变体漆酶具有改变亲本漆酶的表面电荷或者改变表面疏水性的突变，其中所述突变位于：(a)与SEQ ID NO:11中第130位相当的氨基酸位置处，其中亲本漆酶中的该残基被选自D、E、R和K的另一不同的残基置换；(b)与SEQ ID NO:11中第265位相当的氨基酸位置处，其中亲本漆酶中的该残基被选自R、H和V的另一不同的残基置换；(c)与SEQ ID NO:11中第287位相当的氨基酸位置处，其中亲本漆酶中的该残基被选自P、H和G的另一不同的残基置换；(d)与SEQ ID NO:11中第293位相当的氨基酸位置处，其中亲本漆酶中的该残基被选自N、T和S的另一不同的残基置换；和/或(e)与SEQ ID NO:11中第319位相当的氨基酸位置处，其中亲本漆酶中的该残基被选自W、T和S的另一不同的残基置换。

在一些实施例中，变体漆酶具有的突变相当于SEQ ID NO:11中的：(a)I265R/V287G；(b)I265R/V293T；(c)I265R/V319T；(d)I265R/V287G/V319T；(e)I265R/V287G/V293T/V319T；(f)I265R/V287P；(g)I265R/N335R；(h)I265R/N130E；(i)F68L/I265R；(j)F68L/I265R/V287G；(k)F68L/I265R/V293T；(l)F68L/I265R/V319T；(m)F68L/I265R/V287G/V319T；(n)F68L/I265R/V287G/V293T/V319T；(o)F68L/I265R/V287P；(p)F68L/I265R/N335R；或者(q)F68L/I265R/N130E；。

在一些实施例中，亲本漆酶可获自齿毛菌属(Cerrena)物种。在一些实施例中，亲本漆酶可获自一色齿毛菌(Cerrena unicolor)。在一些实施例中，亲本漆酶是来自一色齿毛菌的漆酶D。

在一些实施例中，亲本漆酶具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28。

在一些实施例中，本文描述的任何变体漆酶具有与氨基酸序列SEQID NO:11至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文描述的任何变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文描述的任何变体漆酶具有与氨基酸序列SEQID NO:11至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文描述的任何变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文描述的任何变体漆酶具有与氨基酸序列SEQID NO:11至少96%、至少97%、至少98%或者甚至至少99%同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文描述的任何变体漆酶还包含将糖基化位点引入到亲本漆酶的氨基酸序列中的突变。

在另一方面，提供包含本文描述的任何变体漆酶中的一者或者多者的组合物。在一些实施例中，组合物还包含化学介质。在一些实施例中，化学介质是酚类化合物。在一些实施例中，化学介质是选自以下的酚类化合物：丁香腈(syringonitrile)、乙酰丁香酮和丁香酸甲酯。

在另一个方面，提供对表面进行漂白的方法，所述方法包括使表面与包含本文描述的任何变体漆酶中的一者或者多者的组合物接触。

由说明书（包括附图），本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施方案将显而易见。

附图说明

图1提供了说明从quad缺失衍生菌株衍生MAD6宿主菌株的示意图。

图2提供了里氏木霉(T.reesei)ku80缺失盒的示意图。

图3提供了用于制备Archy2菌株的pyr2缺失盒的示意图。

图4提供了用于制备Archy3菌株的hygR缺失盒的示意图。

图5柱状图显示了用编码七个不同漆酶糖基化变体（mut1至mut7）之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图6柱状图显示了用编码五个不同漆酶负电荷变体（S1至S5）之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图7柱状图显示了用编码四个不同漆酶正电荷变体（S7至S10）之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图8是十三个位置265变体的列表。

图9柱状图显示了用编码从SEL1文库获得的88个独立漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。最左边的线(ABST≈400)为野生型对照。

图10柱状图显示了用编码表现出提高的表达或者活性的六个位置265漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图11柱状图示出用编码从SEL2文库获得的88个独立漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。最左边的线(ABST≈200)为野生型对照。

图12柱状图示出用编码四个不同漆酶位置287变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图13是十三个位置319变体的列表。

图14柱状图示出用编码从SEL3文库获得的65个独立漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。最左边的线(ABST≈270)为野生型对照。

图15柱状图示出用编码四个不同漆酶位置319变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图16柱状图示出用编码从SEL4文库获得的十六个独立漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。最左边的线(ABST≈320)为野生型对照。

图17柱状图示出用编码五个不同漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图18柱状图示出用编码六个不同漆酶变体之一的载体转化的丝状真菌中的漆酶活性。

图19柱状图显示了用编码野生型（克隆“42”）漆酶或者F68L/I265R变体漆酶（克隆“67”）的载体转化并在摇瓶中培养的丝状真菌中的漆酶活性。

图20是多种齿毛菌属(Cerrena)漆酶的氨基酸序列的比对。信号序列以斜体显示。

图21是来自不同生物体的多种漆酶的氨基酸序列的比对。

图22是氨基酸序列，显示了了齿毛菌属(Cerrena)漆酶D氨基酸序列(SEQ ID NO:11)上的多个N-糖基化突变（粗体）、表面电荷突变（粗体、下划线）、非保守疏水残基突变（粗体、下划线）的相对位置。

具体实施方式

I.综述

本文描述组合物、方法和系统，它们涉及与参考亲本漆酶相比显示了提高的表达和/或活性的变体漆酶。变体漆酶包括影响糖基化、改变表面电荷、改变表面疏水性或者以别的方式改变变体漆酶的生化性质而改进酶表达和/或酶活性的突变。将对变体漆酶的各种特征和实施例以及其应用进行描述。

II.定义

除非在本文中另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY)，第2版，约翰·威利父子出版公司，纽约，(1994)；以及Hale和Marham，《哈珀·柯林斯生物学词典》(THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY)，Harper Perennial出版社，纽约，(1991)提供了本文所用的多个术语的通用词典。为了更清楚起见，定义了以下术语。

本文所用的术语“酶”是指催化化学反应的蛋白质。酶的催化功能构成其“酶活性”或“活性”。酶通常根据其催化的反应类型如酚的氧化、肽键的水解、核苷酸的掺入等进行分类。

本文所用的术语“底物”是指酶对其执行催化活性以生成产物的物质（如化合物）。

本文所用的“漆酶”是通过夺取单电子、同时伴随四电子转移过程中氧气还原为水而催化酚、多酚和苯胺的氧化的含多铜的氧化酶(EC1.10.3.2)。

本文所用的“漆酶活性”（或者“漆酶比活性”）以单位/克(U/g)量度，其中一个单位定义为在基于漆酶将2,2′-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸；ABTS)底物氧化为其相应的稳定阳离子根（即ABTS⁺）的能力的测定法的条件下，每秒钟氧化1nmol的ABTS所需的漆酶活性的量。与初始形式的ABST不同的是，该根形式为深绿色，在420nm处的吸光度增加。绿色形成物的量与漆酶活性的量成比例，并且可与漆酶标准曲线进行比较来确定漆酶活性的绝对量。

本文在漆酶表达提高的上下文中所用的“表达”，指在培养的细胞中产生活性漆酶分子。

本文所用的“变体”蛋白质涵盖通过少量氨基酸置换、插入和/或缺失而不同于亲本/参考蛋白质的相关和衍生蛋白质。在一些实施例中，不同的氨基酸残基数为约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45、或50中的任何数字。在一些实施例中，变体的差异为约1至约10个氨基酸残基。在一些实施例中，变体蛋白质与亲本/参考蛋白质具有至少约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至99.5%的氨基酸序列同一性。

本文所用的术语“类似序列”是指蛋白质内的提供相对于亲本/参考蛋白质内的序列而言相似的功能、三级结构和/或保守残基的多肽序列。例如，在包含α螺旋或β折叠结构的结构区域中，类似序列中的置换氨基酸残基保持相同的结构特征。在一些实施例中，类似序列产生的变体蛋白质表现出相对于变体从其衍生而来的亲本蛋白质相似的或改善的功能。

本文所用的“同源蛋白质”或“同系物”是指与参考蛋白质（如来自不同来源的漆酶）具有相似功能（如酶活性）和/或结构的蛋白质（如漆酶）。同系物可从相关的或不相关的物种进化。在一些实施例中，同系物具有与参考蛋白质类似的四级、三级和/或一级结构，从而可能允许参考蛋白质中的区段或片段被同系物类似的区段或片段置换，这与该区段或片段被非同源蛋白质的序列置换相比，减少了对参考蛋白质的结构和/或功能的破坏。

本文所用的“野生型”、“天然的”和“天然存在的”蛋白质是存在于自然界中的那些蛋白质。术语“野生型序列”是指存在于自然界的或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施例中，野生型序列是蛋白质工程项目（例如制备变体蛋白质）的起点。

本文所用的“信号序列”是指结合至蛋白质的N端部分，并且促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

本文所用的术语“衍生物”是指这样的蛋白质，其通过将一个或多个氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点处置换一个或多个氨基酸残基、在该蛋白质的一端或两端或氨基酸序列中的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸残基、和/或在该氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍生自亲本/参考蛋白质。蛋白质衍生物的制备通常通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将DNA序列转到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生的蛋白质来实现。

本文所用的术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指由氨基酸（即，氨基酸残基）构成的组合物。使用氨基酸残基的常规单字母代码或三字母代码。多肽可为直链的或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可间夹有非氨基酸。所述术语还涵盖天然改性或通过干预改性的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或改性，如与标记组分缀合。在所述定义中还包括（例如）包含一个或多个氨基酸（包括，例如非天然氨基酸等）类似物的多肽，以及本领域中已知的其他修改形式。

本文所用的“保守氨基酸残基”指在不同漆酶的相当位置处（基于氨基酸序列比对）相同的残基。相反，“非保守氨基酸残基”指在不同漆酶的相当位置处（基于氨基酸序列比对）不相同的残基。举例来说，如果许多漆酶在位置X处具有丙氨酸，则丙氨酸是位置X处的保守残基。如果不同的漆酶在位置Y处具有不同的氨基酸，则在位置Y处有许多非保守残基。

本文所用的“相当”氨基酸位置/残基，是通过氨基酸序列比对所确定的在不同漆酶当中结构上保守的那些氨基酸位置/残基。这种位置/残基可容易地用多种氨基酸序列比对程序中的任何一种来确定，然后确定哪些位置/残基在不同的分子中“对齐(line-up)”。词语“与......相当”和“与......对应”可互换使用。

本文所用的术语“纺织物”是指纤维、纱线、织物、衣服和非织造材料。该术语涵盖由天然和合成（如人造的）材料、以及天然和合成的共混物制成的纺织物。术语“纺织物”是指未经加工和经加工的纤维、纱线、梭织或针织织物、非织物和衣物。在一些实施例中，纺织物包含纤维素。

本文所用的术语“织物”是指制造的纤维和/或纱线的集合，其具有与其厚度相关的大量表面积，以及用于赋予所述集合有用的机械强度的足够的内聚力。

本文所用的术语“衣服”是指由一种或多种织物制成的成衣物品。衣服通常包括已切割成一定尺寸并且缝纫或缝合在一起的织物。衣服可以包括或可以不包括纽扣、孔眼、皮带、拉链、钩环扣或者其他机械部件，它们可在局部颜色修改之前或之后装上。

本文所用的术语“颜色修改”是指与纤维、纱线、织物、衣服或非织造材料（统称为纺织物材料）相关的颜色的色度、饱和度、强度、亮度和/或色调的改变。颜色修改涵盖发色团的化学改性，以及发色团连接的材料的化学改性。颜色修改的例子包括褪色、漂白和改变色调。靛蓝染色的粗斜纹布的某些颜色修改褪色为“复古外观”，其与刚染色的粗斜纹布相比具有较浅的蓝色/紫色色调和较柔和的灰色外观。

本文所用的术语“局部颜色修改”是指如上所定义的仅在织物或衣服的一部分上进行的颜色修改。与通常在浴中（即浸没环境中）进行的一般的纺织物颜色修改不同的是，局部颜色修改使用通常位于桌子、工作台或其他硬质表面上的润湿但不浸没的织物或衣服，对悬挂或换句话讲悬吊的织物或衣服进行，或使用不会使织物或衣服经受浸没环境的滚筒或其他加工设备进行，使得衣服的仅一部分能够经过颜色修改，而不影响织物或衣服的其余部分。

本文所用的“织物或衣服的一部分”是指小于整个织物或衣服的任何部分。当具体说明时，织物或衣服的一部分可指织物或衣服的指明结构或装饰特征，例如裤腿、袖子、口袋、腰带环、袖口、褶边等等。

本文所用的术语“漂白”是指处理纺织物材料（例如纤维、纱线、织物、衣服或非织造材料）以产生较浅的颜色的过程。该术语包括制备较亮和/或较白的纺织物（如在纺织物加工应用的情况下），以及淡化污渍的颜色（如在清洁应用的情况下）。

本文所用的术语“浆料”和“上浆”是指在纺织物工业中使用的，通过增加纱线的耐磨性和强度来改善织造性能的化合物。浆料通常由淀粉或类淀粉化合物制成。

本文所用的术语“脱浆”和“退浆”是指通常在施加特殊面漆、染料或漂白剂之前从纺织物清除/移除浆料（通常为淀粉）的过程。

本文所用的术语“退浆酶”是指用于移除浆料的酶。示例性酶为淀粉酶、纤维素酶和甘露聚糖酶。

本文所用的术语“%同一性”是指编码本文所述漆酶的核酸序列和另一条核酸序列之间的核酸序列同一性水平，或本文所述漆酶和另一条氨基酸序列之间的氨基酸序列同一性水平。比对可使用常规的序列比对程序进行。核酸和氨基酸序列同一性的示例性水平包括（但不限于）相对于给定序列（如本文所述的漆酶的编码序列或漆酶的氨基酸序列）至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%或更大的序列同一性。

可用于确定两条序列之间同一性的示例性计算机程序包括（但不限于）在互联网上公开（网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）的一套BLAST程序，如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN。还可参见Altschul等人，1990年；以及Altschul等人，1997年。

当将给定的核酸序列相对于GenBank DNA Sequences和其他公用数据库中的核酸序列进行评估时，通常使用BLASTN程序进行序列搜索。BLASTX程序优选用于针对GenBank Protein Sequences和其他公用数据库中的氨基酸序列搜索在所有阅读框中翻译的核酸序列。使用默认参数开放空位罚分11.0和延伸空位罚分1.0来运行BLASTN和BLASTX，并利用BLOSUM-62矩阵。（参见例如Altschul等人，1997年。）

使用（例如）MacVector6.5版中的CLUSTAL-W程序进行对所选序列的比对以确定两条或更多条序列之间的“%同一性”，所述程序使用默认参数，包括开放空位罚分10.0、延伸空位罚分0.1和BLOSUM30相似矩阵。

本文所用的术语“化学介质”和“介质”可互换使用，是指用作使电子在表现出氧化酶活性的酶（如漆酶）和二级底物或电子供体之间穿梭的氧化还原介质的化合物。此类化学介质在本领域中也称为“增强剂”和“加速剂”。

本文所用的术语“二级底物”和“电子供体”可互换使用，是指染料、颜料（如靛蓝）、发色团（如多酚、花青素或类胡萝卜素）或电子可通过表现出氧化酶活性的酶在其中来回穿梭的其他二级底物。

除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有下列含义：

数值范围包括限定该范围的数值。除非语境中清晰指明，否则单数冠词“一个”、“一种”、“所述”等包括多个指代物。除非另外指明，否则多肽以标准的N端至C端的方向书写，并且多核苷酸以标准的5′至3′方向书写。应当理解，所述某些方法、方案和试剂并非旨在进行限制，因为等同的方法和材料也可用于实施或测试本发明的组合物和方法。虽然为了有助于读者阅读而将说明书分为了若干部分，但各部分的标题不应理解为限制性的，并且一个部分中的描述可适用于另一个部分。本文引用的所有出版物明确地以引用方式并入。

III.亲本漆酶

微生物和植物来源的多种漆酶是本领域已知的。示例性的漆酶衍生自或者可衍生自曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)（如粗糙脉孢菌(N.crassa)）、足孢子菌属(Podospora)、葡萄孢属(Botrytis)、金钱菌属(Collybia)、齿毛菌属(Cerrena)（如一色齿毛菌(C.unicolor)）、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、革耳属(Panus)（如革耳(P.rudis)）、草根霉属(Thielavia)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)（如长绒毛栓菌(T.villosa)和云芝(T.versicolor)）、丝核菌属(Rhizoctonia)（如立枯丝核菌(R.solani)）、鬼伞属(Coprinus)（如褶纹鬼伞(C.plicatilis)和灰盖鬼伞(C.cinereus)）、小脆柄菇属(Psatyrella)、毁丝霉属(Myceliophthora)（如嗜热毁丝霉(M.thermonhila)）、柱顶孢属(Schytalidium)、白腐菌属(Phlebia)（如白腐菌射脉侧菌(P.radita)(WO92/01046)）或者革盖菌属(Coriolus)（如毛革盖菌(C.hirsutus)(JP2238885)）、毡被菌属(Spongipellis)、多孔属(Polyporus)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、粗皮灵芝(Ganoderma tsunodae)和木霉属(Trichoderma)的菌株。

以下漆酶在美国专利公开第2008/0196173号和PCT公开第WO2008/076322号（以引用方式并入本文）中描述，并且对于所描述的用途是理想的：

A.来自CBS115.075菌株的齿毛菌属漆酶A1(SEQ ID NO:1)：

B.来自CBS154.29菌株的齿毛菌属漆酶A2(SEQ ID NO:2)：

C.来自CBS115.075菌株的齿毛菌属漆酶B1(SEQ ID NO:3)：

D.来自CBS154.29菌株的齿毛菌属漆酶B2(SEQ ID NO:4)：

E.来自ATCC20013菌株的齿毛菌属漆酶B3（部分）(SEQ ID NO:5)：

F.来自CBS154.29菌株的齿毛菌属漆酶C（部分）(SEQ ID NO:6)：

G.来自CBS154.29菌株的齿毛菌属漆酶D1(SEQ ID NO:7)：

H.来自CBS115.075菌株的齿毛菌属漆酶D2(SEQ ID NO:8)：

I.来自CBS154.29菌株的齿毛菌属漆酶E（部分）(SEQ ID NO:9)：

在一些实施例中，可使用具有如下氨基酸序列（SEQ ID NO:10；信号序列用斜体表示）的漆酶D：

该多肽的成熟加工形式如下(SEQ ID NO:11)：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

注意，使用SEQ ID NO:10的漆酶的成熟形式（即SEQ ID NO:11）进行编码（参见例如图20），SEQ ID NO:7（齿毛菌属漆酶D1）、SEQ IDNO:8（齿毛菌属漆酶D2）和SEQ ID NO:10（齿毛菌属漆酶D）几乎是相同的，例外在于位置8（其中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8具有Ile，而SEQ ID NO:10具有Leu）和位置254（其中SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:10具有Glu，而SEQ ID NO:8具有Asp）。这些差异似乎不对漆酶表达或者比活性有实质影响。

另外的漆酶包括但不限于图21中的比对中所显示的那些漆酶，即革耳(Panus rudis)(SEQ ID NO:12)、毡被菌属(Spongipellis sp.)(SEQ ID NO:13)、云芝(Curiolus versicolor)CVL3(SEQ ID NO:14)、云芝(Curiolusversicolor)CVL G1(SEQ ID NO:15)、香菇属(Lentinus sp.)(SEQ ID NO:16)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)(SEQ ID NO:17)、布氏黑蛋巢菌(Cyathus bulleri)(SEQ ID NO:18)、血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)(SEQ ID NO:19)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)(1)和(2)（分别为SEQ IDNO:20和21）、栓菌属(Trametes sp.)LCC1(SEQ ID NO:22)、栓菌属(Trametes sp.)LCC4(SEQ ID NO:23)、灵芝(Ganoderma lucidum)(SEQ IDNO:24)、毛云芝菌(Curiolus hirsutus)(SEQ ID NO:25)、担子菌(Basidiomycete sp.PM1)(SEQ ID NO:26)、小孔硬孔菌(Rigidoporusmicroporus)(SEQ ID NO:27)和缘毛多孔菌(Polyporus ciliatus)(SEQ ID NO:28)。共有（或者主体）氨基酸序列以SEQ ID NO:29表示。

漆酶可通过培养用包含编码漆酶的核苷酸序列的重组DNA载体转化的宿主细胞来制备。DNA载体还可包含允许漆酶在培养基中表达，并任选地允许漆酶从培养基中回收的核苷酸序列。

包含编码漆酶的多核苷酸序列的表达载体可转到合适的宿主细胞中。宿主细胞可以是真菌细胞，例如丝状真菌细胞，其例子包括（但不限于）木霉属[如里氏木霉(T.reesei)（过去归为长梗木霉(T.longibrachiatum)，现在也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)）、绿色木霉(T.viride)、康宁木霉(T.koningii)和哈茨木霉(T.harzianum)]、曲霉属（如黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)和泡盛曲霉(A.awamori)）、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)（如特异腐质霉(H.insolens)和灰腐质霉(H.grisea)）、镰孢菌属(Fusarium)（如禾赤镰孢(F.graminum)和F.venenatum）、脉孢菌属、肉座菌属(Hypocrea)和毛霉属(Mucor)物种。表达漆酶的宿主细胞也可得自齿毛菌属（如一色齿毛菌）物种。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成和原生质体的转化、接着再生细胞壁的方法使用本领域已知的技术进行转化。

或者，宿主生物体可得自杆菌属物种，例如芽孢杆菌属(Bacillus)[如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)（现在为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)）和短芽孢杆菌(B.brevis)]、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)（如天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、浅青紫链霉菌(S.lividans)）、或大肠杆菌(E.coli)。细菌细胞的转化可根据常规方法进行，例如Maniatis,T.等人，《分子克隆：实验室手册》(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”)，冷泉港，1982年中所描述。适当DNA序列的筛选和载体的构建也可通过标准步骤进行（与上文比较）。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何常规培养基。在一些实施例中，所表达的酶分泌到培养基中，并且可通过熟知的程序从其中回收。例如，漆酶可如美国专利公开No.2008/0196173中所描述从培养基回收。在一些实施例中，酶在细胞内表达，并且在细胞膜破裂后回收。

在特定实施例中，表达宿主可以是里氏木霉，其具有在CBH1启动子和终止子的控制下的漆酶编码区（参见例如美国专利No.5,861,271）。表达载体可以是例如美国专利第7,413,887号中所公开的pTrex3g。在一些实施例中，漆酶如美国专利公开第2008/0196173号或第2009/0221030号中所述进行表达。

在一些实施例中，适用于本发明组合物和方法的漆酶为不含可用于引导全长多肽从细胞分泌的信号序列的成熟多肽。

合适的成熟多肽可与选自如下的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%或更高的氨基酸序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28.优选地，此类多肽具有漆酶活性，如使用本文所述的测定法和步骤所确定。

在一些实施例中，适用于本发明组合物和方法的漆酶相对于全长或成熟亲本/参考序列而言是截短的。此类截短的多肽可通过全长或成熟多肽序列的蛋白质降解或通过对多核苷酸进行工程改造以编码截短的多肽来制备。示例性多肽相对于选自如下的氨基酸序列在氨基和/或羧基末端处截短：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27和SEQ ID NO:28.截短可以是少量如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，或整个结构域或功能域的截短。合适的截短多肽可与上述参考氨基酸序列中的一者或多者的对应部分具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%或更高的氨基酸序列同一性。优选地，此类多肽具有漆酶活性，如使用本文所述的测定法和步骤所确定。

IV.变体漆酶

本发明的组合物、方法和系统涉及这样的变体漆酶，该变体漆酶与衍生它的亲本漆酶相比显示出提高的表达和/或比活性，该亲本漆酶例如是以下亲本漆酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或者SEQ ID NO:28。

在一些实施例中，变体漆酶包括将糖基化位点引入到漆酶氨基酸序列中的突变。糖基化位点优选地在漆酶的表面上。在一些实施例中，该突变在漆酶的表面上引入N-糖基化位点[即氨基酸序列Asn-Xaa-Thr/Ser(N-X-T/S)，其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸残基]。可通过在正确的背景(context)中引入Asn残基，通过改变现有的Asn残基的背景，或者同时通过这两种方式，来将N-糖基化位点引入到氨基酸序列中。在一些情况中，单个氨基酸突变足以引入N-糖基化位点。在其他情况中，需要两个（或者甚至三个）氨基酸突变来引入N-糖基化位点。在一些实施例中，将N-糖基化位点引入到与SEQ ID NO:11所例示的漆酶氨基酸序列的第12、28、47、157、317、362位和492位相当的一个、两个、三个或者更多个位置。

在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第12位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在与第12-14位相当的位置处将氨基酸序列NKD改变为NAT（或者NAS、N-V/L/I-T/S）来引入。在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第28位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在与第28-30位相当的位置处将氨基酸序列GGT改变为NGT来引入。在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第47位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在与第47-49位相当的位置处将氨基酸序列NVI改变为NVT（或者NVS）来引入。在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第157位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在与第157-159位相当的位置处将氨基酸序列QTV改变为NTT（或者NTS）来引入。在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第317位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在与第317-319位相当的位置处将氨基酸序列NAV改变为NAT（或者NAS）来引入。在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第362位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在残基362-364处将氨基酸序列NAQ改变为NAS（或者NAT）来引入。在特定实施例中，在与SEQ ID NO:11中的第492位相当的位置处引入N-糖基化位点，例如通过在与第492-494位相当的位置处将氨基酸序列SAS改变为NAS来引入。Ser和Thr在糖基化位点中是可置换的，并且不太可能影响漆酶结构或者功能。“X”位置处的保守置换通常也是可置换的。

以下显示衍生自一色齿毛菌(C.unicolor)漆酶D(SEQ ID NO:11)的示例性糖基化变体的氨基酸序列。

残基12-14处NKD改变为NAT（G*12，变体mut1；SEQ ID NO:30）：

AIGPVADLHIVNATLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

残基28-30处GGT改变为NGT（G*28；变体mut2；SEQ ID NO:31）：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLANGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

残基47-49处NVI改变为NVT（G*47；变体mut3；SEQ ID NO:32）：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVTDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

残基157-159处QTV改变为NTT（N*157；变体mut4；SEQ ID NO:33）：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLANTTVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

残基317-319处NAV改变为NAT（N*317；变体mut5；SEQ ID NO:34）：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNATPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

残基362-364处NAQ改变为NAS（N*362；变体mut6；SEQ ID NO:35）：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNASDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI

残基492-494处SAS改变为NAS（N*492；变体mut7；SEQ ID NO:36）：

AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLNASQKVKPKKGTAI

在一些实施例中，变体漆酶包括改变漆酶的表面电荷的突变。在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中第130位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，突变在这个位置处引入负电荷。亲本漆酶中的该氨基酸可以是N，其基于多种漆酶的比对如图20和21中所示在这个位置为共有氨基酸残基，但可以是另一不同的残基，如K、Q、D、V或者A。在一些实施例中，置换残基为D、E、R或者K。在一些实施例中，置换残基为D或者E。在特定实施例中，突变为N130E。在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第335位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，突变在这个位置处引入负电荷。亲本漆酶中的该氨基酸可以是N，或者另一不同的残基，如A、P、S或者G。在特定实施例中，置换残基为D、E、R或者K。在特定实施例中，置换残基为R或者K。在特定实施例中，突变为N335R。

在一些实施例中，变体漆酶包括位于与位于齿毛菌属(Cerrena)漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基对应的氨基酸位置处的突变。在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第265、287、293位或者319位对应的氨基酸位置处的突变。

在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第265位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸是小的脂族氨基酸残基。在一些实施例中，该氨基酸为芳族氨基酸残基。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为L、V、F、T、N、S或者P。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为I。在一些实施例中，置换残基为R、H、V、K、I或者L。在特定实施例中，突变为I265R/H/V/K/I/L。在特定实施例中，突变为I265R、I265H或者I265V。

在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第287位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸是小的脂族氨基酸残基。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为V、A、I、D、E或者P。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为V。在一些实施例中，置换残基为P、H或者G。在特定实施例中，突变为V287P/H/G。在特定实施例中，突变为V287P、V287H或者V287G。

在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第293位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸是小的脂族氨基酸残基。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为V、I、A、D、T或者N。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为V。在一些实施例中，置换残基为N、T或者S。在特定实施例中，突变为V293N/T/S。在特定实施例中，突变为V293N或者V293T。

在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第319位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸是小的脂族氨基酸残基。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为V、G、F、T、N或者Q。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸为V。在一些实施例中，置换残基为W、T或者S。在特定实施例中，突变为V319W/T/S。在特定实施例中，突变为V319W或者V319T。

在一些实施例中，变体漆酶包括处于在该酶的活性位点之中或者附近的氨基酸位置处的突变。在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第68位对应的氨基酸位置处的突变，其中亲本漆酶中的该残基被另一不同的残基置换。在一些实施例中，亲本漆酶中的该氨基酸残基为芳族氨基酸残基，包括但不限于F、Y、W或者H。在一些实施例中，该置换是置换成非芳族氨基酸残基，即A、V、L、I、G、M、S、T、D、E、N、Q、R、K、C或者P。在一些实施例中，该置换是置换成脂族氨基酸残基，即A、V、L、I。在特定实施例中，突变为F68L。

在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第68、130、265、287、293、319位和/或335位对应的氨基酸位置处的多个突变，所述多个突变可与在漆酶的表面上引入N-糖基化位点的突变进行组合。图22显示参照SEQ ID NO:11而言的全部前述突变的位置；其中示例性的N-糖基化突变以粗体显示，表面电荷和非保守疏水残基突变以粗体和下划线表示。在一些实施例中，变体包括位于与SEQ ID NO:11中的第287、293位和或319位对应的氨基酸位置处的多个突变。

在一些实施例中，变体包括SEQ ID NO:11中的多个突变：V287G、V287P、V293T和V319T。示例性的突变组合如下：I265R/V287G、I265R/V293T、I265R/V319T、I265R/V287G/V319T、I265R/V287G/V293T/V319T、I265R/V287P、I265R/N335R、I265R/N130E、F68L/I265R、F68L/I265R/V287G、F68L/I265R/V293T、F68L/I265R/V319T、F68L/I265R/V287G/V319T、F68L/I265R/V287G/V293T/V319T、F68L/I265R/V287P、F68L/I265R/N335R和F68L/I265R/N130E。

根据本文的描述，这些突变的对等物和变型对于技术人员将是显而易见的。

V.介质

在一些实施例中，本发明的漆酶体系、组合物和方法还包括增强漆酶活性的一种或多种化学介质试剂。介质（也称为增强剂或加速剂）是充当氧化还原介质用于有效地使电子在表现出氧化酶活性的酶与染料、颜料（如靛蓝）、发色团（例如染色污渍中的多酚、花青素或类胡萝卜素）或其他二级底物或电子供体之间穿梭的化学制品。

在一些实施例中，化学介质是酚类化合物，例如丁香酸甲酯或相关化合物，如PCT专利申请第WO95/01426号和第WO96/12845号中所描述。介质也可以是N-羟基化合物、N-肟化合物或N-氧化物化合物，例如N-羟基苯并三唑、紫尿酸或N-羟基乙酰苯胺。介质也可以是吩噁嗪/吩噻嗪化合物，例如吩噻嗪-10-丙酸酯。介质还可以是2,2'-连氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)。其他化学介质是本领域熟知的，例如PCT专利申请第WO95/01426号中所公开的化合物，已知其可增强漆酶的活性。介质还可以是乙酰丁香酮、丁香酸甲酯、丁香酸乙酯、丁香酸丙酯、丁香酸丁酯、丁香酸己酯或丁香酸辛酯。

在一些实施例中，介质为4-氰基-2,6-二甲氧基苯酚、4-羧酰胺基-2,6-二甲氧基苯酚或其N-取代衍生物，例如4-(N-甲基羧酰胺基)-2,6-二甲氧基苯酚、4-[N-(2-羟乙基)羧酰胺基]-2,6-二甲氧基苯酚或4-(N,N-二甲基羧酰胺基)-2,6-二甲氧基苯酚。

在一些实施例中，介质用下式描述：

其中A为例如–R、–D、–CH=CH–D、–CH=CH-CH=CH–D、-CH=N–D、–N=N–D或–N=CH–D的基团，D选自-CO–E、–SO_2–E、-CN、–NXY和–N⁺XYZ，E为–H、–OH、–R、–OR或-NXY，并且X、Y和Z独立地选自–H、-OH、-OR和–R；其中R为C₁-C₁₆烷基，优选地为C₁-C₈烷基，其中烷基可以是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的，并且任选地被羧基、磺酸基或氨基取代；并且B和C独立地选自C_mH_2m+1；1≤m≤5。

在一些实施例中，上述式中的A为–CN或–CO–E，其中E可以是–H、–OH、–R、–OR或-NXY，其中X和Y独立地选自–H、-OH、-OR和–R，其中R为C₁-C₁₆烷基，优选地为C₁-C₈烷基，其中烷基可以是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的，并且任选地被羧基、磺酸基或氨基取代；B和C独立地选自C_mH_2m+1；1≤m≤5。在一些实施例中，介质为4-羟基-3,5-二甲氧基苄腈（也称为“丁香腈”或“SN”）。

注意，在上述式中，A可设置在羟基的间位，而不是设置于所示的对位。

对于例如纺织物加工的应用，介质可以约0.005至约1,000μmol/g粗斜纹布、约0.05至约500μmol/g粗斜纹布、约0.1至约100μmol/g粗斜纹布、约1至约50μmol/g粗斜纹布或约2至约20μmol/g粗斜纹布的浓度存在。

介质可通过技术人员已知的方法制备，例如PCT专利申请No.WO97/11217和No.WO96/12845以及美国专利No.5,752,980中公开的那些方法。其他合适的介质在例如美国专利公开No.2008/0189871中有所描述。

VI.实用性

漆酶的工业应用包括纸浆和纸的漂白和去木质素，废纸脱墨，纺织品颜色修改，染料脱色，废水处理，高分子聚集体的解聚，芳族化合物的聚合，自由基介导的聚合和交联反应（例如颜料、涂料、生物材料），染料的活化，有机化合物的偶联，动物生皮加工（例如脱毛、浸灰、软化和/或鞣革），角质纤维染色（例如毛发、羊毛），在食品或饲料制备或加工中，或者作为食品或饲料中的活性成分，以及用于清洁组合物，包括洗涤剂组合物，并通常用于清洁、消毒、排除污染和卫生处理。另外的用途在例如美国专利第2008/0196173号和PCT公开第WO2008/076322号中描述，将这两个专利以引用方式并入本文。

具体的纺织品应用包括但不限于纤维、纱线、织物或者衣物的处理、加工、修整、抛光或者生产，漂白后处理工艺，染料废液的脱色，染色的纺织品的颜色修改（包括但不限于漂白）等。颜色修改可以是全局的（即施加于整个织物或者衣物）或者局部的（即仅施加于织物或者衣物的一部分）。在一些情况中，可取的是将颜色修改与其他酶促加工步骤如研磨（例如使用纤维素酶）同时进行或者依序进行。在例如美国专利第2008/0196173号和PCT公开第WO2008/076322号中描述了许多用途，将这两个专利以引用方式并入本文。

本发明的漆酶可用于对任何可用漆酶脱色的染料进行脱色。这种染料的例子包括但不限于偶氮染料、单偶氮染料、双偶氮染料、硝基染料、呫吨染料、喹啉染料、蒽醌染料、三芳基甲烷染料、对偶氮苯胺染料、吖嗪噁嗪染料、二苯乙烯染料、苯胺染料和酞菁染料、或者它们的混合物。在一些实施例中，染料为偶氮染料（如活性黑5（2,7-萘二磺酸、4-氨基-5-羟基-3,6-双((4-((2-(磺酰氧基)乙基)磺酰基)苯基)偶氮)-四钠盐）、活性紫5、甲基黄、刚果红）。在一些实施例中，染料为蒽醌染料（如雷马素蓝）、靛蓝染料（靛蓝胭脂红）或三芳基甲烷/对偶氮苯胺染料（如结晶紫、孔雀绿）。在各种实施例中，染料为活性染料、直接染料、分散染料或颜料染料。在一些实施例中，染料包含在油墨内。在一些实施例中，染料为靛蓝和/或硫系染料。在一些实施例中，纺织物为用靛蓝和/或硫系染料染色的粗斜纹布。在具体实施例中，纺织物用靛蓝染色，并且使用漆酶和介质将靛蓝氧化为靛红。

在以下带编号的段落中，对本发明组合物和方法的各个方面和实施例进行进一步的描述。

1.提供了一种衍生自亲本漆酶的变体漆酶，所述变体漆酶：

(a)在与氨基酸序列SEQ ID NO:11第68位对应的位置处具有突变；(b)具有改变亲本漆酶的表面电荷的突变；

(c)具有改变亲本漆酶的表面疏水性的突变；或者

(d)在与位于亲本漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基对应的氨基酸位置处具有突变；

其中所述突变是置换成相对于所述亲本漆酶而言另一不同的氨基酸残基。

2.在一些实施例中，段落1的变体漆酶在与氨基酸序列SEQ ID NO:11第68位对应的位置处具有突变，其中所述突变是芳族氨基酸残基置换成非芳族氨基酸残基。

3.在一些实施例中，段落2的变体漆酶具有的置换为芳族氨基酸残基置换成脂族氨基酸残基。

4.在一些实施例中，段落3的变体漆酶具有的置换为芳族氨基酸残基置换成A、V、L或者I。

5.在一些实施例中，段落4的变体漆酶具有的突变相当于SEQ IDNO:11中的F68L。

6.在一些实施例中，段落1的变体漆酶具有改变亲本漆酶的表面电荷或者改变表面疏水性的突变，其中所述突变位于与SEQ ID NO:11中的第130位、第265位、第287位、第293位或者319位相当的位置处。

7.在一些实施例中，段落1的变体漆酶具有改变亲本漆酶的表面电荷或者改变表面疏水性的突变，其中所述突变位于与SEQ IDNO:11中的第130位相当的位置处。

8.在一些实施例中，段落1的变体漆酶具有改变亲本漆酶的表面电荷或者改变表面疏水性的突变，其中所述突变位于：

(a)与SEQ ID NO:11中第130位相当的氨基酸位置处，其中所述亲本漆酶中的所述残基被选自D、E、R和K的另一不同的残基置换；

(b)与SEQ ID NO:11中第265位相当的氨基酸位置处，其中所述亲本漆酶中的所述残基被选自R、H和V的另一不同的残基置换；

(c)与SEQ ID NO:11中第287位相当的氨基酸位置处，其中所述亲本漆酶中的所述残基被选自P、H和G的另一不同的残基置换；

(d)与SEQ ID NO:11中第293位相当的氨基酸位置处，其中所述亲本漆酶中的所述残基被选自N、T和S的另一不同的残基置换；或者

(e)与SEQ ID NO:11中第319位相当的氨基酸位置处，其中所述亲本漆酶中的所述残基被选自W、T和S的另一不同的残基置换。

9.在一些实施例中，段落1的变体漆酶具有的突变相当于SEQ IDNO:11中的：

(a)I265R/V287G，

(b)I265R/V293T；

(c)I265R/V319T；

(d)I265R/V287G/V319T；

(e)I265R/V287G/V293T/V319T；

(f)I265R/V287P；

(g)I265R/N335R；

(h)I265R/N130E；

(i)F68L/I265R；

(j)F68L/I265R/V287G；

(k)F68L/I265R/V293T；

(l)F68L/I265R/V319T；

(m)F68L/I265R/V287G/V319T；

(n)F68L/I265R/V287G/V293T/V319T；

(o)F68L/I265R/V287P；

(p)F68L/I265R/N335R；或者

(q)F68L/I265R/N130E。

10.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶衍生自可从齿毛菌属(Cerrena)物种获得的亲本漆酶。

11.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶衍生自可从一色齿毛菌(Cerrena unicolor)获得的亲本漆酶。

12.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶衍生自一色齿毛菌的漆酶D。

13.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶衍生自具有选自以下的氨基酸序列的亲本漆酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。

14.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少70%同一性的氨基酸序列。

15.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少80%同一性的氨基酸序列。

16.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90%同一性的氨基酸序列。

17.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少95%同一性的氨基酸序列。

18.在一些实施例中，任何前述段落的变体漆酶还包含将糖基化位点引入到所述亲本漆酶的氨基酸序列中的突变。

19.提供了一种包含任何前述段落的变体漆酶的组合物。

20.在一些实施例中，段落19的组合物还包含化学介质。

21.在一些实施例中，段落20的组合物包含酚类化合物化学介质。

22.在段落21的组合物的一些实施例中，所述化学介质是选自以下的酚类化合物：丁香腈、乙酰丁香酮和丁香酸甲酯。

23.提供了一种对表面进行漂白的方法，所述方法包括使所述表面与任何前述段落的组合物接触。

提供了以下实例进一步说明本发明的组合物、方法和系统，这些实例不应被认为限制本发明。

实例

实例1：里氏木霉(Trichoderma reesei)筛选菌株的产生

产生了改进的筛选菌株，以提高在与酶变体的氨基酸序列无关的因子的存在下CBH2变体表达的一致性。具体而言，开发了与靶向载体组合的里氏木霉筛选菌株，该靶向载体迫使cbh2变体基因（例如与调控序列有效组合的编码区）整合。在本发明的开发过程中制备的新菌株组合了对于筛选变体文库有利的几种突变。遗传工程步骤的示意图显示了于图1中。

从里氏木霉quad缺失衍生菌株中缺失掉ku80。通过在红褐肉座菌(H.jecorina)QM6a（例如里氏木霉）的基因组序列中进行TBLASTN搜索，鉴定出了MUS52的单个直向同源物即人KU80的粗糙链孢霉(N.crassa)直向同源物，并且因而命名为里氏木霉ku80。蛋白质id58213；http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html。里氏木霉ku80基因的核苷酸序列以SEQ ID NO:37提供：

ATGGCGGACAAGGAAGCAACCGTCTTCATCATCGACCTCGGCGCGTCCATGGCAGCTGTCAATGGGGGTCGAGAAGAATCCGACCTTGATTGGAGCATGAGCTACGTCTGGGACAAGATCAGCAACGTCGTGGCCTCGAATCGCAAGACGCTGTGCGTTGGCGTCGTGGGGTTCAGAACCGACGAGACAAACCACACGCTGAGCGAGGATGGGTACGAGAACATCTCCATATTGCAGCCCCTGGGGCCGATGAGCATGTCCAGCCTCAAGGCTCTTCAGCCCAAGGTGAAGCCGAGCAGGACGGTGGAAGGCGATGCCATCTCGGCGATTGTCATTGCCGTCGACATGATTGACAAGTACACGAAGAAGAACAAATGGAAGCGGCAGATTGTTCTCATTACCGACGGCCAAGGCGAGATTGATCCAGATGATATTGGCGACATTGCTAGAAAGATGCGCGACTCGAATATTGAATTGACAGTCTTGTGAGTTGGCGAGACCGTTTGGCGGACGGTAATGGTGCTGACGGTGATGCAAGGGGCGTCGACTTTGATGCTCCCGATTACGGCTTCAAAGAGGAGGACAAACCTTCAGTCAAGGTACTCCATATGTTCACTTCTTTTCTTTTTCTTCTTTATTTTCTTTTCTTTTGAAGCTTTCATTAACCTCTTCGTTAGAAGCAAAACGAAGAGACCCTAAAAAAGCTCGTGGATGGCTGTGGCGACGACTCAAGGTTCGCCTCCATGGTCGAGGCCATTGACGACTTGAATGAGCCACGAGCAAAGTCGGTCAAGCCTTACAAAACGTACGAAGGTCTCTTGACCTTGGGAGATCCGAAAAACGCTCCCGCAGTGGTGGAAATCCGCGTCGAGAGATACTTCAAGACCCATCTAGCCAGGCCACCTGCCGCCAGCACCGTGGTGGTCAAGGAGGAGCAAGCTGGGCCGTCTCAGGCAGACGAGGACGAACAGATGGACGGAGCGGAACTTACAGCTGTGAGGCAGGCCAGGACATACAAGGTCAATGATCCAGATGCCCCTGGCGGTAAGCGTGACGTTGAGTTTGAGTCTCTGGCCAAAGGGTACGAGTACGGCAGGACGGCAGTCCACATCAGCGAGTCTGATCAAAACGTCACCAAGCTCGCGACAGAAAAGAGCTTCAAGATCATCGGCTTCGTCCAGAAAGAAAAGGTATTGGCTTGGCTCTCAGCATTTGACCCGTTGCTCTTGGCTAACCCTTGTTTAGTATGAAATGCTCCTTAATCTTGGCGAAACCTGCGTTACCGTTGCATCCAAGTACGATGAAAAGTCTGAGCTGGCTTTTAGCTCTCTGGTGTGGGCGCTCTCGGAGCTCGACGCCTACGCCGTGGCCCGCCTAGTAACTAAGGACCAAAAGGACCCCATGCTGGTGTTACTGATGCCGTATATGGAGCCTGATTATGTTTGTCTCTATGATGTGCCTCTGCCTTTCGCAGAGGACATCAGGACGTACCAGTTTCCTCCCTTGGACAGAGTCGTTACCGTCAGTGGCCAAACGCTCACCAACCATCGCCTATTGCCATCCGACGAGCTCAACCAAGCGATGAGCGACTACGTAGATGCCATGGACATTTCAAGTTATGGTATCGATGAAGATGGGTGAGTATAGAAGATGATTGTTCAAATCTTTCACTTCTAAGCATTGCTTCTGATCTAGGCAACCGGCTGAATATGCCACCATCGATGAGTTATACAACCCTGCGATACATCGCATAGGCCATGCGATCAAACAACGAGCGATCCACCCAGAGAAACCCGTGCCCGAGATCCCCCCAGTCTTGCTTAGATTCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGA

使用本领域的标准方法(WO2005/001036)，从quad缺失衍生菌株缺失掉里氏木霉ku80基因。简单地讲，利用ku80缺失盒，其采用侧接在1.3kb的5’ku80序列和2.3kb的3’ku80序列之间的选择性标记，如图2中示意性显示。如WO2008/039370中所描述，使用赋予对除草剂氯嘧磺隆的抗性的变体里氏木霉als作为选择性标记。ku80敲除盒的核苷酸序列的长度为7685个碱基对：碱基1-1271对应于5'ku80同源区；碱基1280-7685对应于als-氯嘧磺隆抗性变体(A190D)；碱基5381-7685对应于3'ku80同源区。ku80敲除盒的核苷酸序列以SEQ ID NO:38提供：

GGCCGCCTCAACACCCACACTCGAGGCACACGAGTTCATCGGCGGCTTCCCCCACAAGCTCTCGGCCAACCTGCTACCGGCTCTCTCGCGAGACTTCCCAAAGCCTACAAACGAGGTCGACGTCAAGGAGGCCCTCGAGCGCCAGCCCGGCAGATGGAGCCTCCAGGGCCAGATCAAGGCCAACAACATGAGAGCCCAGAGCGCCGCACTCCGGCTCGACGACAAGGAGGGCAAGGCGAGAGCCTTTGAGGAGGCCAAGCGCGAGCTACTGGCGTATCACCACAGCGCCCTGCGGAAGCCTTCCGGCGCAAGATAATGAGCTTGATCGCAATGACGAGTTCACGTACGCTTTGCCATATTGTTGTTGCTTTTTGTTTGGTCCTACATGTACGGCGCATTGGTTGGGAGGATATACCCACGGAGAGTGTCCGAGTGGCTTCTGGGATTTAGAGCGTCATTAGCAGGATAGAGATGGTTGGCCAGGGGAATGGAATTGACTTTTCACTACAAGGAACTTGTTCACTCTGGTGTTGATTCCCATTGCGTGACTGGTAGTAGGGAGGAATGCTTTTACTTTGTGCCACTAGACCGCAGAGAAGGGTTGGTTGCAAGCGGGGTCCGTGTATACCGACCAAGAGTGATGGGCATACAGCAACGTTTCTGAACGACTTCATTTTGTCCGAGTCTACTGGATGCGAGATGCCAGCGTGAAGCCGTACGCCACCAGGGCGACGAACTCGACAAGGTTGACGAGGGAGGAGATGCCGTGCAGCATGCCAAACTTCTTGTTGAGGGCACGCATCTCATCCGACTGTGCATCCTTGTCATACCACTCCTTTCCGTCTCGCTTGGCTGGTGGGAGGGTTCAACAAATCCATCGTCAGCCATCCGGGGTCTCAAATCAATGGCGTGCATGCGGAGTCGGGCTTGAGGCTAACCTTGTCCATGGCGGTCCTTCATGGTCTTGACAGTGGCGGGAAGCAGCACGGCGAGGTTGACGAGGCCGCTGACGAACATGGTTGCGATGGGCACCAAGGAGCTCCACTTGTTGGGAGCGTCGACGAGGCCGCCGATGCCGCCCTTGATGCCCAAGAGGGCGTTTCCGGGGAACGTGAGGGCGAGCAGCGCGGGGATGGCCGTCTGCATGCCAAAGTAGATGGGGAACAGCTTGCTCTGGATGGCGGAGAAGGAGGGCCGGCTGACGGTGCGGAACATGACGATGCCGTTGACGAAGGACTGCAGTAGCGTAGTGTGATGGTAAGCAGCTGGCCGGCGCGCCTGAGACAATGGCCGGCAATGGTAAAAAGGACCAAGATGTACTAGGTAGTTGCAATGTGGCTTATTACCTACCTACTACCTGGTAGGCACCTACTAGGTACTTGGGTAGACGGACAATGAAATTTGAAGTCGGGGTTGCAGGAAAGCAGGGCGCTGGACACATTGTGCTTCAGGCGGTACCCGTCGTCATCGTCAGCCAATGTCGAGGCCCGGCAGCCCGAGGAGCGAGACAACCTTGGCCGGAGGAGCCCGCAGGTACCTGCCAAAGCGCGGCTGGTACCTCTCAACCCTCTCAGGCCTGTTGGATGCCCTATGACATGCCCTGGGGGATGCAGCTGTTGCCCCGGCCCCGCACTTTCGGGTGACCGCGAGGCTGCTGATTGGCTGGTTGCCACGGGCTGGGCGGTCCCTGAAGTTGTTGCCATCTGAACTCTGTCGGCGCTGGCGTCGGCTGCGCCCAATGGGAGGCGAGACAACTCAGGGTACTAGAATCACTGACAGAAGAAGAGAATCGAAAGTAGGTAGACAGCCAATTCGTTGCATGGCAGGCAACCGCACAGGAGAAAAATTGACTACCCCACAATCAGGCACAGTAAGTAGGGCACAGTACGTATGTACAGACAAGGCGCAAGCGATACTGCGCGACCCGGTACCTCGCCGGCTTGACACGTGCGACAGGCTACTTTACTAGTATTCGCAGCGGCGGGTCGCGCATTATTACATGTACTGTGCCGCCATTTGATGACTGGGCTGCTGCAGTATTAGTAGATCTGCCCGGCATCGCCCTTCCATGGGCGCGACCCGGGACTGGACCCTCTGACTCTACCTACATGTACCTAGGCCGGGCCGGGCTTGGTGACTTTTGTCCGATCAGGTCGTTCGCCTGGCTACCTATTATTTCTCTTTCTTCTTCTCCATCCTGCTTCTGGCCTTGCAATTCTTCTTCGCCACTCCTCCCTCTTCCCCCCGCGATACCCTTGAATTCGTCAGAGAGGAAAAGACGAGAAAAAAAAGGGCAGCAGAGACGTCGGTCTGGCTCACGTGCTGCATCTCTGCGCACTCTCATTTTTTTTATTGTCCGACCCCTCCCTCAACCTTCTCCTTCGTTGACAGGCTAAGCCTTGCTTCGACGCTCTCTCTTTGAATTTTTCTACTTCTACCTTCTTTTCTTGCGTGTTACCCACCATAGCTCGATTCACGATGCTCCGAAGTCGCCAAGTCACAGCCAGGGCCGTCCGGGCTCTGGGCCAGGCGCGCGCCTTTACCTCGACGACCAAGCCTGTCATGATCCAGAGCAGCCAGAGGAAACAGGCCAACGCCAGCGCTGCTCCGTAAGTCGCCCATTGCCATTGCATCTTCTGTTTGATATATACTTCCTGCTGCTTGCGTGGCGTCGTCTCTCGGTTATGCGTGTCAAGGACCAGGTGTGTTCGCATCGTGGTTTTCCAGCGCCGATTACCGGGGGACGAATTTTTGGCTGCTCAACTCGCGCGCGCGCATTCTGATTCTTCGTTTTCAATCTTGAGCGACAACTGGCTAACATAATGGCCATTGGCAATTGCTTCACACAGACAAGTCCGCCCTGTACCGAGCCCTGCTTTCAACGCTGAAGACAAAGACCGCAGCCATGTGCAGCCTCTGGTCAACCCGTCGAAGCCCGACATGGATGAATCGTATGTCCACGTCCCCTCGTCCCGCCCTACAAAATGAACACGATTACACCAGAATTTTTGCAACAATCGACACTTCTATAACAGACCAATTGAGCTTTGTTCTGACCAATCATGTTGCTCTAGATTCATTGGCAAAACCGGAGGCGAAATCTTCCACGAGATGATGCTGCGACAGGGTGTCAAGCACATTTGTAGGTTCCGATGCCGGCCGCCCACACGGGCTCCATCCTTGCTCCATCTCTCCAGCTAGGCAAATCTCGCTAACCTTGAGTCACCATCCAGTCGGATACCCTGGCGGCGCTATCCTGCCCGTCTTCGACGCCATCTACAACTCAAAACACTTCGACTTCATCCTGCCCCGTCATGAGCAGGGAGCTGGCCATATGGCCGAGGGCTATGCCCGTGCCTCGGGCAAACCCGGTGTCGTCCTGGTGACTTCCGGCCCCGGTGCTACCAATGTCATCACGCCCATGCAGGATGCCCTGTCGGACGGAACGCCCTTGGTCGTCTTCTGCGGCCAGGTCCCCACCACGGCCATCGGCAGCGATGACTTCCAAGAGGCCGACGTCGTGGGCATCTCGCGGGCCTGCACCAAGTGGAACGTCATGGTCAAGAGCGTTGCTGAGCTGCCGCGGAGAATCAACGAGGCCTTTGAGATTGCCACCAGCGGCCGCCCTGGCCCCGTCCTCGTCGACCTGCCCAAGGATGTCACGGCTGGTATCCTGAGGAGAGCCATCCCTACGGAGACTGCTCTGCCGTCTCTGCCCAGTGCCGCCTCCCGCGCCGCCATGGAGCTGAGCTCCAAGCAGCTCAACGCCTCCATCAAGCGTGCCGCCGACCTCATCAACATCGCCAAGAAGCCCGTCATCTACGCCGGTCAGGGTGTCATCCAGTCCGAGGGCGGCGTTGAGCTCCTGAAGCAGCTGGCGGACAAGGCCTCCATCCCCGTCACCACCACCCTCCATGGCCTGGGTGCCTTTGATGAGCTGGACGAGAAGTCGCTGCACATGCTGGGCATGCACGGCTCGGCGTATGCCAACATGGCCATGCAGCAGGCCGACCTCATCATCGCCCTCGGCAGCCGATTCGACGACCGTGTTACTCTGAATGTCTCCAAATTTGCGCCTGCAGCCAGGCAAGCTGCTGCCGAGGGCCGCGGCGGCATCATTCACTTTGAGATCATGCCCAAGAACATCAACAAGGTCATCCAGGCGACCGAGGCCGTCGAGGGCGACGTCGCCACCAACCTGAAGCACCTCATTCCCCAGATTGCCGAAAAGTCCATGGCGGACCGAGGAGAGTGGTTCGGCCTCATCAATGAGTGGAAGAAGAAGTGGCCCCTGTCAAACTACCAGCGCGCGGAGCGGGCTGGCCTCATCAAGCCGCAGACGGTCATGGAGGAGATTAGCAACCTGACGGCCAACCGAAAGGACAAGACGTACATTGCCACGGGTGTCGGCCAGCACCAGATGTGGGTTGCCCAGCACTTCCGCTGGAGGCACCCTCGATCCATGATTACCTCTGGTGGTCTGGGCACCATGGGCTACGGTCTCCCCGCGGCCATTGGCGCCAAGGTGGCCCAGCCCGACGCTCTCGTAATTGACGTTGATGGCGATGCCTCGTTTAACATGACGCTGACGGAGCTGTCGACTGCTGCACAGTTCAACATTGGCGTCAAGGTGGTTGTGCTCAACAACGAGGAGCAGGGCATGGTGACGCAGTGGCAGAACCTCTTTTACGAGGACCGATATGCCCACACGCACCAGAAGAACCCCGACTTCATGAAGCTGGCCGACGCCATGGGCGTTCAGCACCAGCGCGTGACGGAGCCGGAGAAGCTGGTCGATGCCCTGACGTGGCTGATCAACACCGATGGCCCGGCCCTGTTGGAGGTTGTCACGGACAAGAAGGTGCCTGTCCTGCCCATGGTGCCCGCCGGATCGGCCCTGCACGAGTTCCTCGTCTTTGAACCTGGTGAGTCTACTTCAGACATATTGCTTGCGCATTGCAGATACTAACACTCTCACAGAAAAGGATAAGCAGCGCCGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGGGTGTGCACTCCTAAAGCGATGATGTCTGCGAGGGGTTCTTCGTTGAACCCTAGTTCAGGCACCATCTTACCCTCTTATTTTTTCCCGTGGGCTTTCATTTTGTGTCATCCGAGCATGACGTTGTAGGGTTGGAGTTTCTTCCTTTTTATCTTGTCATTTACTGGTACCCATAGGCGCGAGACTAGGCTTCCATGTTTTGTTTTGCGACTTTCAAAAAGTACTTTTAGTGGTTTGGGGCACGACGAGGGGGGGCAACCTCTTCTGTCGAAAAAGGTGGCTGGATGGATGAGATGAGATGAGATGAGGGTGAAGATAGATACCTGCAGTGTTTTTGACGCGACGGGATGGCGATCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGATATGATTATTGATGAACCGGACAAAAGGGGGTAGGGGATTGATGCCATCACGACCGATTGACCAGACCTGGATTCTCGCACAGCATGGCTGCTGATTTTGTTGACCTTGCGACGTAACATCCCTGAAGAACAACCTACTATTAACCTATCATTTAGCAGAAGCTCTGTAACCTTCTTGATTCTTGTATTCAGCTTCTGAGTCTGTCAAATGTAATCATTTCGAGGTTGTGTAATTCCGGCCAAGCAGGCGGCCGTCTGCCAGCGCCTGCCTAGGCTGCACCGCAATCTGCCCAATCAGCTGCCCTTCAGTTTCGTTTGACCTTGCAGCTGCCCTTCATCCTTTATCTGCACACAATTCTTTTTCCTCTGCTCTGCGCATTCTTCTCTCTCTCGTCTCCCTTCTCAAGCTCAACTTCACCTCATCCGCTCCACTACAAGCCCTCCCGTCGTCGTCTCGCATCCTCATCTCGACTGCGGCCAGCAAAACAAGCAAAGCCGTGATCGATCCTCAGCATGGCTACCTTCAACCTCACCGTCCGCCTGGAGATGCTCAAAGAAATTGGAATCACCGTCCAATACGGCGAGCATGTAGCGAAAGAAGCAGCCAGCAACGAAGCAGCGATGGCATTCGAAGAAGAAGAAGAGTTCCCCGCCGTTGTGCCGCCCAAGGCAGAACAGCACGCCTCTGAACACGACGCTGGCCACGATGCTTGGGACGCGGCTGCCCACATCTCGACTTCGGCGCAAGAACAGCAGAAGCCCCAGGAGATGGACGACTCGTCTATCGTGATGCCGCTGGACTACTCCAAGTTTGTCGTTGGAGAGCCTGCGGACGAATCCATCAGCTTTTGCTCGTGGAAGGTCGTCGAGGCTTATCCTGACCAGTTTATCGGCAAGGCAAACAGGCCTCGTGTATGTAGCGATTGCTTTCTCTGCATTATGGGAATCTCAAGAGAGTATGGTAGAAGATAACTGACAACTTGCAGGCCAAGCCGTACTTTGACAAGATTTTGGAAGACAGAGTCTGGGATTTGTGAGGATCTTGATTGATGTGCATATGGCGACATGCCTGCTAATATCATTGTAGCTTCTATCTCTACAACCCCGAGAAGCCTTCAGAGAAGCCTCGCGTGCTGGTGCCCACTGTTCAGCTCGAAGGCTTTCTCAAAAGCATCAACAGAGCGCTCGGTACTTCTCTCACCATTCCAGGAGGGGCAAACCAGGACCGTTTTTATCTGAGGTTCGGCCAGGGAGACACCCCAAGGCCTCGATATCTACAGAGGTCGAGAGACCAGAAATCCCTAAAGATTGAAACGTTCCCCGATTTTCAACAGGCGGACTACGACAGCTTTAGGAACGCGCATGGCGCCATCCAGGAGGACTGGTTGAAGAACTGGCAGATGCTGGTACCTCGGCCGAGTTTCGACAAGAAGAAAAATGCAGACAAAAGAGCAGCCAAGAGAAGGCTCGAGCGAGAGCGAATGCTTCACAATACGCAGGAATTTCTTCATTTGGCAGGTAAGGGCAAAGGGGCTGACGTGG.

由里氏木霉Δku80quad缺失衍生菌株产生Archy2菌株。从ku80敲除菌株缺失掉pyr2基因。pyr2缺失盒含有被5′和3′pyr2序列侧接的里氏木霉cbh1启动子、潮霉素抗性基因和部分amdS选择性标记，如图3中示意性显示。使用这个载体可以筛选对pyr2敲除转化株的潮霉素和氟乳清酸的抗性。该部分amdS基因含有该基因的3'部分，但缺乏启动子和该编码区的氨基末端部分，因而是无功能的。敲除盒的核苷pyr2酸序列的长度为9259个碱基对：碱基1-1994对应于pyr23'同源区；碱基2002-3497对应于里氏木霉cbh1启动子；碱基3563-5449对应于潮霉素抗性选择性标记；碱基5450-7440对应于构巢曲霉amdS3'部分标记；碱基7441-9259对应于pyr2 5'同源区。pyr2敲除盒的核苷酸序列以SEQ ID NO:39提供：

ATCACGCCCTCGCATAAAAGACCCTCAAGAGTCCATGTGCCCTATCTGCCTGATCTTCCTAACCCTTATTTAACATTGGCCCTATCACAACCTAGTTCTTCTTCAGCCTGCTTTGTCAACACTTGTCACGGTTCAACTCAACGTAATCAGCAGGTAGCAGGACGAGGATAGGGAGAGAAACGAAGAGAAGAAGAGGAGAGAGGAAGAAAAAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGGGAAAAGGAAAGAAGGAGGAAAAGAGAAGAAAGTCAGATGAAGAAGCAAGAAGACGCCATGGTAGCCACCGCTTGTCAGGGCTCCTTAGCAACGAACAACTCTAGCTTGGGGACTTGTCGATGTGTCGTTTCCTTCCTACCCATCAGCACCAACGATGAGTTCGATATAGACGAGGACCTCATGGAAGTAGAGACCATTGGGTTCGACAGGATCTCTCAGTTTCACTTCTATGAGGTCTGTCGCTCGGATGACTTTTTGAGGAGCTTCCCCTTCTGCTTCAACCCCAAACTCTCTTTCCTGAAACCGCAGCACGTTGGCACGGCCGTGTTGCTGGAGCAGTTTGCTTTCGAGCACTCTCAGCGTGGTTTCAGCAGCCCACTGGTGAGTGGCCTCCTTTGACGTCCACACCTTGCTCCTGTCGCATGCGTATCTGGTGGGAACGACTGCTCCAAGGAGGATTGCTAACGAGGTTGTAGGCCGAATATCGCATCAGATTCTCCGGTAACCTTAGCTACGGCCTCTTCAACATCTGTGACATGACGGAGCGCAAGTACTGGTGGTTGGCGACCAAGATGCGCGGCTGGAACATCGACGGCTGCCCCGAAGACGTCAGGAGACTCATGTTTGTTCACATCATCGCCACCCTGGGATGCAGCCCCGTCGTGACGGATGAAGACATGGACTACCCCAAGAACTGGGCGGCAATTCTCCACGGTAGAGACAGATATCCGAGTGAACCTGTGGGCCACCGGCCTCATGGGCGCACCATCTGCCTCCACTCGGTGGCCGTCTGCCCTCGTCTCCAGGGCTTGGGTCTCGGTACTGCGACTCTGAAGTCGTATGTGCAGCGCATGAACAGCCTCGGCGCCGCGGACCGTGTTGCTCTCGTTTGCCGCAAGCCCGAGACGAGATTTTTTGAAAGATGCGGCTTCAGGAACAGCGGCCGGAGTAGTATCAAGACTCTGGTCGGCGAATACTACAACATGGTGTGTGCTTCCACATCGACTTGGCCAGACTCTATACGATTTTCAAACCTCGCTATACGTCATATTGACTTGTTTCTTTAGGTCTTCGATTTGCCCGGGCCCAAAGACTTTATCGACTGGAATAGCATTGCCGACGCTGCCAAGAAGATGTGAACCATTTGACTGATACGATGTGTGCTACGCATGTCGACCTTCTTTGTTTGTTTCTTTGGCGGCTCTTTGTATACCTTGGGACACGGCAGACGCATGTCTATGTGAAGAAAACGTTCACGGCGCTGTTTGCATCAGGAATATGATCATTAAACATGGAGCGTAATGGTATTAATGATCAACTAGAAAAATGGTATGGAAGGGCGAGAGGGCGATCAACAAAGCAGCCCGGGGCATAGTCTGGAAGCAGCAGGAATTGGAAGGGAAAAGGAAGCTGCACAATGAAGGGATATCGTGAGCGGAGTGGCTCACGAGAGTATCAACAGACTGGCGAAAGCAAGCAATTGCCAACGCCGGCTATTAGGCCATAAGATGGCCTGTTGTGAGTCCCAGTTGCACGTATCCCCATATGACTGCTCTGTCGCTGACTTGAAAAAAAATAGGGAGGATAAAGGAGAAAGAAAGTGAGACAACCCGTGAGGGACTTGGGGTAGTAGGAGAACACATGGGCAACCGGGCAATACACGCGATGTGAGACGAGTTCAACGGCGAATGGAAAATCTTGAAAAACAAAATAAAATAACTGCCCTCCATACGGGTATCAAATTCAAGCAGTTGTACGGAGGCTAGCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACACCTCGTGCTAGACTAGGCGCGCCAGGAAGCCCGGAAGGTAAGTGGATTCTTCGCCGTGGCTGGAGCAACCGGTGGATTCCAGCGTCTCCGACTTGGACTGAGCAATTCAGCGTCACGGATTCACGATAGACAGCTCAGACCGCTCCACGGCTGGCGGCATTATTGGTTAACCCGGAAACTCAGTCTCCTTGGCCCCGTCCCGAAGGGACCCGACTTACCAGGCTGGGAAAGCCAGGGATAGAATACACTGTACGGGCTTCGTACGGGAGGTTCGGCGTAGGGTTGTTCCCAAGTTTTACACACCCCCCAAGACAGCTAGCGCACGAAAGACGCGGAGGGTTTGGTGAAAAAAGGGCGAAAATTAAGCGGGAGACGTATTTAGGTGCTAGGGCCGGTTTCCTCCCCATTTTTCTTCGGTTCCCTTTCTCTCCTGGAAGACTTTCTCTCTCTCTCTTCTTCTCTTCTTCCATCCTCAGTCCATCTTCCTTTCCCATCATCCATCTCCTCACCTCCATCTCAACTCCATCACATCACAATCGATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCTCCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACTTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATTGTGACACAGCTTCTCACAGAGTGAGAATGAAAAGTTGGACTCCCCCTAATGAAGTAAAAGTTTCGTCTCTGAACGGTGAAGAGCATAGATCCGGCATCAACTACCTGGCTAGACTACGACGTCAATTCTGCGGCCTTTTGACCTTTATATATGTCCATTAATGCAATAGATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCAATTTCGCAGATCAAAGTGGACGTTATAGCATCATAACTAAGCTCAGTTGCTGAGGGAAGCCGTCTACTACCTTAGCCCATCCATCCAGCTCCATACCTTGATACTTTAGACGTGAAGCAATTCACACTGTACGTCTCGCAGCTCTCCTTCCCGCTCTTGCTTCCCCACTGGGGTCCATGGTGCGTGTATCGTCCCCTCCACAATTCTATGCCATGGTACCTCCAGCTTATCAATGCCCCGCTAACAAGTCGCCTCTTTGCCTTGATAGCTTATCGATAAAACTTTTTTTCCGCCAGAAAGGCTCCGCCCACAGACAAGAAAAAAAATTCACCGCCTAGCCTTTGGCCCCGGCATTTGGCTAAACCTCGAGCCTCTCTCCCGTCTTGGGGTATCAGGAAGAAAAGAAAAAAATCCATCGCCAAGGGCTGTTTTGGCATCACCACCCGAAAACAGCACTTCCTCGATCAAAAGTTGCCCGCCATGAAGACCACGTGGAAGGACATCCCTCCGGTGCCTACGCACCAGGAGTTTCTGGACATTGTGCTGAGCAGGACCCAGCGCAAACTGCCCACTCAGATCCGTGCCGGCTTCAAGATTAGCAGAATTCGAGGTACGTCGCATTGCCCATCGCAGGATGTCTCATTATCGGGGTCCTTGGAGAACGATCATGATTGCATGGCGATGCTAACACATAGACAGCCTTCTACACTCGAAAGGTCAAGTTCACCCAGGAGACGTTTTCCGAAAAGTTCGCCTCCATCCTCGACAGCTTCCCTCGCCTCCAGGACATCCACCCCTTCCACAAGGACCTTCTCAACACCCTCTACGATGCCGACCACTTCAAGATTGCCCTTGGCCAGATGTCCACTGCCAAGCACCTGGTCGAGACCATCTCGCGCGACTACGTCCGTCTCTTGAAATACGCCCAGTCGCTCTACCAGTGCAAGCAGCTCAAGCGGGCCGCTCTCGGTCGCATGGCCACGCTGGTCAAGCGCCTCAAGGACCCCCTGCTGTACCTGGACCAGGTCCGCCAGCATCTCGGCCGTCTTCCCTCCATCGACCCCAACACCAGGACCCTGCTCATCTGCGGTTACCCCAATGTTGGCAAGTCCAGCTTCCTGCGAAGTATCACCCGCGCCGATGTGGACGTCCAGCCCTATGCTTTCACCACCAAGAGTCTGTTTGTCGGCCACTTTGACTACAAGTACCTGCGATTCCAGGCCATTGATACCCCCGGTATTCTGGACCACCCTCTTGAGGAGATGAACACTATCGAAATGCAGAGGTATGTGGCGCGGCTA.

由Archy2里氏木霉菌株产生Archy3菌株。用载体转化Archy2菌株，以在相同的pyr2基因座整合且用pyr2基因的编码区替换潮霉素抗性基因。潮霉素缺失盒在图4中显示。这种将pyr2基因再引入回到pyr2基因座中的做法，使pyr2基因被置于里氏木霉cbh1启动子和部分amdS选择性标记之间。可对这个菌株进行尿苷原养型和潮霉素敏感性选择。hygR敲除盒的核苷酸序列的长度为9088碱基对：碱基1-1994对应于pyr2 3'同源区；碱基1995-3497对应于里氏木霉cbh1启动子；碱基3564-5137对应于pyr2选择性标记；碱基5280-7270对应于构巢曲霉amdS3'部分标记；碱基7271-9088对应于pyr2 5'同源区。hygR敲除盒的核苷酸序列以SEQ ID NO:40提供：

ATCACGCCCTCGCATAAAAGACCCTCAAGAGTCCATGTGCCCTATCTGCCTGATCTTCCTAACCCTTATTTAACATTGGCCCTATCACAACCTAGTTCTTCTTCAGCCTGCTTTGTCAACACTTGTCACGGTTCAACTCAACGTAATCAGCAGGTAGCAGGACGAGGATAGGGAGAGAAACGAAGAGAAGAAGAGGAGAGAGGAAGAAAAAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGGGAAAAGGAAAGAAGGAGGAAAAGAGAAGAAAGTCAGATGAAGAAGCAAGAAGACGCCATGGTAGCCACCGCTTGTCAGGGCTCCTTAGCAACGAACAACTCTAGCTTGGGGACTTGTCGATGTGTCGTTTCCTTCCTACCCATCAGCACCAACGATGAGTTCGATATAGACGAGGACCTCATGGAAGTAGAGACCATTGGGTTCGACAGGATCTCTCAGTTTCACTTCTATGAGGTCTGTCGCTCGGATGACTTTTTGAGGAGCTTCCCCTTCTGCTTCAACCCCAAACTCTCTTTCCTGAAACCGCAGCACGTTGGCACGGCCGTGTTGCTGGAGCAGTTTGCTTTCGAGCACTCTCAGCGTGGTTTCAGCAGCCCACTGGTGAGTGGCCTCCTTTGACGTCCACACCTTGCTCCTGTCGCATGCGTATCTGGTGGGAACGACTGCTCCAAGGAGGATTGCTAACGAGGTTGTAGGCCGAATATCGCATCAGATTCTCCGGTAACCTTAGCTACGGCCTCTTCAACATCTGTGACATGACGGAGCGCAAGTACTGGTGGTTGGCGACCAAGATGCGCGGCTGGAACATCGACGGCTGCCCCGAAGACGTCAGGAGACTCATGTTTGTTCACATCATCGCCACCCTGGGATGCAGCCCCGTCGTGACGGATGAAGACATGGACTACCCCAAGAACTGGGCGGCAATTCTCCACGGTAGAGACAGATATCCGAGTGAACCTGTGGGCCACCGGCCTCATGGGCGCACCATCTGCCTCCACTCGGTGGCCGTCTGCCCTCGTCTCCAGGGCTTGGGTCTCGGTACTGCGACTCTGAAGTCGTATGTGCAGCGCATGAACAGCCTCGGCGCCGCGGACCGTGTTGCTCTCGTTTGCCGCAAGCCCGAGACGAGATTTTTTGAAAGATGCGGCTTCAGGAACAGCGGCCGGAGTAGTATCAAGACTCTGGTCGGCGAATACTACAACATGGTGTGTGCTTCCACATCGACTTGGCCAGACTCTATACGATTTTCAAACCTCGCTATACGTCATATTGACTTGTTTCTTTAGGTCTTCGATTTGCCCGGGCCCAAAGACTTTATCGACTGGAATAGCATTGCCGACGCTGCCAAGAAGATGTGAACCATTTGACTGATACGATGTGTGCTACGCATGTCGACCTTCTTTGTTTGTTTCTTTGGCGGCTCTTTGTATACCTTGGGACACGGCAGACGCATGTCTATGTGAAGAAAACGTTCACGGCGCTGTTTGCATCAGGAATATGATCATTAAACATGGAGCGTAATGGTATTAATGATCAACTAGAAAAATGGTATGGAAGGGCGAGAGGGCGATCAACAAAGCAGCCCGGGGCATAGTCTGGAAGCAGCAGGAATTGGAAGGGAAAAGGAAGCTGCACAATGAAGGGATATCGTGAGCGGAGTGGCTCACGAGAGTATCAACAGACTGGCGAAAGCAAGCAATTGCCAACGCCGGCTATTAGGCCATAAGATGGCCTGTTGTGAGTCCCAGTTGCACGTATCCCCATATGACTGCTCTGTCGCTGACTTGAAAAAAAATAGGGAGGATAAAGGAGAAAGAAAGTGAGACAACCCGTGAGGGACTTGGGGTAGTAGGAGAACACATGGGCAACCGGGCAATACACGCGATGTGAGACGAGTTCAACGGCGAATGGAAAATCTTGAAAAACAAAATAAAATAACTGCCCTCCATACGGGTATCAAATTCAAGCAGTTGTACGGAGGCTAGATAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACACCTCGTGCTAGACTAGGCGCGTCAATATGTGGCCGTTACTCGAGTTTATAAGTGACAACATGCTCTCAAAGCGCTCATGGCTGGCACAAGCCTGGAAAGAACCAACACAAAGCATACTGCAGCAAATCAGCTGAATTCGTCACCAATTAAGTGAACATCAACCTGAAGGCAGAGTATGAGGCCAGAAGCACATCTGGATCGCAGATCATGGATTGCCCCTCTTGTTGAAGATGAGAATCTAGAAAGATGGCGGGGTATGAGATAAGAGCGATGGGGGGGCACATCATCTTCCAAGACAAACAACCTTTGCAGAGTCAGGCAATTTTTCGTATAAGAGCAGGAGGAGGGAGTCCAGTCATTTCATCAGCGGTAAAATCACTCTAGACAATCTTCAAGATGAGTTCTGCCTTGGGTGACTTATAGCCATCATCATACCTAGACAGAAGCTTGTGGGATACTAAGACCAACGTACAAGCTCGCACTGTACGCTTTGACTTCCATGTGAAAACTCGATACGGCGCGCCTCTAAATTTTATAGCTCAACCACTCCAATCCAACCTCTGCATCCCTCTCACTCGTCCTGATCTACTGTTCAAATCAGAGAATAAGGACACTATCCAAATCCAACAGAATGGCTACCACCTCCCAGCTGCCTGCCTACAAGCAGGACTTCCTCAAATCCGCCATCGACGGCGGCGTCCTCAAGTTTGGCAGCTTCGAGCTCAAGTCCAAGCGGATATCCCCCTACTTCTTCAACGCGGGCGAATTCCACACGGCGCGCCTCGCCGGCGCCATCGCCTCCGCCTTTGCAAAGACCATCATCGAGGCCCAGGAGAAGGCCGGCCTAGAGTTCGACATCGTCTTCGGCCCGGCCTACAAGGGCATCCCGCTGTGCTCCGCCATCACCATCAAGCTCGGCGAGCTGGCGCCCCAGAACCTGGACCGCGTCTCCTACTCGTTTGACCGCAAGGAGGCCAAGGACCACGGCGAGGGCGGCAACATCGTCGGCGCTTCGCTCAAGGGCAAGAGGGTCCTGATTGTCGACGACGTCATCACCGCCGGCACCGCCAAGAGGGACGCCATTGAGAAGATCACCAAGGAGGGCGGCATCGTCGCCGGCATCGTCGTGGCCCTGGACCGCATGGAGAAGCTCCCCGCTGCGGATGGCGACGACTCCAAGCCTGGACCGAGTGCCATTGGCGAGCTGAGGAAGGAGTACGGCATCCCCATCTTTGCCATCCTCACTCTGGATGACATTATCGATGGCATGAAGGGCTTTGCTACCCCTGAGGATATCAAGAACACGGAGGATTACCGTGCCAAGTACAAGGCGACTGACTGATTGAGGCGTTCAATGTCAGAAGGGAGAGAAAGACTGAAAAGGTGGAAAGAAGAGGCAAATTGTTGTTATTATTATTATTCTATCTCGAATCTTCTAGATCTTGTCGTAAATAAACAAGCGTAACTAGCTAGCCTCCGTACAACTGCTTGAATTTGATACCCGTATGGAGGGCAGTTATTTTATTTTGTTTTTCAAGATTTTCCATTCGCCGTTGAACTCGTCTCACATCGCGTGTATTGCCCGGTTGCCCATGTGTACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTAGTGATTTTACCGCTGATGAAATGACTGGACTCCCTCCTCCTGCTCTTATACGAAAAATTGCCTGACTCTGCAAAGGTTGTTTGTCTTGGAAGATGATGTGCCCCCCCATCGCTCTTATCTCATACCCCGCCATCTTTCTAGATTCTCATCTTCAACAAGAGGGGCAATCCATGATCTGCGATCCAGATGTGCTTCTGGCCTCATACTCTGCCTTCAGGTTGATGTTCACTTAATTGGTGACGAATTCAGCTGATTTGCTGCAGTATGCTTTGTGTTGGTTCTTTCCAGGCTTGTGCCAGCCATGAGCGCTTTGAGAGCATGTTGTCACTTATAAACTCGAGTAACGGCCACATATTGTTCACTACTTGAATCACATACCTAATTTTGATAGAATTGACATGTTTAAAGAGCTGAGGTAGCTTTAATGCCTCTGAAGTATTGTGACACAGCTTCTCACAGAGTGAGAATGAAAAGTTGGACTCCCCCTAATGAAGTAAAAGTTTCGTCTCTGAACGGTGAAGAGCATAGATCCGGCATCAACTACCTGGCTAGACTACGACGTCAATTCTGCGGCCTTTTGACCTTTATATATGTCCATTAATGCAATAGATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCAATTTCGCAGATCAAAGTGGACGTTATAGCATCATAACTAAGCTCAGTTGCTGAGGGAAGCCGTCTACTACCTTAGCCCATCCATCCAGCTCCATACCTTGATACTTTAGACGTGAAGCAATTCACACTGTACGTCTCGCAGCTCTCCTTCCCGCTCTTGCTTCCCCACTGGGGTCCATGGTGCGTGTATCGTCCCCTCCACAATTCTATGCCATGGTACCTCCAGCTTATCAATGCCCCGCTAACAAGTCGCCTCTTTGCCTTGATAGCTTATCGATAAAACTTTTTTTCCGCCAGAAAGGCTCCGCCCACAGACAAGAAAAAAAATTCACCGCCTAGCCTTTGGCCCCGGCATTTGGCTAAACCTCGAGCCTCTCTCCCGTCTTGGGGTATCAGGAAGAAAAGAAAAAAATCCATCGCCAAGGGCTGTTTTGGCATCACCACCCGAAAACAGCACTTCCTCGATCAAAAGTTGCCCGCCATGAAGACCACGTGGAAGGACATCCCTCCGGTGCCTACGCACCAGGAGTTTCTGGACATTGTGCTGAGCAGGACCCAGCGCAAACTGCCCACTCAGATCCGTGCCGGCTTCAAGATTAGCAGAATTCGAGGTACGTCGCATTGCCCATCGCAGGATGTCTCATTATCGGGGTCCTTGGAGAACGATCATGATTGCATGGCGATGCTAACACATAGACAGCCTTCTACACTCGAAAGGTCAAGTTCACCCAGGAGACGTTTTCCGAAAAGTTCGCCTCCATCCTCGACAGCTTCCCTCGCCTCCAGGACATCCACCCCTTCCACAAGGACCTTCTCAACACCCTCTACGATGCCGACCACTTCAAGATTGCCCTTGGCCAGATGTCCACTGCCAAGCACCTGGTCGAGACCATCTCGCGCGACTACGTCCGTCTCTTGAAATACGCCCAGTCGCTCTACCAGTGCAAGCAGCTCAAGCGGGCCGCTCTCGGTCGCATGGCCACGCTGGTCAAGCGCCTCAAGGACCCCCTGCTGTACCTGGACCAGGTCCGCCAGCATCTCGGCCGTCTTCCCTCCATCGACCCCAACACCAGGACCCTGCTCATCTGCGGTTACCCCAATGTTGGCAAGTCCAGCTTCCTGCGAAGTATCACCCGCGCCGATGTGGACGTCCAGCCCTATGCTTTCACCACCAAGAGTCTGTTTGTCGGCCACTTTGACTACAAGTACCTGCGATTCCAGGCCATTGATACCCCCGGTATTCTGGACCACCCTCTTGAGGAGATGAACACTATCGAAATGCAGAGGTATGTGGCGCGGCT.

实例2：具有添加的糖基化位点的漆酶变体

在齿毛菌属漆酶D多肽的表面上工程构建了七个糖基化位点。简单地讲，制备了七对寡核苷酸以供在标准技术中使用，以参照SEQ ID NO:11而言在指定的位置处引入以下氨基酸残基变化：残基12-14处NKD变化为NAT（变体mut1），残基28-30处GGT变化为NGT（变体mut2），残基47-49处NVI变化为NVT（变体mut3），残基157-159处QTV变化为NTT（变体mut4），残基317-319处NAV变化为NAT（变体mut5），残基362-364处NAQ变化为NAS（变体mut6），以及残基492-494处SAS变化为NAS（变体mut7）。PCT介导的诱变反应在50μl反应体积中含有2μl的模板质粒DNA（即pKB409，其是包括编码木霉属CBH1基因信号序列和成熟齿毛菌属漆酶D1蛋白的核苷酸序列、不含amdS标记的pENTR质粒；5ng/μl）、5μl的标准10x缓冲液、1.5μl的100mM dNTPs、1.25μl的100ng/μl正向引物、1.25μl的100ng/μl反向引物和1μl的Pfu UltraII聚合酶（Stratagene公司，美国加州拉霍亚市(La Jolla)）。用DpnI限制酶(Roche)消化PCR产物，将每个含有带切口的质粒DNA的混合物各5μl转化到大肠杆菌(E.coli)细胞中。从每个转化株制备DNA，通过DNA测序确认经工程构建的核苷酸变化。

然后使用gateway克隆方法，在含有0.5μl的质粒DNA、0.5μl的pTrex3g、3μl的TE缓冲液和1μl的LRII混合物(Invitrogen)的反应中室温下反应一小时，将突变的编码序列克隆到表达质粒pTrex3g中，然后转化到大肠杆菌细胞中。pTrex3g（在美国专利公开第20100304468号中描述）基于大肠杆菌载体pSL1180（Pharmacia Inc.公司，美国新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway)），后者是基于pUC118噬菌粒的载体（Brosius,J.(1989)DNA8:759)，具有含64个六聚体限制酶识别序列的扩展多克隆位点。该载体被设计为Gateway目的载体（Hartley等人，(2000)，《基因组研究》(Genome Research)，10:1788-95），以便使用Gateway技术(Invitrogen)在里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子区域之间插入任何所需的开放阅读框。该载体还含有用作选择性标记的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS基因。对从每个转化株制备的DNA进行核苷酸序列分析，以确认经工程构建的核苷酸变化。

使用七个变体编码序列中的每一个作为模板，进行了三至六次100μlPCR复制。使用所得的PCR片段转化里氏木霉的Archy3菌株。简单地讲，将冷冻的Archy3菌株原生质体在冰上解冻，取100μl等分试样转移到各个15ml管中。每个PCR片段取5-15μl分别加到原生质体，将该DNA和原生质体的混合物在冰上放置20分钟。然后将2ml的FF4[25%PEG6000、50mM CaCl和10mM Tris(pH7.5)]缓冲液加到每个原生质体管，接着在室温下温育5分钟。加入4ml的FF3[1.2M山梨糖醇、10mM CaCl和10mM Tris(pH7.5)]，将整个内容物转移到新管以等量分配到两个培养皿上。将25ml覆盖物[amdS-山梨糖醇-琼脂糖(2%)+尿苷(0.5mg/ml)]覆盖在每个平板上，然后在28℃下温育5-6天。有关在工业上重要的丝状真菌的转化中使用amdS标记系统的详细方法是本领域确立的（例如，在黑曲霉(Aspergillus niger)中（参见例如Kelly和Hynes，(1985)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，4:475-79；Wang等人，(2008)，《真菌遗传生物学》(Fungal Genet Biol.)，45:17-27）；在产黄青霉(Penicillium chrysogenum)中（参见例如Beri和Turner，(1987)，《当代遗传学》(Curr.Genet.)，11:639-41）；在里氏木霉(Trichoderma reesei)中（参见例如Pentilla等人，(1987)，《基因》(Gene)61:155-64）；在米曲霉(Aspergillus oryzae)（参见例如Christensen等人，(1988)，《生物技术》(Bio/technology)，6:1419-22）；在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)中（参见例如Pe'er等人，(1991)，《土壤生物学和生物化学》(Soil Biol.Biochem.)，23:1043-46）；以及在美国专利第6,548,285号中；将每个文献和专利以引用方式并入本文。

对于每个转化，选择五个菌落并转移到含有1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的常规马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板。将具有表达野生型漆酶的整合质粒的Archy3菌株用作对照。将各个板在28℃下培养2天，然后置于室温下一天以促进孢子形成。将全部五个克隆转移到96孔微量滴定过滤板(MTP,Corning3505)，该板充有200μl的含葡萄糖/槐糖的成分确定培养基（33.0g/L PIPPS缓冲液；9.0g/L酪蛋白氨基酸；5.0g/L(NH4)2SO4；4.5g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；1.0g/L CaCl₂；26ml/L60%葡萄糖/槐糖混合物；2.5ml/L400X里氏木霉痕量元素：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/L ZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3；和0.5mg/ml尿苷；pH5.5）。将MTP过滤板在恒定供氧和不加振摇的情况下于28℃培养5天。将10μl的5天龄液体培养物转移到新的板，加入150μl100mM NaOAc,pH5和20μl4.5mM ABTS。

使用Spectra Max分光光度计以20秒间隔测量OD₄₂₀5分钟。图5的柱状图中显示了含转化有七种糖基化突变体中的每一种的丝状真菌的液体培养物中存在的漆酶活性。这个和其他柱状图中的误差条表示标准偏差。基于平均漆酶活性，其中NAQ改变为NAS的Mut6与野生型相比显示出漆酶活性平均提高7%，尽管误差条提示该差异可能不显著。

实例3：具有另外的带正电荷或者带负电荷的氨基酸残基的漆酶变体

在齿毛菌属(Cerrena)漆酶的表面上引入了五个带正电荷或者带负电荷的氨基酸残基。简单地讲，制备了十对寡核苷酸（即正向引物和反向引物），以在指定的位置处（参照SEQ ID NO:11）引入以下氨基酸残基变化：Q21E（变体S1）、N130E（变体S2）、T232E（变体S3）、N335E（变体S4）、Q479E（变体S5）、Q21R（变体S6）、N130R（变体S7）、T232R（变体S8）、N335R（变体S9）和Q479R（变体S10）。PCR介导的诱变、大肠杆菌的转化以及突变的验证按实例2进行。

如实例2，使用PCR片段转化里氏木霉的Archy3菌株。选择转化株并转移到含有1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的amdS平板（同上），并在28℃下培养2天。对于每个变体，选择四个菌株并转移到含有1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA平板。将具有表达野生型漆酶的整合质粒的Archy3菌株用作对照。将各个板在28℃下培养1天，然后置于室温下3天以促进孢子形成。将全部克隆转移到充有200μl的含葡萄糖/槐糖和0.5mg/ml尿苷的NREL确定成分培养基的96孔微量滴定过滤板(MTP,Corning3505)。将MTP过滤板在恒定供氧和不加振摇的情况下于28℃培养5天。将10μl的5天龄液体培养物转移到新的板，加入150μl100mMNaOAc,pH5和20μl4.5mM ABTS。

如实例2测量OD₄₂₀。结果在图6（变体S1至S5，其包括中性氨基酸残基改变为带负电荷的残基）和图7（变体S7至S10，其包括中性氨基酸残基改变为带正电荷的残基）中显示。变体S2与野生型相比显示出漆酶活性提高17%。变体S9与野生型相比显示出漆酶活性提高10%，尽管这后一差异可能不显著。

实例4：位点评估文库#1(SEL1)变体

选择位于齿毛菌属漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基(I265)进行进一步的工程改造。简单地讲，制备出一对覆盖I265密码子的互补寡核苷酸引物，并用于在这个位置引入氨基酸残基变化。PCR介导的诱变反应如实例2进行。将PCR产物用DpnI限制酶在37℃下消化2小时，用Qiagen柱进行纯化。然后使用gateway克隆方法，在含有3μl的PCR产物、0.5μl的pTrex3g、0.5μl的TE缓冲液和1μl的LRII混合物(Invitrogen)的反应中室温下温育一小时，将SEL文库变体克隆到表达质粒pTrex3g中。将该混合物转化到大肠杆菌细胞中。

从28个克隆制备DNA并进行DNA序列分析。共获得13个变体。位置265处的密码子和相应的氨基酸残基在图8中列出。该13个变体中的每一个取5μl DNA合并在一起用作DNA模板以供进行PCR片段扩增。制备十管的100μl PCR混合物，如实例2用于转化里氏木霉的Archy3菌株，例外的是在28℃下温育24小时后，加入10ml的含有1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的覆盖物。选择转化株并转移到两个充有1ml的含1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA的48孔微量滴定过滤板(MTP)。将MTP在28℃下培养2天，然后置于室温下2天以促进孢子形成。将全部克隆分别转移到一个96孔过滤板并温育5天。如实例2进行ABTS测定。图9显示了所筛选的全部88个转化株的ABTS活性测定结果。所述变体漆酶序列的身份在筛选时未知，因此X轴没有代号。选择了六个显示较高的ABTS活性的克隆作进一步研究，因此将来自过滤板的相应菌丝体在YEG中培养以便提取基因组DNA。使用与氨基酸位置265对应的密码子的两个侧翼引物扩增600bp片段。将PCR片段进行测序以鉴定所存在的突变。图10显示了产生最高的漆酶表达或者活性的变体，即I265R、I265H和I265V。

实例5：位点评估文库#2(SEL2)变体

选择位于齿毛菌属漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基(V287)进行进一步的工程改造。简单地讲，制备出覆盖V287密码子的成对互补引物，并用于引入氨基酸残基变化。按与实例4中描述的SEL1变体相同的方式产生SEL2文库变体，例外的是将全部大肠杆菌转化株合并，从合并的大肠杆菌细胞提取质粒，用作混合的DNA模板进行PCR片段扩增。

制备了十管的100μl PCR反应物，如实例4将PCR片段转化到里氏木霉的Archy3菌株中。选择转化株并转移到充有0.2ml的含1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA的96孔MTP。将MTP在28℃下培养2天，然后置于室温下3天以促进孢子形成。使用适于96孔板的金属复制器(Boekel)，将全部克隆转移到96孔过滤板。将该过滤板温育5天，如实例2进行ABTS测定。图11显示了所筛选的全部88个转化株的ABTS活性测定结果。如实例4，所述变体漆酶序列的身份在筛选时未知，因此X轴没有代号。

使用来自该过滤板的5天龄菌丝体制备基因组DNA，并进行DNA序列分析。总共鉴定了14个变体，即V287A、V287D、V287E、V287F、V287G、V287H、V287L、V287N、V287P、V287Q、V287R、V287S、V287T和V287W。图12显示了从三个最好的变体即B1、C2和G3获得的数据，其中B1包括V287P突变，C2包括V287H突变以及另一可能是因为PCR错误造成的突变(F68L)，G3包括V287G突变。

实例6：位点评估文库#3(SEL3)变体

选择位于齿毛菌属漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基(V319)进行进一步的工程改造。简单地讲，制备出覆盖V319密码子的称对互补引物，并用于引入氨基酸残基变化。按与实例4中SEL1变体相同的方式产生SEL3文库变体，例外的是将全部大肠杆菌菌落进行DNA序列分析。将17个变体的大肠杆菌培养物合并，提取质粒DNA。图13列出所鉴定的17个变体。然后将该DNA用作PCR的模板，并如实例4将PCR片段转化到里氏木霉的Archy3菌株中。

使用菌落采集器(CP-7200,Norgren Systems)，选择65个转化株并转移到充有0.2ml的含1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA的96孔MTP。将MTP在28℃下温育2天，然后置于室温下3天以促进孢子形成。将全部克隆转移到一个96孔过滤板并温育5天。如实例2进行ABTS测定。图14显示了全部65个转化株的ABTS活性。选择四个显示较高的ABTS的转化株作进一步分析，并如实例4鉴定突变。图15显示了产生最高的漆酶表达或者活性的变体，即V319W和V319T。

实例7：位点评估文库#4(SEL4)变体

选择位于齿毛菌属漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基(V293)进行进一步的工程改造。简单地讲，制备出覆盖V293密码子的成队互补引物，并用于引入氨基酸残基变化。按与实例4中SEL1变体相同的方式产生SEL4文库变体。将来自大肠杆菌菌落的DNA进行DNA序列分析。将来自16个不同的变体中的每一个变体的DNA在分别的PCR反应中用作模板。对于每个变体，进行了三个管的100μl PCR反应，并如实例4将所得的16个不同的PCR片段分别转化到里氏木霉Archy3菌株中。

每个变体相应选择了四个转化株，并转移到充有0.2ml的含1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA的96孔MTP。将MTP在28℃下温育1天，然后置于室温下3天以促进孢子形成。将全部克隆转移到一个96孔过滤板并温育5天。如实例2进行ABTS测定。图16显示了所筛选的全部转化株的ABTS活性。结果表明有两个变体（V293N和V293T）显示出比野生型对照更高的漆酶表达或者活性。

实例8：组合变体

选择了三个突变（即V287G、V293T和V319T）用于与突变I265R进行组合。制备了三个引物（即V287G反向引物、V293T正向引物和V319反向引物），并用于在全部三个位置引入氨基酸残基变化和产生包括I265R突变的全部可能组合。如实例4，使用单个PCR反应。获得了五个变体，即I265R/V287G、I265R/V293T、I265R/V319T、I265R/V287G/V319T和I265R/V287G/V293T/V319T。

然后使用与五个不同变体中的每一个变体对应的质粒DNA作为PCR的模板。使用每个模板制备了三管的100μl PCR反应物，并如实例2将五个所得的PCR片段中的每一个片段转化里氏木霉的Archy3菌株。从每个变体挑取六个转化株到充有0.2ml的含1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA的96孔MTP。将MTP在28℃下温育1天，然后置于室温下2天以促进孢子形成。将孢子转移到一个96孔过滤板并在28℃下温育5天。如实例2进行ABTS测定。图17显示了所筛选的全部转化株的ABTS活性测定。结果表明，突变的组合产生了比野生型漆酶具有更高的表达和/或比活性的漆酶变体。

还选择了四个另外的突变（F68L、V287P、N335R和N130E用于与突变I265R组合。制备了四对引物，并如实例4用于与变体I265R相组合引入指定的氨基酸残基变化。获得的四个变体，即I265R/V287P、F68L/I265R、I265R/N335R和I265R/N130E。然后使用与四个不同变体中的每一个变体对应的质粒DNA作为PCR的模板。使用每个模板制备了三管的100μl PCR反应物，并如实例2将四个所得的PCR片段中的每一个片段转化里氏木霉的Archy3菌株。从每个变体挑取六个转化株到充有0.2ml的含1.2mg/ml5-FOA和0.5mg/ml尿苷的PDA的96孔MTP。将MTP在28℃下温育1天，然后置于室温下2天以促进孢子形成。将孢子转移到一个96孔过滤板并在28℃下温育5天。如实例2进行ABTS测定。

图18显示了所筛选的全部转化株的ABTS活性测定。结果表明，具有F68L突变和I265R突变的组合的漆酶变体比野生型漆酶或者其他受试变体具有高得多的表达和/或比活性。使用生物射弹转化法，将编码F68L/I265R漆酶变体的质粒DNA和编码野生型漆酶的质粒DNA分别转化到里氏木霉细胞中。总共获得了12个稳定的F68L/I265R转化株（即“67”克隆）和14个野生型转化株（即“42”克隆）。将每种类型的8个稳定转化株在摇瓶中培养并测试漆酶活性。如图19中所示，变体漆酶（即“67”克隆）显示出表达和/或比活性比野生型漆酶（即“42”克隆）提高4倍以上。

Claims

1.衍生自亲本漆酶的变体漆酶，所述变体漆酶：

(a)在与氨基酸序列SEQ ID NO:11第68位对应的位置处具有突变；

(b)具有改变所述亲本漆酶的表面电荷的突变；

(c)具有改变所述亲本漆酶的表面疏水性的突变；或者

(d)在与位于所述亲本漆酶表面的非保守疏水氨基酸残基对应的氨基酸位置处具有突变；

2.根据权利要求1所述的变体漆酶，所述变体漆酶在与氨基酸序列SEQ ID NO:11第68位对应的位置处具有突变，其中所述突变是芳族氨基酸残基置换成非芳族氨基酸残基。

3.根据权利要求2所述的变体漆酶，其中所述突变是芳族氨基酸残基置换成脂族氨基酸残基。

4.根据权利要求3所述的变体漆酶，其中所述突变是芳族氨基酸残基置换成A、V、L或者I。

5.根据权利要求4所述的变体漆酶，其中所述突变相当于SEQ ID NO:11中的F68L。

6.根据权利要求1所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有改变所述亲本漆酶的表面电荷或者改变所述亲本漆酶的表面疏水性的突变，其中所述突变位于与SEQ ID NO:11中的第130位、第265位、第287位、第293位或者第319位相当的位置处。

7.根据权利要求1所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有改变所述亲本漆酶的表面电荷或者改变所述亲本漆酶的表面疏水性的突变，其中所述突变位于与SEQ ID NO:11中的第130位相当的位置处。

8.根据权利要求1所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有改变所述亲本漆酶的表面电荷或者改变所述亲本漆酶的表面疏水性的突变，其中所述突变位于：

9.根据权利要求1所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有的突变相当于SEQ ID NO:11中的：

(a)I265R/V287G，

(b)I265R/V293T；

(c)I265R/V319T；

(d)I265R/V287G/V319T；

(e)I265R/V287G/V293T/V319T；

(f)I265R/V287P；

(g)I265R/N335R；

(h)I265R/N130E；

(i)F68L/I265R；

(j)F68L/I265R/V287G；

(k)F68L/I265R/V293T；

(l)F68L/I265R/V319T；

(m)F68L/I265R/V287G/V319T；

(n)F68L/I265R/V287G/V293T/V319T；

(o)F68L/I265R/V287P；

(p)F68L/I265R/N335R；或者

(q)F68L/I265R/N130E。

10.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，其中所述亲本漆酶可获自齿毛菌属(Cerrena)物种。

11.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，其中所述亲本漆酶可获自一色齿毛菌(Cerrena unicolor)。

12.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，其中所述亲本漆酶是一色齿毛菌的漆酶D。

13.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，其中所述亲本漆酶具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。

14.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少70%同一性的氨基酸序列。

15.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11有至少80%同一性的氨基酸序列。

16.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11有至少90%同一性的氨基酸序列。

17.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，所述变体漆酶具有与氨基酸序列SEQ ID NO:11有至少95%同一性的氨基酸序列。

18.根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶，所述变体漆酶还包含将糖基化位点引入到所述亲本漆酶的氨基酸序列中的突变。

19.组合物，所述组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的变体漆酶。

20.根据权利要求19所述的组合物，所述组合物还包含化学介质。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述化学介质是酚化合物。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述化学介质是选自以下的酚化合物：丁香腈、乙酰丁香酮和丁香酸甲酯。

23.对表面进行漂白的方法，所述方法包括使所述表面与前述权利要求中任一项所述的组合物接触。