CN101875943A - 红掌漆酶基因的克隆及表达载体构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及红掌漆酶基因及其植物表达载体，是分别提取红掌“阿拉巴马”及其白色佛焰苞突变体中的总RNA，纯化mRNA，构建抑制差减杂交文库，然后设计特异引物，以红掌总RNA反转录后的cDNA为模板，利用PCR方法获得漆酶基因的全长cDNA，与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取阳性克隆得到红掌漆酶基因，以其取代植物表达载体pBI121上的报告基因GUS，构建一个新的植物表达载体，命名为pLacBI121。本发明利用红掌“阿拉巴马”及其白色佛焰苞突变体获得与原花青素和植株的抗性有关的漆酶基因，为红掌不同佛焰苞颜色品种及红掌抗寒、抗病等品种的转基因培育奠定了基础，具有重要的理论及实践意义。

Description

红掌漆酶基因的克隆及表达载体构建

技术领域

本发明涉及红掌中漆酶基因Laccase的克隆、重组及对种皮颜色控制功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

漆酶是最简单的多铜氧化酶，一般含有4个铜原子，分布于3个高度保守的不同结合位点，每个铜原子在催化机制中都有很重要的作用。漆酶能催化O₂，通过4个电子还原成水，并且伴随着一些酚类底物的氧化。漆酶蛋白一般由500～550个氨基酸构成，有N端分泌信号肽。关于漆酶空间结构的详细资料来自于漆酶的晶体衍射研究。Valerie Ducros等人从Corpprinuscinereus中得到该酶的结晶，并分析了同一晶体2.2A分辨率条件下的X-ray图谱，发现单个酶分子由3个环状结构域组成，三者紧密连接在一起，形成球状结构。

根据光谱学、动力学对漆酶晶体衍射原理进行研究，得出漆酶催化底物的方式可能是：底物结合于酶活性中心的I型铜原子位点，通过Cys-His途径将其电子传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水。同时，底物形成自由基，它们可以自身结合或相互偶联，形成聚合物或偶联产物。漆酶是单电子氧化还原酶，在小分子的介体物质存在下，漆酶可氧化非酶底物。目前通过不断研究，发现漆酶可氧化的非酶底物范围还在不断增加，这一性质预示着漆酶具有广泛的应用前景。不同漆酶氧化能力不一样，氧化方式也不同，甚至完全相反。漆酶氧化速率的大小不仅与漆酶本身的稳定性有关，而且也与漆酶和底物作用的一些动力学参数有关。

种皮的显棕色是由于黄酮类的氧化，尤其是原花青素，它是一种黄烷-3-醇亚单位，例如表儿茶素和儿茶素的多聚体。

在红掌突变体的种子里，积累了更多的表儿茶素单体和比野生型更多的可溶性原花青素。而且，红掌的完整的外种皮细胞中，在表儿茶素和儿茶素存在的情况下，不能触发独立的H₂O₂非依赖性显棕色。与野生型作对照，通过紫外线检测和质谱技术，发现单独由表儿茶素获得的主要氧化产物是黄色的二聚体，称为脱氢双表儿茶素A(dehydrodiepicatechin A)。这种产物与原花青素在属性和黄烷亚单位的连接位置不同。红掌突变体种子中的黄酮醇含量也受到影响，其槲皮素鼠李糖苷单体与二聚体的比值也远高于野生型种子。

漆酶基因编码一种与类似漆酶的多酚氧化酶极为类似的蛋白，它主要在种皮的发育过程中表达，此处含有黄酮类的末端产物---原花青素与黄酮醇。此基因涉及黄酮类的氧化聚合并作为一种漆酶类型的黄酮类氧化，尤其是原花青素。

发明内容

本发明的目的是提供一种红掌漆酶基因的克隆及表达载体构建。

本发明首次从红掌中分离出漆酶基因的全长cDNA。

一、红掌漆酶基因全长cDNA序列的分离

(1)漆酶基因中间片段的获得

以红掌“阿拉巴马”野生型与其绿色突变体为材料，利用CTAB法提取总RNA，各取2微克总RNA，利用StraightA’s mRNA Isolation System分离纯化mRNA，使用CloneTech公司PCR-Select subtraction试剂盒，做差减抑制杂交(SSH)，在野生型特异表达的差减库中获得278bp的特异序列：

1   ACATGGAGGC ATGTAAGAAG GTGGAGGCAG AATTTGAGCT TCAGAACTAT

51  TCCCATTCTC CACAATGAAG ACGGTTGCCA TGCCCCAGCT CGTATGGCGT

101 TCAAAGTGGC AGTGCATAAA CCACACACCT GGGTTGTCGG CTCTGAATCT

151 GATGGCCGCC CAGCCATTCC TGGGGACCCC AAACGTGTTC  ATCAATGGAG

201 GGTCCACGAG GTTGTAGTTT TCAGGGTCCT TGGTCCTGTT GAAGTTGCCG

251 GGGCCGACGC CCACCCGGTA GAAGCTGT

(2)漆酶基因全长cDNA序列的分离

根据中间片段，设计3′和5′末端快速扩增(RACE)引物：

5′RACE引物：5’gCT CgT ATg gCg TTC AAA gTg gCA gT 3’

3′RACE引物：5’AAg gAC CCT gAA AAC TAC AAC CTC gTg gA 3’

利用Clontech公司的SMART^TM PCR cDNA Amplification Kit，经过3′和5′末端快速扩增，取2μl PCR产物连接到pGEM-T easy载体上，转化DH5α感受态细胞，涂平板，筛选阳性克隆，挑白斑摇菌，提取质粒，并进行酶切鉴定，之后进行序列测定。根据测定的序列，再设计全长cDNA扩增引物：

5’端引物：5’GCAGTGGTATCAACGCAGAGTACG 3’

3’端引物：5’TTTTTTTGTGAAGTTCTTAGCACAGAATTA 3’

PCR体系及条件为：

获得全长的cDNA为1979bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1950bp，由此推得具639个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的葡萄、玉米、水稻的漆酶蛋白的氨基酸同源性分别为72％、71％和69％，表明经过上述克隆步骤得到了编码漆酶的基因。

二、红掌漆酶基因表达载体的构建

根据已测序的漆酶基因序列，设计在5’端加上XbaI酶切位点的上游引物P1(5’-CTAGTCTAGACTAGCAGAGTACGCGGGG-3’)和在3’端加上SacI酶切位点的下游引物P2(5’-CGAGCTCGTTTTTGTGAAGTTCTTAGC-3’)。通过PCR反应扩增目的片段，回收PCR产物，经测序无误后再用Xba I和SacI双酶切该产物和植物表达载体pBI121，并将酶切获得的含有两个酶切位点的基因和pBI121载体大片段连接获得含有漆酶基因的表达载体。

三、漆酶基因的功能鉴定

利用农杆菌介导法转化红掌。

取红掌无菌苗的叶片、叶柄，将红掌叶、切成0.5cm×0.5cm小块，叶柄切成0.5cm段，利用MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L培养基预培养2d后，放入含有漆酶表达载体的农杆菌菌液中浸泡10min，于相同的培养基中共培养2d，再转入含有卡那霉素40mg/L和头孢青霉素250mg/L的MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L培养基上进行筛选培养。待不定芽分化后，切取不定芽接种到含有卡那霉素40mg/L和头孢青霉素250mg/L的1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基上诱导生根。将生根植株移入花盆，待植株开花后人工授粉，结果实后观察种皮颜色，发现变浅，符合理论推测。

本发明利用红掌“阿拉巴马”及其白色佛焰苞突变体获得与原花青素和植株的抗性有关的漆酶基因，为红掌不同佛焰苞颜色品种及红掌抗寒、抗病等品种的转基因培育奠定了基础，具有重要的理论及实践意义。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

实施例1：红掌基因的克隆方法

1、总RNA的提取：

(1)取1ml CTAB提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；

(2)称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；

(3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；

(4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤3；

(5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，4℃沉淀过夜；

(6)4℃，10000rpm离心30min；

(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；

(8)将沉淀溶解在100μl STE(65℃预热)中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；

(9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30min，或-20℃沉淀2h；

(10)4℃，10000rpm离心20min；

(11)沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20μl RNase-free水溶解；

2、抑制差减杂交文库的构建及目的片段的筛选

(1)使用CloneTech公司PCR-Select subtraction试剂盒，以红掌野生型与绿色突变体为材料，做差减抑制杂交(SSH)，在野生型特异表达的差减库中获得278bp的特异序列；

(2)特异序列克隆：取2μl PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

(3)序列测定：在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。

(4)3′和5′序列的分离：按Clontech公司的SMART RACE cDNAAmplification Kit说明书进行

(5)同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。

实施例2：红掌漆酶基因植物表达载体pBI121的构建

1、根据分离出的红掌漆酶基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5’-CAgAgTACgCgggggAACCTAATT-3’

反向引物：5-TTTTgTgAAgTTCTTAgCACAgAATTATTC-3’

以总RNA反转录的5’Race的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

2、取1μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TakaRa公司产品pMD18-T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌JM109菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。

3、用XabI和SalI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T Vector载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化JM109细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。将构建好的重组子命名为pLacBI 121。

实施例3：漆酶基因的功能鉴定

1、种植红掌突变体植株，并将表达载体pLacBI 121转化农杆菌EHA105。

2、挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养。

3、3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用10X MS培养基悬浮。

4、将突变体植株叶片切成小块，放入上述悬浮液浸泡10分钟。

5、侵染后的叶片切块置于分化培养基(1/2MS盐，3％蔗糖，pH 5.8，4.5g/L卡拉胶，)上共培养2天，然后转入选择培养基(1/2MS，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，卡那霉素100mg/L，头孢青霉素250mg/L)筛选，得到抗性植株。

6、将植株移入花盆，待植株开花后人工授粉，结果实后观察种皮颜色，发现变浅，符合理论推测。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所徐立

<120>红掌漆酶基因核苷酸序列

<160>2

<210>1

<211>1979

<212>DNA

<213>红掌(Anthurium andraeanum)

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(29)...(1745)

<400>1

1    ACGCGGGGGA ACCTAATTCT CTAGCAGCCA TGGGGTTGCG AGAGAGTTTG

51   CTGGAGGGGT TACTAGTTCC TTTATTTTTG TGCGGGTTCC TGGTTTTCCC

101  CGTGTGGTGC GAGACGCTCA ACTATGTCTA CAACATTACC GAGACATCAT

151  ACACTCGGCT GTGCGAAACC AAGAACATCT TGACAGTAAA CGGCCTATAT

201  CCTGGACCAA CTATCTACGC ACACAGGGGA GATACAGTTG CCGTCCATGT

251  GTACAACCTC GCCAGCATTA ACGTCACTCT GCACTGGCAT GGGGTGAAGC

301  AACCGAGAAA CCCCTGGTCG GACGGCCCCG AGTTCGTCAC TCAGTGCCCC

351  ATCCGGCCGT CGGCAAACTT CACCTACAAC ATCATCTTGT CGGACGAAGA

401  AGGGACGATC TGGTGGCATG CGCACAGCGA CTGGTCACGC GCCACTGTCC

451  ATGGCGCCAT CGTTATTTAT CCCACGAATG GTTCGGCAGG CTACCCCTTC

501  GCCAAACCCG ATTACGAGGT TCCTCCCATC ATTTTAGGGG AATATTGGAT

551  CAGTGATGTC ATGGATGTGC TCGAAGAAAT GCTTGAAGGA GGAGGGGCAC

601  CCAATACTTC CGACGCCTTT ACCATCAATG GCCAGCCTGG TGATGGCTAT

651  GATTGCTCCG CAGAAGGAAT GTACAAGTTG ACAGTGAAGG CAGGGAAGAG

701  GTACCTGCTA CGCTTGGTGA ACGCCGCCAT GAACGACGAG GTCTTCTTCG

751  GCATCGCCAA TCATTCACTC ACCATCGTCG GGGCCGACGG GGCCTACACC

801  AAGCCCTTCA CCACGGACTA CGTGTTGACG ACCCCAGGGC AGACCCTGGG

851  ACCTGCTCCT AGAAGCAAAC CACAGTCCTC CACTGCTCGC TACTACATGG

901  CCGCCAAGGC CTACTCCACC AACTCGCTCG TGGGCTACGA CAACACGACC

951  TCGACGGCCG TCCTGCAGTA CAGTGGTGGC GACAACTCTT CCACCCCCAT

1001 TTCTCCCACA CTCCCTCTGT TCAACAGCAC CGAAGCAGTG GCCAAGTTCT

1051 CAAACGGGAT GAAGAGCCTG GTAAGCGAAG AGCACCCCAT CTCCGTGCCA

1101 CTCGAAATCG ACCACCACAT CCTCATCACT GCCTCCATCA GCCAACTGAG

1151 GTGTGTTAAC GACTCGTGCG ACGGGCCGAA CGGCAGCAGG GTGGGCGCCA

1201 GCCTCAACAA CATAAGCTTC TCCCTGCCCT CCATCGACGT GCTCGAAGCG

1251 TACTACAGTT CGATCTCGGG TGTCTTCACG CCGGGCTTCC CAAACAAGCC

1301 ACCCAAGGAG TTCAACTACA CAGCGGAAGA GCCGGATTCG AGCTTGGTGT

1351 GGACCACGCT CGGCACGAAG GTGAAGAAGA TTGAGTACAA CAAGACCGTG

1401 GAGATCGTCT TCCAGGGAAC GAGCCTGGTG GCGGCGCTGA GCCACCCCAT

1451 GCACCTGCAC GGGTACAGCT TCTACCGGGT GGGCGTCGGC CCCGGCAACT

1501 TCAACAGGAC CAAGGACCCT GAAAACTACA ACCTCGTGGA CCCTCCATTG

1551 ATGAACACGT TTGGGGTCCC CAGGAATGGC TGGGCGGCCA TCAGATTCAG

1601 AGCCGACAAC CCAGGTGTGT GGTTTATGCA CTGCCACTTT GAACGCCATA

1651 CGAGCTGGGG CATGGCAACC GTTTTCATTG TGGAGAATGG GAATAGTTCT

1701 GAAGCTCAAA TTCTGCCTCC ACCTTCTTAC ATGCCTCCAT GTACTTAGGT

1751 TGGAATATTG GAGAAGAAAT AATTGCCCTG AACGAGCACA TGTTTTTCTT

1801 CTGTAATTGT TATTGGTGTG TATTGGTGGT CTCGGAGGAA GATCACCGTA

1851 TGTATCGTTG CTTCTTGATT TGATCTGTTG TTGTAGCTAT GAATCCAGTA

1901 ACCCTATTAT TGTTTGTTTA TGGAATAATT CTGTG

Claims (4)

1.一种红掌漆酶基因，其特征在于具有序列表中<400>1项下的序列。

2.一种权利要求1所述的红掌漆酶基因的分离方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)漆酶基因中间片段的获得

以红掌“阿拉巴马”野生型与其绿色突变体为材料，利用CTAB法提取总RNA，各取2微克总RNA，利用StraightA’s mRNA Isolation System分离纯化mRNA，使用CloneTech公司PCR-Select subtraction试剂盒，做差减抑制杂交(SSH)，在野生型特异表达的差减库中获得278bp的特异序列：

1    ACATGGAGGC ATGTAAGAAG GTGGAGGCAG AATTTGAGCT TCAGAACTAT

51   TCCCATTCTC CACAATGAAG ACGGTTGCCA TGCCCCAGCT CGTATGGCGT

101  TCAAAGTGGC AGTGCATAAA CCACACACCT GGGTTGTCGG CTCTGAATCT

151  GATGGCCGCC CAGCCATTCC TGGGGACCCC AAACGTGTTC ATCAATGGAG

201  GGTCCACGAG GTTGTAGTTT TCAGGGTCCT TGGTCCTGTT GAAGTTGCCG

251  GGGCCGACGC CCACCCGGTA GAAGCTGT

(2)漆酶基因全长cDNA序列的分离

根据中间片段，设计3′和5′末端快速扩增(RACE)引物：

5′RACE引物：5’gCT CgT ATg gCg TTC AAA gTg gCA gT 3’

3′RACE引物：5’AAg gAC CCT gAA AAC TAC AAC CTC gTg gA 3’

利用Clontech公司的SMART^TM PCR cDNA Amplification Kit，经过3′和5′末端快速扩增，取2μl PCR产物连接到pGEM-T easy载体上，转化DH5α感受态细胞，涂平板，筛选阳性克隆，挑白斑摇菌，提取质粒，并进行酶切鉴定，之后进行序列测定；根据测定的序列，再设计全长cDNA扩增引物：

5’端引物：5’GCAGTGGTATCAACGCAGAGTACG 3’

3’端引物：5’TTTTTTTGTGAAGTTCTTAGCACAGAATTA 3’

获得全长的cDNA为1979bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。

3.一种红掌漆酶基因表达载体，其特征在于利用了权利要求1所述的红掌漆酶基因为目的基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的红掌漆酶基因表达载体，其特征在于用权利要求1所述的红掌漆酶基因置换植物表达载体pBI121上的GUS报告基因，构建成在CaMV35S启动子下游含有红掌漆酶基因的高效表达载体。