CN115868407B - 一种分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，根据育种目标选择具有红色佛焰苞的红掌作为父本与母本杂交，获得杂种后代苗，取杂种后代苗叶片与亲本叶片分别提取基因组DNA，采用与红掌红色佛焰苞连锁的分子标记引物进行PCR扩增、电泳，选择和红色佛焰苞红掌亲本带型一致的后代，作为目标花色后代进行栽培。本发明采用分子标记技术辅助红掌红色佛焰苞选择，将红色佛焰苞选择提早到杂交后代幼苗期，明显缩短红色佛焰苞红掌的育种周期，与此同时对非红色佛焰苞的后代可以直接淘汰，减少了种植规模，提高了红掌育种效率和效益。
Description
技术领域
本发明属于植物育种方法，具体地，是涉及一种分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法。
背景技术
红掌(AnthuriumandraeanumLind.)属天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)多年生草本植物。其佛焰苞心形，颜色丰富且花期长，既可作为盆花也可作为鲜切花，具有很高的观赏价值，深受消费者喜爱，市场前景广阔。新品种选育是红掌产业高效可持续发展的关键。在国外，红掌育种在上个世纪四十年代就已开始，而我国的红掌育种则在本世纪初，红掌常规育种周期长、成本高，一般培育一个红掌新品种需要8-10年(Azadiet al.，2016)，因此如何缩短育种周期，提高育种效率和效益，尽快培育具有自主知识产权的突破性红掌新品种，缩小与国外在红掌育种上的差距，已成为进一步推动我国红掌产业自主高效发展的关键。
佛焰苞颜色是红掌的主要观赏性状，以红色、粉色、橙色、珊瑚色和白色为主，此外还有紫色、绿色、褐色和复色等。红色佛焰苞是最受欢迎的颜色，培育出具有鲜艳红色佛焰苞的品种是红掌新品种选育的重要目标，在传统育种过程中，红掌佛焰苞颜色选择只能在后代植株开花时进行，无法提早对具有目标花色的后代进行种苗繁殖，因此育种周期长。与此同时，育种早期也无法提早淘汰非育种目标性状植株，导致后代群体大，育种成本高。因此研究在育种早期对红掌花色进行选择的技术，对缩短育种周期，减少种植规模，提高育种效益、尽快缩短与国外育种差距均具有重要意义。
SSR标记即简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，又称微卫星(microsatellite)标记,该标记数量多、共显性、呈孟德尔式遗传、可鉴别出杂合子和纯合子，对DNA质量要求不高,仅需微量的DNA组织就能通过PCR技术进行分析，检测方便，常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单拷贝差异，遗传信息量大。利用与育种目标性状基因紧密连锁的SSR标记，在植株生长的不同阶段，通过提取基因组DNA进行PCR和凝胶电泳检测，就能够实现对具有目标性状植株的提早选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，以克服现有红掌育种周期长、育种成本高的缺陷。
一种分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，根据育种目标选择具有红色佛焰苞的红掌作为父本与母本进行杂交，获得杂种后代苗，取杂种后代苗叶片与亲本叶片分别提取基因组DNA，采用与红色佛焰苞连锁的分子标记引物进行PCR扩增、电泳，选择和亲本带型一致的后代，作为目标花色后代进行栽培。
本发明中，根据父本和母本的SSR标记序列设计与红掌红色佛焰苞连锁的分子标记引物。作为本发明的优选实施例，所述分子标记为SSR10和SSR126。
具体地，所述分子标记SSR10引物为：
上游序列：5’-TGAAGCACTCCACAATCGTC-3’
下游序列：5’-CTAGCAGCCTCCAACACCTC-3’。
所述分子标记SSR126引物为：
上游序列：5’-CAACCCTAACCCTAGCCCTC-3’
下游序列：5’-CTCAGCGACGACTTCTTGTG-3’。
父本优先选择具有红色佛焰苞且综合性状好的红掌，如红掌Anthurium‘Alabama’和小娇A.‘Xiao Jiao’。
母本选择白色佛焰苞红掌A.‘Mystral’。
父本和母本杂交过程中，将父本花粉授到母本柱头上，然后套袋，栽培母本获得杂交果实；取杂交果实获得种子，培养获得杂种后代苗。
所述种子采用粗泥炭直播或消毒后接种到无激素MS培养基上离体培养。
在本发明中，待杂种后代苗长到4-5片叶子时，取杂种后代苗的嫩叶进行基因组DNA提取。
与现有红掌育种技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.现有红掌育种通常采用杂交育种的方法，只能在杂种后代开花时进行佛焰苞颜色的选择，不能提早选择和淘汰非育种目标的后代植株，既耗时又费钱。本发明采用分子标记技术辅助选择红掌红色佛焰苞，将选择提早到杂交后代幼苗期，将育种周期缩短至原来的一半，明显缩短了育种周期。而现有技术培育一个红掌新品种需要8-10年。与此同时对非红色佛焰苞的后代可以直接淘汰，减少了种植规模，提高了红掌育种的效率和效益。
2.本发明选择的分子标记引物，能够提高筛选效率以及有效率。
附图说明
图1是标记SSR10对‘2008-377’组合亲本及48株F1电泳检测结果；
P1为A.‘Alabama’，P2为A.‘Mystral’，其余为48株F1代，M：DL500 DNA Marker。
图2是标记SSR10对‘2008-377’组合48株F1电泳检测结果；
此图全为F1代，M：DL500 DNA Marker。
图3是标记SSR126对‘009’组合亲本及30株F1电泳检测结果；
P1为红掌‘小娇’，P2为A.‘Mystral’，其余为009组合F1代，M：DL500 DNA Marker。
图4是标记SSR126对‘009’组合30株F1电泳检测结果；
此图全为‘009’组合F1代，M：DL500 DNA Marker。
图5是分子标记辅助选择选出优良红掌资源；
a：08-377-289；b：08-377-86；c：08-377-104；d：009-3；e：009-28；f：009-51。
具体实施方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步的阐述，但具体实施例并不对本发明做任何的限定。除SSR10和SSR126标记引物外，以下实施例中所述的品种、试剂、仪器等均为本领域的普通技术人员通过购买可以得到。
实施例利用分子标记SSR10和SSR126辅助红掌红色佛焰苞选择
S1.亲本选配和杂交果实获得：根据育种目标，选择杂交亲本，配制杂交组合，获得果实。
S11.亲本选配：根据红色佛焰苞育种目标，选择具有红色佛焰苞的红掌Anthurium‘Alabama’和小娇A.‘Xiao Jiao’为父本，选择具有白色佛焰苞的红掌A.‘Mystral’为母本。
S12.杂交果实获得：选择肉穗花序中部小花柱头伸出并分泌粘液的A.‘Mystral’植株做母本植株，将父本A.‘Alabama’和小娇当天开花的花粉授到母本柱头上，然后套袋。栽培母本植株，当果实变黄，收获果实，组合代号分别为‘08-377’和‘009’。
S2.杂种后代苗生产：采用基质播种或种子离体培养生产杂种后代苗。
S21.种子的获得：将肉穗花序上成熟的果实取下，放入清洁水中用手捏开果实，洗净粘液，获得种子。
S22.杂种后代苗生产：当种子晾干后，直接播种到装有粗泥炭基质的200孔育苗筛中，每孔播1粒种子，当幼苗长到5片叶时，即可取叶片提取DNA。
S3.分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择。
S31.引物合成：
分子标记SSR10引物：
上游序列：5’-TGAAGCACTCCACAATCGTC-3’
下游序列：5’-CTAGCAGCCTCCAACACCTC-3’。
分子标记SSR126引物为：
上游序列：5’-CAACCCTAACCCTAGCCCTC-3’
下游序列：5’-CTCAGCGACGACTTCTTGTG-3’。
由北京擎科生物公司广州合成部合成引物。
S32.亲本和后代基因组DNA的提取：当杂交后代在穴盘中长有5片叶时，取80-120mg亲本和后代嫩叶采用CTAB法提取后代基因组DNA。
S33.PCR扩增及凝胶电泳检测：利用合成的引物对红掌叶片DNA进行PCR扩增，PCR采用10μl[1μL DNA 模板(50-100ng/μL)，5μL PCR-mix，0.5μL上游引物(10uM/μL)，0.5μL下游引物(10uM/μL)，3μL ddH2O]或20μl(各成分体积加倍)扩增体系，将扩增好的PCR产物进行4-6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为电压300V、电泳时间120-150min，电泳结束后进行银染和显色，最后放置白色塑料板上拍照读带。
PCR扩增条件：1μL DNA模板(50ng/μL)，5μLPCR-mix，0.5μL上游引物(10uM/μL)，0.5μL下游引物(10uM/μL)，3μL ddH2O；PCR体系配置好后，滴入石蜡油，放入PCR基因扩增仪中进行反应扩增；PCR扩增程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min，12℃保存。
PCR反应程序
S34.红色佛焰苞红掌后代的获得：选择和红色佛焰苞亲本A.‘Alabama’带型一致的后代继续栽培，待开花时结合目测结果鉴定选出目标佛焰苞颜色后代。
利用SSR10对96个A.‘Mystral’×A.‘Alabama’后代进行红色佛焰苞辅助选择(图1和图2)，结果表明，58个后代带型与红色佛焰苞亲本A.‘Alabama’一致，后代佛焰苞颜色观察结果表明，58个后代中有44个后代具有红色佛焰苞。利用SSR126对60个‘小娇’×A.‘Mystral’后代进行红色佛焰苞辅助选择(图3和图4)，结果表明，32个后代带型与红色佛焰苞亲本A.‘Alabama’一致，后代佛焰苞颜色观察结果表明，32个后代中有23个后代具有红色佛焰苞。结合形态学观测，选择出6个具有红色佛焰苞的优良红掌种质资源(图5)。
以上列详细说明是针对本发明的生产实施例的举例说明，但该实施例并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技术应用精神和实物所为的等效实施或变更，均应包含于本申请的保护范围中。
Claims (4)
1.一种分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，其特征是，根据育种目标选择具有红色佛焰苞红掌作为父本与母本进行杂交培育，获得杂种后代苗，取杂种后代苗叶片与亲本叶片分别提取基因组DNA，采用与红掌红色佛焰苞连锁的分子标记引物进行PCR扩增、电泳，选择和红色佛焰苞红掌亲本带型一致的后代，继续栽培，待开花时结合目测结果鉴定选出目标佛焰苞颜色后代进行栽培；
根据父本和母本的SSR标记序列设计与红掌红色佛焰苞连锁的分子标记引物，其中，所述父本为红色佛焰苞红掌Anthurium‘Alabama’，所述母本为白色佛焰苞红掌A.‘Mystral’，分子标记SSR10引物为：
上游序列：5，-TGAAGCACTCCACAATCGTC-3，
下游序列：5，-CTAGCAGCCTCCAACACCTC-3，；
所述父本为红色佛焰苞红掌小娇A.‘Xiao Jiao’，所述母本为白色佛焰苞红掌A.‘Mystral’，分子标记SSR126引物为：
上游序列：5，-CAACCCTAACCCTAGCCCTC-3，
下游序列：5，-CTCAGCGACGACTTCTTGTG-3，。
2.根据权利要求1所述分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，其特征是，所述父本和母本杂交过程中，将父本花粉授到母本柱头上，然后套袋，栽培母本获得杂交果实；取杂交果实获得种子，培养获得杂种后代苗。
3.根据权利要求2所述分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，其特征是，所述种子采用粗泥炭直播或消毒后接种到无激素MS培养基上离体培养。
4.根据权利要求1所述分子标记辅助红掌红色佛焰苞选择的方法，其特征是，待杂种后代苗长到4-5片叶子时，取所述杂种后代苗的嫩叶进行基因组DNA提取。
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| "红掌分子图谱构建及与花色连锁分子标记筛选";蒋锦雷;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》(第3期);D048-335 * |
| 红掌佛焰苞转录组测序数据组装及基因功能注释;林发壮;姚凤琴;安慧珍;陈昌铭;郭芸玮;林辉锋;夏朝水;钟琳珊;;分子植物育种;20201014(第19期);第6256-6265页 * |
| 红掌花色表型分类研究;易双双;李崇晖;杨光穗;牛俊海;;北方园艺;20180824(第16期);第105-111页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115868407A (zh) | 2023-03-31 |
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