CN107099526A - 基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法 - Google Patents

基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物杂交育种技术领域，公开了一种基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用秋水仙素处理，然后用利用PEG高ca2+‑高pH值法诱导进行原生质体融合；融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。本发明简单易行，融合频率高，可大幅度地拓宽红掌的遗传多样性，为红掌杂交育种、遗传改良和新种质创造开辟了一条新途径。

Description

基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法
技术领域
本发明属于植物杂交育种技术领域，尤其涉及一种基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法。
背景技术
红掌(Anthurium andraenum)为天南星科花烛属多年生草本植物，原产地为哥伦比亚，是目前世界上畅销的兼具切花与观叶盆栽的观赏植物，具有很高经济价值，市场开发前景广阔。目前市场几乎所有的盆花和切花品种多由花烛属(Anthurium Schott)种间或红苞花烛(A.andraeanum Lind)种内杂交选育而来，创造了丰富的遗传变异。荷兰的安祖、瑞恩等专业公司和美国的夏威夷大学、佛罗里达大学等研究机构经过几十年的培育，推出了众多花色、花形、株型、抗性等特性各异的切花和盆花品种，但出于商业利益保护的需要，相关的研究成果一直被视同核心机密而较少公开。我国的红掌产业正处在快速发展进程中，生产中品种主要依赖进口或自繁国外品种的种苗。我国学者红掌方面的研究，主要集中在组织培养以及栽培技术方面，近年来有些研究者开展了红掌品种资源的收集、保存、和杂交育种等方面工作。广州花卉研究中心和华南农业大学共同选育的‘朝霞’和‘彩霞’等盆花品种，以及云南省热带作物科学研究所李惠波等人选育出的‘水晶之恋’和‘春晓’等少数品种目前获得新品种权和进入商业化推广应用阶段。但我国总体上缺乏自主知识产权的红掌新品种，这对于红掌产业的良性及快速发展造成了较大的障碍。因此红掌种质创新和完善杂交育种技术体系，是培育观赏性好及适应性强的自主品种的重要手段。
综上所述，现有技术存在的问题是：传统杂交育种存在红掌杂交育种周期长，通常耗时7-8年；普遍存在自交或杂交不亲和，以及近交后代衰退等生殖障碍；诱变育种中存在红掌种性突变的有害性和随机性，辐射育种的目的性不 强的缺陷；红掌倍性育种亦常常会伴随红掌农艺性状和观赏性状的降低，一定程度上影响了红掌多倍体育种的广泛应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法。
本发明是这样实现的，一种基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；
将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用秋水仙素处理，受体原生质体用紫外光照强度下照射处理，然后用利用PEG高ca2+-高pH值法诱导进行原生质体融合；
融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。
进一步，所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法具体包括以下步骤：
步骤一，原生质体制备：在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用。所述含酶解液液体培养基为：酶解液(3.0％-4.0％纤维素酶+1.0％-1.5％离析酶+1.5％-2.5％果胶酶+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2，pH为5.4～5.8)，液体培养基(1/2MS+0.1～0.6mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2+50～80g/L葡萄糖+0.1～0.5g/L酸性水解酪蛋白，pH为5.4～5.8)；
步骤二，供体原生质体制备：取步骤一获得的原生质体使用CPW溶液悬浮， 调整到原生质体悬浮液的密度，在紫外光照强度下照射，得到供体原生质体；
步骤三，受体原生质体制备：取步骤一获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体悬浮液的密度，然后加入秋水仙素处理，在摇床上振荡，培养得到受体原生质体；
步骤四，体细胞杂交：取步骤二供体原生质体和步骤三受体原生质体,按体积比混合，得亲本悬浮液，加入亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，再加入亲本悬浮液体积的高ca2 +-高pH溶液，然后使用CPW溶液洗涤，离心得到融合的杂种细胞；
步骤五，杂种细胞培养：取550-650μl步骤四融合细胞转入原生质体液体培养基进行振荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。
进一步，步骤一中，所述在红掌幼苗生长中，选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗。
进一步，步骤二中，原生质体悬浮液密度为0.5×l05个/mL～l×l05个/mL，在1000μW/cm2～1500μW/cm2紫外光照强度下照射5min～25min。
进一步，步骤三中，原生质体悬浮液密度为0.5×l05个/mL～l×l05个/mL；加入0.15g/L～0.50g/L秋水仙素处理，在转速为80r/min～120r/min的摇床上振荡培养3d～15d。
进一步，所述步骤四具体包括：所述取步骤二供体原生质体和步骤三受体原生质体,按按1:1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1倍～4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液；在25℃～32℃下保温15min～30min，再加入2倍～4倍亲本悬浮液体积的高ca2+-高pH溶液，混合后在25℃～32℃下保温10min～15min，然后使用CPW溶液洗涤2遍～3遍，离心得到融合的杂种细胞。
本发明的另一目的在于提供一种利用权利要求1所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法构建的红掌细胞融合杂交育种体系。
本发明的优点及积极效果为：
本发明为缩短红掌育种时间，提高红掌育种成效，在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系。将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用秋水仙素处理，受体原生质体用紫外光照强度下照射处理，然后用利用PEG高Ca高pH值法诱导进行原生质体融合。融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
本发明简单易行，融合频率高，可大幅度地拓宽红掌的遗传多样性，为红掌杂交育种、遗传改良和新种质创造开辟了一条新途径。
本发明选用红掌优良单株幼嫩外植体，取材料容易、方便；使用不对称原生质体杂交技术，方法简单、易行，融合效率高；使用紫外光照强度下照射和秋水仙素处理原生质体，极大程度地拓宽了红掌的遗传多样性，为红掌体细胞杂交育种、遗传改良和新种质利用提供可能；本发明红掌杂交育种时间缩短3-4年。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系。 将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用秋水仙素处理，受体原生质体用紫外光照强度下照射处理，然后用利用PEG高Ca高pH值法诱导进行原生质体融合。融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
图1是本发明实施例提供的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，包括以下步骤：
S101:原生质体制备：选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗生长，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系。将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用；
S102:供体原生质体制备：取S101获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5×l05个/mL～l×l05个/mL的悬浮液，在1000μW/cm2～1500μW/cm2紫外光照强度下照射5min～25min，得到供体原生质体；
S103:受体原生质体制备：取S101获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5×l05个/mL～l×l05个/mL的悬浮液，然后加入0.15g/L～0.50g/L秋水仙素处理，在转速为80r/min～120r/min的摇床上振荡培养3d～15d,得到受体原生质体；
S104:体细胞杂交：取S102供体原生质体和S103受体原生质体,按1:1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1倍～4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，在25℃～32℃下保温15min～30min，再加入2倍～4倍亲本悬浮液体积的高ca2+-高pH溶液，混合后在25℃～32℃下保温10min～15min，然后使用CPW溶液洗涤2遍～3遍，离心得到融合的杂种细胞；
S105:杂种细胞培养：取S104融合细胞转入原生质体液体培养基进行振荡培 养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
本发明简单易行，融合频率高，可大幅度地拓宽红掌的遗传多样性，为红掌杂交育种、遗传改良和新种质创造开辟了一条新途径。本发明选用红掌优良单株幼嫩外植体，取材料容易、方便；本发明使用不对称原生质体杂交技术，方法简单、易行，融合效率高。
本发明使用紫外光照强度下照射和秋水仙素处理原生质体，极大程度地拓宽了红掌的遗传多样性，为红掌体细胞杂交育种、遗传改良和新种质利用提供可能；
本发明红掌杂交育种时间缩短3-4年。
下面结合具体实施对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1：以红掌品种‘新星’原生质体不对称融合体细胞杂交育种
(1)原生质体制备：选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗生长，将‘新星’品种幼嫩叶片经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行震荡悬浮培养得到悬浮细胞系。将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用。
(2)供体原生质体制备：取获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.8×105个/mL的悬浮液，在1200μW/cm2紫外光照强度下照射20min，得到供体原生质体。
(3)受体原生质体制备：取获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.8×105个/mL的悬浮液，然后加入0.25g/L秋水仙素处理，在转速为100r/min的摇床上震荡培养7d，得到受体原生质体。
(4)体细胞杂交：取供体原生质体和受体原生质体，按1：1体积比混合，得亲本悬浮液，加入2倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，在27℃下保温24min，再加入3倍亲本悬浮液体积的高Ca2+-高pH溶液,混合后在27℃下保温10min，然后使用CPW溶液洗涤3遍，离心得到融合的杂种细胞。
(5)杂种细胞培养：取融合细胞转入原生质体液体培养基进行震荡培养获 得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
实施例2：以红掌品种‘阳光红心’原生质体不对称融合体细胞杂交育种
(1)原生质体制备：选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗生长，将‘阳光红心’品种幼嫩叶片经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行震荡悬浮培养得到悬浮细胞系。将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用。
(2)供体原生质体制备：取获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为1.0×105个/mL的悬浮液，在1500μW/cm2紫外光照强度下照射15min，得到供体原生质体。
(3)受体原生质体制备：取获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为1.0×105个/mL的悬浮液，然后加入0.15g/L秋水仙素处理，在转速为80r/min的摇床上震荡培养15d，得到受体原生质体。
(4)体细胞杂交：取供体原生质体和受体原生质体，按1：1体积比混合，得亲本悬浮液，加入3倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，在30℃下保温20min，再加入3倍亲本悬浮液体积的高Ca2+-高pH溶液,混合后在30℃下保温12min，然后使用CPW溶液洗涤3遍，离心得到融合的杂种细胞。
(5)杂种细胞培养：取融合细胞转入原生质体液体培养基进行震荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
实施例3：以红掌品种‘白鸽’原生质体不对称融合体细胞杂交育种
(1)原生质体制备：选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗生长，将‘白鸽’品种根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行震荡悬浮培养得到悬浮细胞系。将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用。
(2)供体原生质体制备：取获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5×105个/mL的悬浮液，在1000μW/cm2紫外光照强度下照射25min，得到供体原生质体。
(3)受体原生质体制备：取获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5×105个/mL的悬浮液，然后加入0.50g/L秋水仙素处理，在转速为120r/min的摇床上震荡培养10d，得到受体原生质体。
(4)体细胞杂交：取供体原生质体和受体原生质体，按1：1体积比混合，得亲本悬浮液，加入3倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，在25℃下保温32min，再加入3倍亲本悬浮液体积的高Ca2+-高pH溶液,混合后在25℃下保温15min，然后使用CPW溶液洗涤3遍，离心得到融合的杂种细胞。
(5)杂种细胞培养：取融合细胞转入原生质体液体培养基进行震荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；
将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用秋水仙素处理，受体原生质体用紫外光照强度下照射处理，然后用利用PEG高ca2+-高pH值法诱导进行原生质体融合；
融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。
2.如权利要求1所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法具体包括以下步骤：
步骤一，原生质体制备：在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用；
步骤二，供体原生质体制备：取步骤一获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体悬浮液的密度，在紫外光照强度下照射，得到供体原生质体；
步骤三，受体原生质体制备：取步骤一获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体悬浮液的密度，然后加入秋水仙素处理，在摇床上振荡，培养得到受体原生质体；
步骤四，体细胞杂交：取步骤二供体原生质体和步骤三受体原生质体,按体积比混合，得亲本悬浮液，加入亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，再加入亲本悬浮液体积的高ca2+-高pH溶液，然后使用CPW溶液洗涤，离心得到融合的杂种细胞；
步骤五，杂种细胞培养：取步骤四融合细胞转入原生质体液体培养基进行振荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。
3.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，步骤一中，所述在红掌幼苗生长中，选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗。
4.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，步骤二中，原生质体悬浮液密度为0.5×l05个/mL～l×l05个/mL，在1000μW/cm2～1500μW/cm2紫外光照强度下照射5min～25min。
5.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，步骤三中，原生质体悬浮液密度为0.5×l05个/mL～l×l05个/mL；加入0.15g/L～0.50g/L秋水仙素处理，在转速为80r/min～120r/min的摇床上振荡培养3d～15d。
6.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：所述取步骤二供体原生质体和步骤三受体原生质体，按按1:1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1倍～4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液；在25℃～32℃下保温15min～30min，再加入2倍～4倍亲本悬浮液体积的高ca2+-高pH溶液，混合后在25℃～32℃下保温10min～15min，然后使用CPW溶液洗涤2遍～3遍，离心得到融合的杂种细胞。
7.一种利用权利要求1所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法构建的红掌细胞融合杂交育种体系。
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