CN111053034A - 一种通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，选取红掌根尖作为外植体，通过外植体的预处理、诱导胚性愈伤组织、增殖培养、诱导胚状体的产生并将其培养成熟等步骤，最终可实现红掌植株的再生。本发明通过对红掌的幼嫩根尖进行离体培养，稳定诱导愈伤组织产生，平均诱导率达到80％以上，增殖培养后可诱导产生胚状体，每克愈伤组织平均能诱导产生40‑50个胚状体，运用本发明可使胚性愈伤组织进行大规模扩增，且在增殖培养数年后依然具有胚状体发生的能力。本发明建立了高效稳定的红掌胚状体发生技术，可应用于红掌的遗传转化、细胞变异及融合，能够避免嵌合体植株的形成，有助于今后的红掌遗传改良研究。
Description
技术领域
本发明属于红掌外植体诱导再生领域，具体涉及一种通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法。
背景技术
红掌为佛焰花目天南星科花烛属多年生草本花卉，原产于南美洲的热带雨林。红掌种类繁多，花色花型多样，其心型佛焰苞颜色鲜艳，花型优美，且花期持久、赋有天鹅绒光泽的叶片，生长周期长，具有重要的观赏价值，通常用于鲜切花、盆花和花坛造景。在全球花卉市场，红掌的销量仅次于兰花。
离体再生培养技术可以快速获得大量健康整齐、遗传一致的种苗，是大规模繁殖红掌的主要途径。红掌的组织培养技术研究始于1976年，Pierik等首次通过叶片培养，诱导愈伤组织发生，进而诱导不定芽的形成，从而实现红掌的离体再生。
后来经过人们不断的改进和优化，红掌的组织培养技术已经广泛运用于生产。目前，在红掌种苗的生产中广泛采用且较为成熟的技术手段主要是采用不定芽发生途径，该途径具有增殖系数较高等优点，但是，不定芽需要转接到生根培养基上进行培养以获得完整植株，且随着继代次数的增加，后代的变异率也随之增加，不定芽再生体系应用于遗传转化存在缺陷，容易产生嵌合体植株。
胚状体发生技术能够实现植株的大规模繁殖，可应用于细胞融合、染色体变异和农杆菌介导的遗传转化，然而，关于红掌胚状体发生的研究报道较少，Pinheiro等(MarcosVinícius Marques Pinheiro,Martins,F.B.,Cruz,A.C.F.D.,Carvalho,A.C.P.P.D.,Marília Contim Ventrella,Otoni,W.C..(2013)Maturation of anthurium andraeanumcv.eidibel somatic embryos from nodal segments.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant,49(3),304-312)采用带腋芽的茎段为外植体，在添加NAA的培养基上，诱导出胚性愈伤组织，进而获得成熟的体细胞胚，然而该方法中胚性愈伤组织的诱导率较低。
辛伟杰等(辛伟杰，徐彬，王广东，郭维明，文方德，金剑平，(2006)，花烛体细胞胚胎发生及植株再生研究，园艺学报(06)，111-116.)通过添加2,4-D和KT从红掌的叶片诱导出体细胞胚，但是，其体胚发生数量及同步化程度较低，受基因型影响较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，通过诱导红掌幼嫩根尖，产生胚状体，建立红掌高效稳定的胚状体发生技术，胚状体可以直接萌发成完整植株，不需要单独生根诱导，可提高植株移栽的成活率，可用于红掌的遗传转化，细胞变异及融合，有助于今后的遗传改良研究，对于促进红掌的分子育种具有重要意义。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，包括以下步骤：
1)外植体预处理
取生根的红掌无菌苗，冲洗干净，吸干多余水分，剪取0.2-0.5cm根尖作为外植体；
2)诱导胚性愈伤组织
将剪取的根尖接种于诱导培养基上，于25-28℃、黑暗条件下培养50-60天，诱导出胚性愈伤组织；
其中，所述的诱导培养基以改良MS培养基为基本培养基，并添加噻苯隆1.0-2.0mg/L；其中，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
3)增殖培养
将诱导出的胚性愈伤组织转入增殖培养基中，在25-28℃、黑暗条件下培养，每25-30天更换新鲜的增殖培养基，使胚性愈伤组织持续增殖；
其中，所述的增殖培养基以改良MS培养基为基本培养基，并添加了毒莠定0.8-1.0mg/L和玉米素0.8-1.0mg/L；其中，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
4)诱导胚状体
取转接至新鲜增殖培养基上生长15-20天的胚性愈伤组织，转接于胚状体发生培养基中，在温度为25-28℃、黑暗条件下，培养60-90天后，诱导产生胚状体并将其培养成熟；
其中，所述胚状体发生培养基以Pierik培养基为基本培养基，并添加了激动素0.2-0.5mg/L、脱落酸10-20mg/L、水解酪蛋白0.4-0.6g/L、PEG400015-25g/L和蔗糖35-40g/L。
优选地，步骤2)和3)中所述胚性愈伤诱导培养基及胚性愈伤增殖培养基中分别添加蔗糖25-30g/L和结冷胶2.8-3.0g/L，培养基pH值为5.75-5.85。
又，步骤4)所述胚状体诱导培养基中添加琼脂粉6.5-7.0g/L。
优选地，步骤5)所述1/2MS培养基中添加活性炭0.2-0.4g/L。
又，红掌品种为‘粉冠军’、‘阿拉巴马’、‘萨莫拉’或‘肯塔基’
进一步，所述组织培养方法还包括萌发及植株再生步骤，将成熟的胚状体转接到1/2MS培养基中萌发培养30-45天，获得再生红掌植株；培养条件为：温度25-28℃，光照时间14-16小时/天，光照强度为2000-3000勒克斯，1/2MS培养基中添加蔗糖15-20g/L。
本发明在对根尖的胚性愈伤诱导培养基中添加了噻苯隆TDZ1.0-2.0mg/L，该浓度的TDZ可以诱导根尖发生胚性愈伤组织，若浓度太低，则形成致密型白色愈伤，只能诱导不定芽发生，而浓度太高则易形成非胚性愈伤组织。
本发明在胚性愈伤增殖培养基中添加毒莠定和玉米素，两者配合使用，使红掌根尖愈伤组织在增殖的同时，能够保持胚性，实现胚性愈伤组织的增殖培养；本发明在胚状体发生培养基中添加了激动素和脱落酸，诱导胚状体的发生和成熟，添加的激动素能够促进红掌胚状体的发生，脱落酸则促进其成熟。
本发明所述改良MS培养基的配方(Murashige T and Skoog F,1962,A revisedmedium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.PhysiolPlant 15:473–479)如表1所示，mg/L表示每升改良MS培养基中含各成分的毫克数。
表1
本发明在诱导胚性愈伤组织及增殖培养基中采用改良MS培养基，降低了大量元素的浓度，可以缓解外植体的褐化，有利于愈伤的诱导；相比于MS培养基，Pierik培养基的大量元素含量减半，对铁盐和有机物进行了微调，更适合于红掌胚状体的发生，本发明所述Pierik培养基配方如表2所示，mg/L表示每升Pierik培养基中含各成分的毫克数。
表2
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用红掌的根尖为外植体，在胚性愈伤诱导培养基中添加了噻苯隆，能够稳定诱导愈伤组织发生，平均诱导率达到80％以上，得到的红掌组培苗生根较容易，且根系发达，外植体来源丰富，取材容易。
本发明针对性地设置了红掌根尖胚性愈伤组织的增殖条件，在增殖培养基中添加毒莠定和玉米素，使胚性愈伤组织进行大规模扩增，而且在增殖培养数年后，依然具有再生潜能，胚性愈伤可以作为遗传转化的优良受体材料，避免嵌合体植株的发生。
本发明中，在胚状体诱导培养基中添加了激动素和脱落酸，诱导胚状体的发生和成熟，每克愈伤组织平均能诱导产生40-50个胚状体，实现胚状体的大量规模化发生，建立红掌高效稳定的胚状体发生技术，可以应用于红掌的快速繁殖；本发明在将胚状体进行萌发培养时，将MS培养基的添加物含量均减半，可促进胚状体萌发，胚状体可以直接萌发成完整植株，不需要单独生根诱导，可提高植株移栽的成活率。
附图说明
图1为本发明实施例中红掌品种‘粉冠军’诱导胚性愈伤组织图。
图2为本发明实施例中红掌品种‘粉冠军’胚性愈伤组织增殖生长图。
图3为本发明实施例中红掌品种‘粉冠军’胚状体发生和成熟的效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例及对比例
一种‘粉冠军’红掌根尖诱导胚性愈伤发生和增殖、及胚状体发生和成熟的方法，培养步骤如下：
1)选取外植体：外植体来自上海市农业科学院林木果树研究所组培中心的‘粉冠军’红掌无菌瓶苗。
2)外植体的预处理：将生根良好的红掌组培苗取出，剪下根尖置于无菌罐头瓶中，加无菌水冲洗3遍，然后置于无菌滤纸上吸干多余水分，剪取根尖0.5cm的部分作为外植体。
3)诱导胚性愈伤组织：将剪取的根尖水平接种于胚性愈伤诱导培养基中，在25℃黑暗培养60天，记录诱导结果。
所述胚性愈伤诱导培养基以改良MS培养基(见表3)为基本培养基，分别添加不同浓度的噻苯隆TDZ(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、0.05mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L)、蔗糖30g/L和结冷胶2.8g/L，培养基pH值为5.7-5.8。
本实施例所述改良MS培养基的配方如表3所示，mg/L表示每升改良MS培养基中含各成分的毫克数。
表3
不同TDZ处理浓度对根尖诱导胚性愈伤的影响结果参见表4。
表4
可见，本发明的TDZ浓度下，可诱导出胚性愈伤组织，平均诱导率达到80％以上，获得的胚性愈伤组织为黄色、疏松状态，参见图1。
4)增殖培养：将诱导出的胚性愈伤进行增殖培养，转接到增殖培养基上，并且每个月转接一次，参见图2，每个月能增殖3-5倍。
所述增殖培养基中以改良MS培养基(见表3)为基本培养基，添加毒莠定1.0mg/L、玉米素(NAA)1.0mg/L、蔗糖30g/L，结冷胶2.8g/L，培养基pH值为5.75-5.85。
5)诱导胚状体：将转接至新鲜增殖培养基上生长15-20天的胚性愈伤组织转接于胚状体发生培养基，每皿接种0.5g胚性愈伤组织，培养温度为25℃，黑暗培养80天后，胚状体在愈伤表面产生，每克胚性愈伤组织平均能诱导出约50个胚状体，继续培养使胚状体成熟，参见图3。
由图3可见，可观察到胚状体的发育过程(球形胚、盾形胚、子叶胚)，畸形率在10％以内，大部分胚状体(70％以上)能正常发育形成完整植株。
其中，所述胚状体发生培养基中含有Pierik培养基(见表5)、激动素0.5mg/L、脱落酸10mg/L、水解酪蛋白0.5g/L、PEG4000 20g/L、蔗糖35g/L；琼脂粉7.0g/L，培养基pH值为5.75-5.85。
本实施例所述Pierik培养基配方如下表5所示，mg/L表示每升Pierik培养基中含各成分的毫克数。
表5
6)胚状体萌发和植株再生：将成熟的胚状体转接到1/2MS培养基(见表6)中，并添加蔗糖15g/L和活性炭0.2g/L，培养条件为：温度为28℃，光照时间14小时/天，光照强度为2000-3000勒克斯，经过30-45天，胚状体直接萌发成完整的红掌植株。
本实施例所述1/2MS培养基的配方如下表6所示，mg/L表示每升1/2MS培养基中含各成分的毫克数。
表6
Claims (6)
1.一种通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，包括以下步骤：
1)外植体的预处理
取生根的红掌无菌苗，冲洗干净，吸干多余水分，剪取0.2-0.5cm根尖作为外植体；
2)诱导胚性愈伤组织
将剪取的根尖接种于诱导培养基上，于25-28℃、黑暗条件下培养50-60天，诱导出胚性愈伤组织；
其中，所述的诱导培养基以改良MS培养基为基本培养基，并添加噻苯隆1.0-2.0mg/L；其中，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
3)增殖培养
将诱导出的胚性愈伤组织转入增殖培养基中，在25-28℃、黑暗条件下培养，每25-30天更换新鲜的增殖培养基，使胚性愈伤组织持续增殖；
其中，所述的增殖培养基以改良MS培养基为基本培养基，并添加了毒莠定0.8-1.0mg/L和玉米素0.8-1.0mg/L；其中，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
4)诱导胚状体
取转接至新鲜增殖培养基上生长15-20天的胚性愈伤组织，转接于胚状体发生培养基中，在温度为25-28℃、黑暗条件下，培养60-90天后，诱导产生胚状体并将其培养成熟；
其中，所述胚状体发生培养基以Pierik培养基为基本培养基，并添加了激动素0.2-0.5mg/L、脱落酸10-20mg/L、水解酪蛋白0.4-0.6g/L、PEG4000 15-25g/L和蔗糖35-40g/L。
2.根据权利要求1所述通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，其特征在于，步骤2)-3)中所述胚性愈伤诱导培养基及胚性愈伤增殖培养基中均添加蔗糖25-30g/L和结冷胶2.8-3.0g/L，培养基pH值为5.75-5.85。
3.根据权利要求1所述通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，其特征在于，步骤4)所述胚状体诱导培养基中添加琼脂粉6.5-7.0g/L。
4.根据权利要求1所述通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，其特征在于，步骤5)所述1/2MS培养基中添加活性炭0.2-0.4g/L。
5.根据权利要求1所述通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，其特征在于，红掌品种为‘粉冠军’、‘阿拉巴马’、‘萨莫拉’或‘肯塔基’。
6.根据权利要求1-5任一项所述通过根尖诱导产生红掌胚状体的组织培养方法，其特征在于，包括萌发及植株再生步骤，将成熟的胚状体转接到1/2MS培养基中萌发培养30-45天，获得再生红掌植株；培养条件为：温度25-28℃，光照时间14-16小时/天，光照强度为2000-3000勒克斯，1/2MS培养基中添加蔗糖15-20g/L。
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