CN104137777A - 一种获得红掌单倍体植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得红掌单倍体植株的方法,属于花卉苗木的遗传育种技术领域。方法包括:(1)培养基的配制;(2)花序的选择、低温预处理与消毒;(3)诱导愈伤组织;(4)增殖培养;(5)分化培养;(6)生根培养;(7)移栽炼苗;(8)染色体鉴定;(9)单倍体扩繁等步骤。本发明红掌花序经5-8℃低温预处理24-72h后,能显著提高其无菌花药的获得率和有效愈伤组织的诱导率,从而能有效获得红掌单倍体植株,且操作方法简便、可以作为育种材料进一步从中选育出红掌新品种,缩短育种年限。
Description
技术领域
本发明涉及花卉苗木的遗传育种技术领域,具体涉及一种获得红掌单倍体植株的方法。
背景技术
红掌(A.andraeanum)又名安祖花、花烛等,天南星科花烛属,原产哥伦比亚,是一种多年生、常绿、四季开花、观花观叶兼可的草本植物,可分为切花和盆栽两大类。由于红掌的花型奇特、颜色鲜艳多彩、生性耐荫、观赏期长等特点,在国内外的市场消费量很大,在全球热带花卉贸易中仅次于兰花名列第二。
单倍体(Haploid)是指具有配子染色体(n)的个体,一般是利用花药、花粉作外殖体进行组织培养,从小孢子经愈伤组织或胚状体产生植株,或以孤雌生殖、人工引变等方式产生具有配子体染色全数的植株(单倍体植株)。在育种上利用单倍体具有克服杂种分离、缩短育种年限和提高获得纯和材料的效率等优点。单倍体育种在粮食和果蔬作物上已研究较多,并已育成了一些烟草、水稻、小麦等优良品种,但对单倍体观赏植物的研究还处于起步阶段。目前红掌育种的主要方法还是以传统的杂交育种为主,存在育种周期长、进程慢、后代不稳定等问题,在国内还未见有关于红掌花药培养单倍体成功的文献报道。
发明内容
本发明目的是,针对红掌传统杂交育种存在周期长、进程慢、后代不稳定等问题,提出一种能克服杂种分离、缩短育种年限、获得高纯度红掌单倍体育种材料的方法,并进一步可从中选育出红掌的新品种。
本发明目的通过以下技术方案得以实现:
一种获得红掌单倍体植株的方法,该方法按以下步骤进行:
(1)培养基的配制:包括花药培养各阶段的培养基,其中,
1)诱导培养基:1/2MS基本培养基添加0.5-3mg/L 2,4-D、0.5-2mg/L 6-BA、30-70g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉,pH灭菌前5.8;
2)增殖培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
3)分化培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
4)生根培养基:1/2MS基本培养基添加1g/L活性炭、20g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
(2)花序的选择、低温预处理与消毒:待红掌佛焰苞花序抽出后,从中选择苞片即将开展的花序,剪下并除去其苞片,用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中,于5-8℃低温条件下处理24-72h;再将该花序用自来水冲洗3-5min,加少量洗洁精,轻轻搓洗片刻后,用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物,再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后,用0.1%升汞溶液摇晃消毒10-15min,倒掉升汞溶液,用无菌水冲洗5次后,备用;
(3)诱导愈伤组织:将低温预处理、消毒的花序用刀片横切,用解剖针剥出花药后,接种到诱导培养基中诱导培养4个月,其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织,且对污染花药要及时剔除;
(4)增殖培养:将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中,经继代培养至愈伤组织进入增殖期;
(5)分化培养:将快速增殖期的愈伤组织转接种到分化培养基上,诱导分化成芽;
(6)生根培养:当芽长至2cm时,从愈伤组织上切下并转接到生根培养基上诱导生根,长成幼苗;
(7)移栽炼苗:当幼苗长至4-5cm时,将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗;
(8)染色体鉴定:当移栽苗新根长出后,取其白色幼嫩根尖0.3-0.5 cm,于室温黑暗条件下,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉浸渍处理2-3 h;清水洗净后于4℃条件下用95%乙醇∶冰醋酸= 3 ∶1新鲜配制的卡诺固定液固定18-24 h;弃去固定液后将根尖置于37℃水浴中,用0.2mol/L HCl酸解15-20 min后,用蒸馏水冲洗3次;切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上,用镊子压碎根尖,弃去残渣,盖上盖玻片后,吸干多余的染料,在40×10倍显微镜下拍照、观察、鉴定;
(9)单倍体扩繁:将确定为单倍体的植株进行组培扩繁。
本发明具有以下几方面的有益效果:
1、本发明的红掌花序经5-8℃低温预处理24-72小时后,能有效提高无菌花药的获得率和有效愈伤组织的诱导率。如品种‘阿拉巴马(Alabamb)’的花序经过5-8℃低温预处理24-72h后,无菌花药的获得率平均为49.73%,而对照为26.7%,提高了86.25%;有效愈伤诱导率平均为24.24%,而对照为13.47%,提高了79.92%;单倍体诱导率平均为33.75%,而对照为20%,提高了68.75%;对品种‘燕尾红(Loattails Red)’来说,效果更加明显,无菌花药的获得率从对照的7.14%提高到平均25.43%,有效愈伤诱导率从对照0提高到平均11.85%,单倍体诱导率从对照0提高到平均30%。(见试验例).
(2)本发明中的红掌花序5-8℃低温预处理24-72h比现有的报道10℃低温预处理3d(杜宝贵,黄丽娟,张志胜等. 红掌花药培养. 生物技术通讯,2009年增刊:189-195.)能有效提高花药膨大率和有效愈伤组织的诱导率。10℃低温预处理3d后的花药膨大率最高为17.33%,花药有效愈伤诱导率最高为1.67%,而本发明中的花药膨大率最高为87%;花药有效愈伤诱导率最高为29%。(见实施例6、7和2)
(3)本发明能有效得到红掌单倍体,而之前的有关报道表明得到的花药再生植株均是二倍体,并没有得到红掌单倍体。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的具体说明,但本发明的内容并不局限于此。
实施例1:(获得红掌品种‘阿拉巴马(Alabamb)’单倍体植株的方法1)
该方法按以下步骤进行:
(1)培养基的配制:包括花药培养各阶段的培养基,其中,
1)诱导培养基:1/2MS基本培养基添加0.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉,pH灭菌前5.8;
2)增殖培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
3)分化培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
4)生根培养基:1/2MS基本培养基添加1g/L活性炭、20g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
(2)花序的选择、低温预处理与消毒:以红掌品种‘阿拉巴马(Alabamb)’为试材,待佛焰苞花序抽出后,从中选择苞片即将开展的花序,剪下并除去其苞片,用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中,于5℃低温条件下处理24h;将该花序用自来水冲洗3-5min后,加少量洗洁精,轻轻搓洗片刻后,用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物,再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后,用0.1%升汞溶液摇晃消毒10-15min;倒掉升汞溶液,用无菌水冲洗5次后,备用;
(3)诱导愈伤组织:将低温预处理与消毒后的花序用刀片横切,用解剖针剥出花药后,按每瓶接种30-50粒花药接种到诱导培养基中,在25-27℃自然散射光下培养,共接种10瓶;其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织,污染花药则需及时剔除,共诱导培养4个月,该例7d后得到的无菌花药率为42.00%, 15d花药膨大率为76.14%,40d后有效愈伤诱导率为20.00%;
(4)增殖培养:将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中,经继代培养至愈伤组织进入增殖期;
(5)分化培养:将快速增殖期的愈伤组织接种到分化培养基上,诱导分化成芽;
(6)生根培养:当幼苗芽长至2cm时,将其从愈伤组织上切下并转接至生根培养基上,4d后开始长根, 20d后根长至1-2cm, 50d后全部生根;
(7)移栽炼苗:当幼苗长至4-5cm时,将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗;
(8)染色体鉴定:当移栽苗新根长出后,取其白色幼嫩根尖0.3cm,于室温黑暗条件下,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h;用清水洗净,于4℃条件下用95%乙醇∶冰醋酸= 3 ∶1新鲜配制的卡诺固定液固定18 h;弃去固定液后将根尖置于37℃水浴中,用0.2mol/L HCl酸解15 min后并用蒸馏水冲洗3次;切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上,用镊子压碎根尖,弃去残渣,盖上盖玻片,吸干多余的染料,在40×10倍显微镜下拍照、观察、鉴定染色体,其中有35%左右的苗为单倍体;
(9)单倍体扩繁:将确定为单倍体的植株进行组培扩繁后,分化形成的新苗均为单倍体。
实施例2:(获得红掌品种‘阿拉巴马(Alabamb)’单倍体植株的方法2):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为1.5mg/L, 6-BA为1mg/L,蔗糖为45g/L;步骤(2)花序于6℃低温条件下处理36h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.4cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h,用卡诺固定液固定20 h,用0.2mol/L HCl酸解17 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为59.42%,花药膨大率为75.50%,有效愈伤诱导率为29.00%,步骤(8)中单倍体苗比例为40%左右。
实施例3:(获得红掌品种‘阿拉巴马(Alabamb)’单倍体植株的方法3):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为2.5mg/L, 6-BA为1.5mg/L,蔗糖为55g/L;步骤(2)花序于7℃低温条件下处理48h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.5cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h,用卡诺固定液固定22 h,用0.2mol/L HCl酸解19 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为43.33%,花药膨大率为60.82%,有效愈伤诱导率为19.21%,步骤(8)中单倍体苗的比例为30%左右。
实施例4:(获得红掌品种‘阿拉巴马(Alabamb)’单倍体植株的方法4):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为3mg/L, 6-BA为2mg/L,蔗糖为70g/L;步骤(2)花序于8℃低温条件下处理72h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.4cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h,用卡诺固定液固定24 h,用0.2mol/L HCl酸解20 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为23.5%,花药膨大率为83.78%,有效愈伤诱导率为23%,步骤(8)中单倍体苗的比例为30%左右。
实施例5:(获得红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’单倍体植株的方法5):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为0.5mg/L, 6-BA为0.5mg/L,蔗糖为30g/L;步骤(2)以红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’为试材,其花序于5℃低温条件下处理24h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.3cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h,用卡诺固定液固定18 h,用0.2mol/L HCl酸解15 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为24.5%,花药膨大率为70.61%,有效愈伤诱导率为5%,步骤(8)中单倍体苗的比例为30%左右。
实施例6:(获得红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’单倍体植株的方法6):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为1.5mg/L, 6-BA为1mg/L,蔗糖为45g/L;步骤(2)以红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’为试材,其花序于6℃低温条件下处理36h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.4cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h,用卡诺固定液固定20 h,用0.2mol/L HCl酸解17 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为33.3%,花药膨大率为87.71%,有效愈伤诱导率为13.49%,步骤(8)中单倍体苗的比例为35%左右。
实施例7:(获得红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’单倍体植株的方法7):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为2.5mg/L, 6-BA为1.5mg/L,蔗糖为55g/L;步骤(2)以红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’为试材,其花序于7℃低温条件下处理48h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.4cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h,用卡诺固定液固定22 h,用0.2mol/L HCl酸解19 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为20.5%,花药膨大率为87.8%,有效愈伤诱导率为12%,步骤(8)中单倍体苗的比例为30%左右。
实施例8:(获得红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’单倍体植株的方法8):
本例中,步骤(1)诱导培养基配方添加的2,4-D为3mg/L, 6-BA为2mg/L,蔗糖为70g/L;步骤(2)以红掌品种‘燕尾红(Loattails Red)’为试材,其花序于8℃低温条件下处理72h;步骤(8)取其白色幼嫩根尖0.5cm,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h,用卡诺固定液固定24 h,用0.2mol/L HCl酸解20 min;其余步骤工艺同于实施例1,结果:步骤(3)得到的无菌花药率为18.37%,花药膨大率为86.19%,有效愈伤诱导率为12.73%,步骤(8)中单倍体苗的比例为35%左右。
试验例(不同品种不同花序预处理对花药诱导培养的影响试验):
本试验于2011年在杭州进行,红掌参试品种2个为 ‘阿拉巴马(Alabamb)’和 ‘燕尾红(Loattails Red)’,花序低温预处理设为5℃/24h、6℃/36h、7℃/48h、8℃/72h及不预处理直接消毒接种(对照)共5个,其余步骤工艺均相同。每个处理接种15瓶,每瓶约接30-50个花药,一个花序约可接5瓶,接种后在25℃左右自然散射光下培养。在培养过程中:每隔3-5天观察并记录污染花药数一次;40天后统计膨大的花药个数;4个月后统计成活愈伤组织块数;8个月后瓶苗移栽;12个月后进行染色体鉴定。并按照下述公式计算无菌花药率、花药膨大率和有效愈伤诱导率:
无菌花药率=无污染瓶数/接种总瓶数×100%,
花药膨大率=发生膨大的花药数/无菌花药总数×100%,
有效愈伤诱导率=愈伤成活数/无菌花药总数×100%。
试验结果表明: 5-8℃低温预处理24-72h均能有效提高无菌花药的获得率、有效愈伤组织的诱导率以及单倍体诱导率(见表1)。品种‘阿拉巴马(Alabamb)’的花序经过5-8℃低温预处理24-72h后,无菌花药的获得率平均为49.73%,而对照为26.7%,提高了86.25%;有效愈伤诱导率平均为24.24%,而对照为13.47%,提高了79.92%;单倍体诱导率平均为33.75%,而对照为20%,提高了68.75%;对品种‘燕尾红(Loattails Red)’来说,效果更加明显,无菌花药的获得率从对照7.14%提高到平均25.43%,有效愈伤诱导率从对照0提高到平均11.85%,单倍体诱导率从对照0提高到平均30%。
表1 不同品种不同预处理的花药诱导培养结果
Claims (1)
1.一种获得红掌单倍体植株的方法,其特征在于按以下步骤进行:
(1)培养基的配制:包括花药培养各阶段的培养基,其中,
1)诱导培养基:1/2MS基本培养基添加0.5-3mg/L 2,4-D、0.5-2mg/L 6-BA、30-70g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉,pH灭菌前5.8;
2)增殖培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
3)分化培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
4)生根培养基:1/2MS基本培养基添加1g/L活性炭、20g/L蔗糖,pH灭菌前5.8;
(2)花序的选择、低温预处理与消毒:待红掌佛焰苞花序抽出后,从中选择苞片即将开展的花序,剪下并除去其苞片,用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中,于5-8℃低温条件下处理24-72h;再将该花序用自来水冲洗3-5min,加少量洗洁精,轻轻搓洗片刻后,用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物,再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后,用0.1%升汞溶液摇晃消毒10-15min,倒掉升汞溶液,用无菌水冲洗5次后,备用;
(3)诱导愈伤组织:将低温预处理、消毒的花序用刀片横切,用解剖针剥出花药后,接种到诱导培养基中诱导培养4个月,其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织,且对污染花药要及时剔除;
(4)增殖培养:将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中,经继代培养至愈伤组织进入增殖期;
(5)分化培养:将快速增殖期的愈伤组织转接种到分化培养基上,诱导分化成芽;
(6)生根培养:当芽长至2cm时,从愈伤组织上切下并转接到生根培养基上诱导生根,长成幼苗;
(7)移栽炼苗:当幼苗长至4-5cm时,将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗;
(8)染色体鉴定:当移栽苗新根长出后,取其白色幼嫩根尖0.3-0.5 cm,于室温黑暗条件下,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉浸渍处理2-3 h;清水洗净后于4℃条件下用95%乙醇∶冰醋酸= 3 ∶1新鲜配制的卡诺固定液固定18-24 h;弃去固定液后将根尖置于37℃水浴中,用0.2mol/L HCl酸解15-20 min后,用蒸馏水冲洗3次;切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上,用镊子压碎根尖,弃去残渣,盖上盖玻片后,吸干多余的染料,在40×10倍显微镜下拍照、观察、鉴定;
(9)单倍体扩繁:将确定为单倍体的植株进行组培扩繁。
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