CN1254532C - 一种漆酶及其编码基因与工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种漆酶及其编码基因与工程菌。本发明所提供的木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。木质层孔菌(Fomelignosus)漆酶，是序列表中的SEQ ID №：2。本发明的产漆酶工程菌的发酵方法简单可行，培养基便宜易得，产酶能力强，易于工业化生产，大大降低了生产成本，提高了经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及真菌基因工程领域中一种蛋白及其编码基因，特别涉及担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶及其编码基因。
背景技术
漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，与植物抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝蛋白家族，具有广泛的底物作用范围。
1883年首次在日本紫胶漆树的渗出液中发现漆酶，随后人们发现漆酶广泛存在于高等植物和真菌中。漆酶多为单体酶，且酶分子中含有4个铜原子，所有铜原子都参与漆酶将底物氧化并同时伴随着分子氧还原为水的催化过程。绝大多数的真菌漆酶为分泌型糖蛋白。
漆酶具有广泛的底物作用范围，可以氧化降解多种酚类化合物和芳香胺类化合物，在有小分子介质存在的情况下，该酶的底物范围可进一步拓宽。这就使得漆酶在很多领域，如造纸工业中纸浆漂白、印染工业中废水处理、医药领域中进行生物检测、以及食品工业、有机合成、有机农药降解等，具有重要的应用价值。要实现这些应用价值，必须有质优价廉的酶源。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种能够产生较强酶活力的产漆酶菌株及其分泌的漆酶与编码基因，同时还提供产酶活力更高的基因工程菌株。
能产生漆酶的菌株是担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132；已于2003年08月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №0992。利用该菌产生的漆酶可将染料RBBR降解，使得含有RBBR的蓝色平板培养基产生无色透明圈。担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC№0992在PDA综合固体培养基上，白色菌丝体呈放射状生长，平铺于固体培养基表面。担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992的产酶活力为2-3U/ml。
本发明所提供的木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶基因，来源于担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。
序列表中序列1的DNA序列由2201个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1位到第2201位碱基，包含2201个碱基对。该序列中含有11个内含子，分别为5’端第184位到第239位碱基，5’端第309位到第366位碱基，5’端第488位到第544位碱基，5’端第659位到第710位碱基，5’端第775位到第832位碱基，5’端第926位到第977位碱基，5’端第1336位到第1390位碱基，5’端第1448位到第1502位碱基，5’端第1710位到第1773位碱基，5’端第1891位到第1973位碱基，5’端第2090位到第2145位碱基。其cDNA如序列表中序列3，由1557个碱基组成。
担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质。
序列表中SEQ ID №：2由518个氨基酸残基组成，自氮端第1-21位氨基酸残基，是N-端信号肽序列(含有21个氨基酸残基)；成熟酶为497个氨基酸残基。
担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992的产酶活力虽然已达2-3U/ml，但这仍不能满足工业生产的需求，进行基因克隆并实现该酶的异源表达有望得到廉价酶源。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体，如重组表达载体pGAPZA/lcc(图谱如图1所示)。重组表达载体pGAPZA/lcc，转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115后得到的工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115-lcc-602，CGMCC № 0993，已于2003年08月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 0993。
工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115-lcc-602，CGMCC №0993，该菌为球形或椭球性，大小为(2.0-4.0)×(2.2-5.8)μm，为单生或对生，菌落为乳酪色有光泽。
本发明提供了产漆酶原始菌株担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS5.132，CGMCC № 0992。为了提高产酶活力，又克隆了漆酶的DNA(2201bp)和cDNA(1557bp)序列并构建了一个含有漆酶cDNA的重组质粒，转化巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115得到产漆酶工程菌(Pichia pastoris)GS115-lcc-602，CGMCC № 0993，在最佳发酵条件下，酶活力可达9单位/毫升，其产酶活力是原始菌株-担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992(产酶活力为2-3U/ml)的3倍，最适产酶时间比原始菌株缩短3-5天。该工程菌产酶特征是分子量为66500，为单体酶。本发明的产漆酶工程菌的发酵方法简单可行，培养基便宜易得，产酶能力强，易于工业化生产，大大降低了生产成本，提高了经济效益。
附图说明
图1为重组表达载体pGAPZA/lcc的物理图谱
具体实施方式
实施例1、担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992来源漆酶的cDNA克隆
担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992的cDNA具体包括以下步骤：
1、采用TRIZOL总RNA抽提试剂盒(GIBCOBRL公司产品)抽提担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992的总RNA。
2、以Oligo-(dT)15(Promega)为引物，按照常规方法反转录合成cDNA。
3、按照漆酶中第一和第四个铜原子结合区氨基酸序列设计简并引物，以步骤1中的cDNA为模板克隆漆酶cDNA的中间序列，所得PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，得到漆酶cDNA的中间序列，大小约为1.2Kb。所设计的简并引物序列如下：
PI：5’-CA(CT)TGGCA(CT)GG(AGCT)TT(CT)TT(CT)CA-3’
PIV：5’-TG(AG)AA(AG)TC(AGT)AT(AG)TG(AG)CA(AG)TG-3’
4、根据步骤3中克隆得到的cDNA中间序列设计一系列引物，通过5’-RACE和3’-RACE的方法钓取漆酶cDNA的两端序列。所设计的两对基因特异性引物(GSP)如下：
RT-P*：5’-pGAAGTCGATGTGGC-3’ (5’-RACE)
PA：5’-GTGCTGGAAGAACCCATGCCA-3’ (5’-RACE)
PS：5’-CCGGTGACAACGTAACCATTCGT-3’ (5’-RACE和3’-RACE)
Adapter：5’-CTGATCTAGACCTGCAGGCTCGAG-3’ (3’-RACE)。
5、根据步骤4中克隆到的cDNA两端序列设计引物，以步骤2中得到的cDNA为模板克隆到漆酶的全长cDNA，PCR产物大小约为1.6Kb。为构建重组表达载体，在5’-端引物引入EcoR I位点，在3’-端引物引入Not I位点与表达载体pGAPZA上的酶切位点相匹配。所设计的引物为：
PNS：5’-TGAC
GAATTCATGTTCCGCTTCAACACG-3’
PCS：5’-TA
GCGGCCGCTCAGTGGTCAGAAGGG-3’
PCR产物经QIAGEN GEL EXTRACTION KIT(#28704)回收纯化，送上海生工测序部测序。测得的担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992漆酶的cDNA序列如序列表中序列3，含有1557bp。担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS5.132，CGMCC №0992漆酶的氨基酸序列如序列表中序列2。该漆酶含有518个氨基酸残基，自氮端第1-21位氨基酸残基，是N-端信号肽序列(含有21个氨基酸残基)；成熟酶为497个氨基酸残基。该酶具有漆酶的所有保守特征，包括：铜原子结合区(自氮端第85、130、419、47l位氨基酸残基)、N-糖基化位点(自氮端第35、187、313、400、455位氨基酸残基)以及用于生成二硫键的半胱氨酸等等。利用DNAman软件将该序列与已报道的几种漆酶氨基酸序列进行比较，其同源性与Trametes villosa lcc1为67％，与Trametes versicolor lcc1为66％，与Lentinula edodes lcc1为63％，与Pycnoporus cinnabarinus lcc1为53％，与Coriolus versicolor来源的漆酶同源性为30％。
实施例2、担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992漆酶的基因克隆
1、按照Xu F(1994)的方法提取担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC№0992的基因组DNA(Xu F，HJ Yoell，JB Anderson(1994)An efficient protocolfor isolating DNA from higher fungi.Trends Genet 10：226-227)。
2、根据担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992漆酶的cDNA两端序列设计引物，以基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，得到担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992漆酶的基因序列，PCR产物大小约为2.2Kb。所设计的引物序列为：
PNS：5’-TGACGAATTCATGTTCCGCTTCAACACG-3’
PCS：5’-TAGCGGCCGCTCAGTGGTCAGAAGGG-3’
PCR产物经QIAGEN GEL EXTRACTION KIT(#28704)回收纯化，送上海生工测序部测序。测得的担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992漆酶的DNA序列如序列表中序列1；该基因含有2201bp，与漆酶的cDNA序列比较发现该序列中含有11个内含子，分别为5’端第184位到第239位碱基，5’端第309位到第366位碱基，5’端第488位到第544位碱基，5’端第659位到第710位碱基，5’端第775位到第832位碱基，5’端第926位到第977位碱基，5’端第1336位到第1390位碱基，5’端第1448位到第1502位碱基，5’端第1710位到第1773位碱基，5’端第1891位到第1973位碱基，5’端第2090位到第2145位碱基。
实施例3、工程菌的构建
1、构建重组表达质粒
担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶cDNA经EcoR I和Not I双酶切后与经相同限制性内切酶作用的pGAPZA按常规方法连接。所构建的重组表达载体pGAPZA/lcc如图1所示。
2、重组表达载体经Bsp HI线性化，按常规方法电激转化Pichiapastoris GS115，利用Zeocin抗性筛选阳性转化子，利用ABTS(2，2’-偶氮-双-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸))显色反应筛选漆酶产生菌株。结果得到产漆酶工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-lcc-602，CGMCC № 0993。
3、产漆酶工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-lcc-602 CGMCC№ 0993的最佳发酵条件和产酶活力
所得到的产漆酶工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115-lcc-602CGMCC № 0993利用YPD(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖和0.4mMCu2+)液体培养基，在20℃培养3天，取1ml发酵液，5000rpm离心5min，上清即为粗酶液。在含有100mM、pH4.5的醋酸盐缓冲溶液，0.5mM ABTS和100μl粗酶液的1ml反应体系中，25℃水浴保温5min，测OD420。结果酶活力达9.03U/mL；其产酶活力是原始菌株的3倍(原始菌株担子菌木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992漆酶产酶活力为2-3U/ml)，最适产酶时间比原始菌株缩短5天。其中酶活力是指在上述条件下，每分钟催化1μmolABTS氧化所需的酶量。
4、产漆酶工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-lcc-602 CGMCC№ 0993所产漆酶的性质
所产粗酶液在pH6.0-10.0的范围内稳定；在pH4.5、30℃保温24hrs残余酶活大于60％。经硫酸铵沉淀、DEAE纤维柱层析、Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow疏水柱层析得到电泳纯的漆酶。SDS-PAGE表明，产漆酶工程菌产漆酶巴氏毕赤酵母菌(Pichiapastoris)GS115-lcc-602，CGMCC № 0993所产漆酶的分子量大小约为66.5KD。该酶的最适反应温度为55℃，最适pH为2.4；以ABTS为底物，该酶的Km为177μM，Vmax为23.54μmol min-1。
序列表
<160>3
<210>1
<211>2201
<212>DNA
<213>层孔菌属木质层孔菌(Fome lignosus)
<400>1
atgttccgct tcaacacgtt ctctaccctc atccctctcg cattatctct tggtgtcaga 60
gccgctattg gccctgtagc tgatctccac atttccaatg ctaacatctc tcccgatggc 120
ttcactcgtg cagccgttct cgctggcggg tccttccctg gacctcttat tactggcaat 180
aaggtgagtt attcagtgtc tttgagagga tgttcaatag ctcatagcgt atcgcatagg 240
gtgacaactt ccagatcaac gtgatcaacg acctcaccga tgcagaccaa ctcaagacca 300
ccaccattgt aagccgattt tttactctca ttaaatgcac gacactaact taacactatt 360
ctatagcact ggcatggttt cttccagcac ggtactaact gggctgacgg cccggctttc 420
atcaatcagt gtcctattgc ctccggcaac tcgttcttgt ataacttcca agttcctgac 480
caagctggtt cggcaatctc tctaaatcct tgtttctcat catattgatt ctggtgcctt 540
tcaggtacat tctggtatca cagccatctc tcgactcagt attgtgacgg actccgcgga 600
gcattcgtgg tctatgatcc cgatgaccca catgcaagtt tgtacgacgt cgatgatggt 660
atgtatgctc ctctcacgat gatcgctcaa tcttatacct tgcaatgcag agagtaccgt 720
catcgctctt gcagactggt accatggcct agcgcggttg ggtccgaagt tcccgtacgt 780
cagagttatt gtgtaccttg atcgtttttc gctgacatga ctttggcaat agcaccacta 840
actcgacact cattaacggc cttggtcgtt acgatttcgg accctcctcc gacttggctg 900
tcatctccgt gcaagctgga aagcggtacg tatacattct gatcctcagg tgacatatgg 960
ctcatttctc ctgccaggta ccgtttccgt ctggtctcta tctcgtgcga ctcgaactac 1020
gtcttctcca tcgacgagca caccttcacc gtcatcgaag tcgatggtgt caaccaccaa 1080
cctgtcgatg ctgattccct ccaaatcttc gccggtcaac ggtactctat cgtggtcaat 1140
gccgacaaat cggaaggagg caattattgg attcgtgcct cacctactcc tggtcctcaa 1200
ggatttgcca atggaatcaa ctctgctatc ttgcgctatg tcggttccga tgaggttgag 1260
cctaccacca accagactac gagcacaaac ccgcttgtgg aggctaactt ggtgcccctt 1320
gagaaccctg gagcggtaag ttctcatttc ttggtttctc gtcgtcgacg ctcatatgct 1380
atctgatcag cctggtgacc ccacacccgg cggcgtcgat gtccccctca acctcgcagt 1440
cgctttcgtg agtacctgcg actctattga ctttcctatg caactcattt gcccgcatac 1500
aggatggtac aggactcgac ttccaggtca acggacagac tttcatcccg cctaccgttc 1560
ccgtcttgct gcaaattctc agcggagctc aatctgctac agaccttctc ccaagcggaa 1620
gcgtctacgt tcttcccagc aacgctacgg tcgaaataag cattccagct ggcgccgtcg 1680
gcggtcctca ccccattcat ttgcacggtg taagttattc atcacaacat caatccagct 1740
catcttctga cgcgcatttt tttgtgaccg cagcacacat tcgatgtcgt ccgaagtgcc 1800
ggcagcagca cttataacta tgtcaacccg cctcgtcgcg acgtcgtcag cattggtaac 1860
gccggtgaca acgtaaccat tcgtttccgg gtaagtctta cttctatgaa cccacgaatc 1920
catgaaactg cgccgcttaa tgagccactg gtcactgata acacatcttg tagactgata 1980
accctggacc atggttcctc cattgccaca tcgactggca tctcgaagct ggctttgctg 2040
ttgtcttcgc tgaagacatc cccaacgtcg cctcagtcaa ctcccctcct cgtgagtacc 2100
ttccgcgcaa gtacggattt gatcaattgc tgacgtcttt tacagaggcc tggagcgacc 2160
tttgccctat ctatgatgcg cttgaccctt ctgaccactg a 2201
<210>2
<211>518
<212>PRT
<213>层孔菌属木质层孔菌(Fome lignosus)
<400>2
Met Phe Arg Phe Asn Thr Phe Ser Thr Leu Ile Pro Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Val Arg Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu His Ile Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Ile Ser Pro Asp Gly Phe Thr Arg Ala Ala Val Leu Ala
35 40 45
Gly Gly Ser Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Lys Gly Asp Asn
50 55 60
Phe Gln Ile Asn Val Ile Asn Asp Leu Thr Asp Ala Asp Gln Leu Lys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln His Gly Thr Asn Trp
85 90 95
Ala Asp Gly Pro Ala Phe Ile Asn Gln Cys Pro Ile Ala Ser Gly Asn
100 105 110
Ser Phe Leu Tyr Asn Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp
115 120 125
Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Ala
130 135 140
Phe Val Val Tyr Asp Pro Asp Asp Pro His Ala Ser Leu Tyr Asp Val
145 150 155 160
Gly Asp Glu Ser Thr Val Ile Ala Leu Ala Asp Trp Tyr His Gly Leu
165 170 175
Ala Arg Leu Gly Pro Lys Phe Pro Thr Thr Asn Ser Thr Leu Ile Asn
180 185 190
Gly Leu Gly Arg Tyr Asp Phe Gly Pro Ser Ser Asp Leu Ala Val Ile
195 200 205
Ser Val Gln Ala Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Ile Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Asn Tyr Val Phe Ser Ile Asp Glu His Thr Phe Thr Val
225 230 235 240
Ile Glu Val Asp Gly Val Asn His Gln Pro Val Asp Ala Asp Ser Leu
245 250 255
Gln Ile Phe Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Ile Val Val Asn Ala Asp Lys
260 265 270
Ser Glu Gly Gly Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Ser Pro Thr Pro Gly Pro
275 280 285
Gln Gly Phe Ala Asn Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Val Gly
290 295 300
Ser Asp Glu Val Glu Pro Thr Thr Asn Gln Thr Thr Ser Thr Asn Pro
305 310 315 320
Leu Val Glu Ala Asn Leu Val Pro Leu Glu Asn Pro Gly Ala Pro Gly
325 330 335
Asp Pro Thr Pro Gly Gly Val Asp Val Pro Leu Asn Leu Ala Val Ala
340 345 350
Phe Asp Gly Thr Gly Leu Asp Phe Gln Val Asn Gly Gln Thr Phe Ile
355 360 365
Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala Gln Ser
370 375 380
Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Val Tyr Val Leu Pro Ser Asn
385 390 395 400
Ala Thr Val Glu Ile Ser Ile Pro Ala Gly Ala Val Gly Gly Pro His
405 410 415
Pro Ile His Leu His Gly His Thr Phe Asp Val Val Arg Ser Ala Gly
420 425 430
Ser Ser Thr Tyr Asn Tyr Val Asn Pro Pro Arg Arg Asp Val Val Ser
435 440 445
Ile Gly Asn Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Arg Thr Asp Asn
450 455 460
Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Trp His Leu Glu Ala
465 470 475 480
Gly Phe Ala Val Val Phe Ala Glu Asp Ile Pro Asn Val Ala Ser Val
485 490 495
Asn Ser Pro Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Asp Ala
500 505 510
Leu Asp Pro Ser Asp His
515
<210>3
<211>1557
<212>DNA
<213>层孔菌属木质层孔菌(Fome lignosus)
<400>3
atgttccgct tcaacacgtt ctctaccctc atccctctcg cattatctct tggtgtcaga 60
gccgctattg gccctgtagc tgatctccac atttccaatg ctaacatctc tcccgatggc 120
ttcactcgtg cagccgttct cgctggcggg tccttccctg gacctcttat tactggcaat 180
aagggtgaca acttccagat caacgtgatc aacgacctca ccgatgcaga ccaactcaag 240
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gctttcatca atcagtgtcc tattgcctcc ggcaactcgt tcttgtataa cttccaagtt 360
cctgaccaag ctggtacatt ctggtatcac agccatctct cgactcagta ttgtgacgga 420
ctccgcggag cattcgtggt ctatgatccc gatgacccac atgcaagttt gtacgacgtc 480
ggtgatgaga gtaccgtcat cgctcttgca gactggtacc atggcctagc gcggttgggt 540
ccgaagttcc ccaccactaa ctcgacactc attaacggcc ttggtcgtta cgatttcgga 600
ccctcctccg acttggctgt catctccgtg caagctggaa agcggtaccg tttccgtctg 660
gtctctatct cgtgcgactc gaactacgtc ttctccatcg acgagcacac cttcaccgtc 720
atcgaagtcg atggtgtcaa ccaccaacct gtcgatgctg attccctcca aatcttcgcc 780
ggtcaacggt actctatcgt ggtcaatgcc gacaaatcgg aaggaggcaa ttattggatt 840
cgtgcctcac ctactcctgg tcctcaagga tttgccaatg gaatcaactc tgctatcttg 900
cgctatgtcg gttccgatga ggttgagcct accaccaacc agactacgag cacaaacccg 960
cttgtggagg ctaacttggt gccccttgag aaccctggag cgcctggtga ccccacaccc 1020
ggcggcgtcg acgtccccct caacctcgca gtcgctttcg atggtacagg actcgacttc 1080
caggtcaacg gacagacttt catcccgcct accgttcccg tcttgctgca aattctcagc 1140
ggagctcaat ctgctacaga ccttctccca agcggaagcg tctacgttct tcccagcaac 1200
gctacggtcg aaataagcat tccagctggc gccgtcggcg gtcctcaccc cattcatttg 1260
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ggctttgctg ttgtcttcgc tgaagacatc cccaacgtcg cctcagtcaa ctcccctcct 1500
caggcctgga gcgacctttg ccctatctat gatgcgcttg acccttctga ccactga 1557
Claims (9)
1、木质层孔菌(Fome lignosus)AS 5.132，CGMCC №0992。
2、木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。
3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶基因的cDNA序列是序列表中的SEQ ID №：3。
4、木质层孔菌(Fome lignosus)漆酶，是序列表中的SEQ ID №：2。
5、含有权利要求2所述基因的表达载体。
6、根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述载体为pGAPZA/lcc。
7、含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。
8、含有权利要求2所述基因的工程菌。
9、根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-1cc-602 CGMCC № 0993。
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