CN1858211A - 一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明选择在GenBank上发表的其它来源的丝氨酸蛋白酶的编码基因，利用DNAman生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计了一对简并引物。以异形隔指孢的基因组DNA作为模板，利用简并引物扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列。再利用DNA Walking SpeedUpTM Premix试剂盒扩增得到5′端的未知序列，把两段序列进行拼接得到异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列。异形隔指孢所产生的胞外蛋白酶对线虫有较高的杀虫活性，可以通过分子生物学手段把该蛋白酶编码基因Dv1转化其它的线虫生防真菌，实现Dv1的异源表达，提高线虫生防真菌胞外蛋白酶的表达量和对植物寄生线虫的生防能力。
Description
技术领域：
本发明涉及一种新的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶基因和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一大类重要的植物病害，每年造成损失巨大。在线虫生物防治中，食线虫真菌是一类非常重要的线虫生防资源，目前已有包括线虫必克等商品化的线虫生防制剂上市。
在线虫侵染过程中，无论是对于线虫虫体或者虫卵来说，其覆盖于表面的体壁或卵壳都是防止侵染的重要保护结构。线虫的体壁主要由包括角蛋白、胶原蛋白在内的蛋白质和纤维质所构成，卵壳则主要是由几丁质层构成。体壁和卵壳共同形成了防止侵染的主要屏障。研究表明，在食线虫菌物侵染线虫的过程中，主要是机械作用与蛋白酶等水解酶共同作用的结果，其中显微结构和组织化学的研究表明，至少在线虫体壁的刺入、线虫被侵入、线虫的消化等过程中均有蛋白酶和水解酶的参与。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助完成侵染过程，是线虫侵染的重要毒力因子。因此，从食线虫菌物中获取蛋白酶基因，通过分子生物学手段对现有生防菌株的基因组DNA进行改造，增加蛋白酶基因的拷贝数和表达水平是提高食线虫真菌生防能力的重要手段之一。
发明内容：
本发明的目的是通过对一株产生胞外丝氨酸酶并能够有效分解线虫体壁结构的捕食线虫真菌异形隔指孢的研究，报道一种新的丝氨酸蛋白酶和编码基因。
本实验室在前期的研究中，从土壤中分离了一株食线虫真菌隔指孢(Dactylellasp.，YMF1.00118)，并命名为异形隔指孢(Dactylella varietas)，在PL-4培养液中能分泌降解线虫体壁的胞外丝氨酸蛋白酶。根据对GenBank所报道的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶的同源性分析，我们设计了一对简并引物，以异形隔指孢的基因组DNA作为模板扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列，并通过DNA Walking技术扩增得到5′端未知的基因序列，把两段序列进行拼接得到异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列。利用生物学软件对蛋白酶编码基因进行分析后发现该蛋白酶编码基因没有内含子序列，而且所编码的氨基酸序列也和目前所报道的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶的氨基酸组成有比较大的差异，应该是丝氨酸蛋白酶家族的一个新的蛋白酶成员。
由于胞外丝氨酸蛋白酶是参与食线虫真菌侵染线虫的重要毒力因子。因此，可以通过分子生物学手段对现有商品化的线虫生防菌株的基因组DNA进行改造，把异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因通过共转化或根癌农杆菌介导的转化技术转入线虫生防菌，增加蛋白酶编码基因的拷贝数和表达水平，提高食线虫真菌生防能力。
经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
本发明是这样实现的
一.异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的扩增
1.异形隔指孢(Dactylella varietas)YMF1.00118菌株的培养
1)试管种培养
培养基配方为改良型PDA培养基：1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8-2％琼脂；pH自然。将YMF1.00118菌丝体接种到培养基上，20-25℃下培养7～10天，获得试管种。
2)培养皿扩大培养
采用前述1改良型PDA培养基，直径为9厘米培养皿，接种YMF1.00118后，用封口膜封口后于20-25℃下培养7～10天，获得用于液体扩大培养的菌种。
3)液体扩大培养(产酶培养)
产酶培养基(PL-4)组成如下：0.1％葡萄糖，0.1％硫酸铵，0.05％硫酸镁，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亚铁，用水补充体积至1L，pH6.5。每个250ml三角瓶分装60ml培养液，并加入少量的线虫作为诱导物，121℃灭菌20分钟，接入菌块，26℃摇床(200rpm)培养6天.
2.真菌基因组DNA的提取：以常用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法进行提取，常规的提取步骤如下：
1)收集在平板或者液体培养基中新鲜菌丝；
2)用液氮研磨或者用石英砂研磨(100mg石英砂，100mg菌体，300ml CTAB溶液)，菌体磨好后再加300ml CTAB溶液，混合均匀；
3)65℃水浴1小时，20分钟翻转一次；如果要除去RNA，可以在水浴40分钟的时候加入1μl的RNA酶(10mg/ml)；
4)加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均匀；
5)6500rpm离心30分钟；
6)把上清溶液转移到新的EP管中，注意不要吸到中间的沉淀物质，在上清液中加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均匀；
7)6500rpm离心20分钟；
8)把上清溶液转移到新的EP管中，加入0.5倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混合均匀；
9)12000rpm离心5分钟，弃上清；
10)沉淀用70％的乙醇清洗两遍；
11)把残余的乙醇真空抽干，加入20-30μl的水溶解沉淀；
12)取2-3μl样品电泳检测(1％agarose)，DNA样品-20℃保存备用。
3.、异形隔指孢胞外蛋白酶编码基因扩增：
1)蛋白酶保守序列扩增：把基因组DNA稀释5-20倍(根据提取质量)，根据对GenBank所报道的索引号是X94121、AF516146、L29262、AJ427460、AF154118、AJ251925的不同真菌来源的丝氨酸蛋白酶的编码基因；设计一对简并引物用于异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶保守序列的克隆。所设计的引物为：P1：5-AARTAYATYGTCGTCYWSAAG-3；P2：5-TTAAGYRKHKCCRTTGWAG-3。
利用以上所设计的引物配制PCR反应体系，PCR扩增程序采用降落(Touch-down)PCR程序。
A.PCR扩增体系
10X PCR buffer 5μl
25mM MgCl2 3μl
dNTP(10μM) 1μl
灭菌水 36.5μl
上游引物(100μM)a 1μl
下游引物(100μM) 1μl
Taq DNA聚合酶(2-5units/μl) 0.5μl
DNA 2μl
总体积 50μl
a使用简并引物，所以引物的浓度较高
B.降落(Touch-down)PCR程序
94℃ 5min
94℃ 40sec
65℃b 40sec
72℃ 100sec 30-35个循环
72℃ 10min
b退火温度一个循环降低0.3℃。
2)利用DNAWalking技术扩增蛋白酶5’端未知的基因序列
具体的扩增方法参见韩国Seegene公司(www.seegene.com)的DNA WalkingSpeedUPTM premix kit试剂盒的操作手册。按照试剂盒的要求，我们根据蛋白酶的保守序列设计了三条巢氏PCR引物：TSP1：5-GACTTCTGGGGACTTGAGGA-3；TSP2：5-CCAGAGTATCCCTTGAAACCAGAC-3；和TSP3：5-GAGTTGCGGTGGAAGCGAGA-3。通过三次PCR扩增得到未知的5′端序列。把两条序列拼接以后就得到完整的异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列Sequence 118.ST25；
4、PCR扩增片段测序：可以把PCR扩增片段纯化出来并和商业化的测序载体连接，也可以直接把PCR扩增液体送给专业的公司进行测序。
5、测序结果分析：测序结果出来后，利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLAST N(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行分析，根据检索结果判断扩增序列的是否是捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因，并用DNAman进行同源序列分析和进行蛋白酶组成氨基酸序列的翻译。
对异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因序列进行同源性分析和序列翻译以后发现，异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因缺乏内含子序列，这是和以前所报道的食线虫真菌丝氨酸蛋白酶编码基因所不同的一个显著特征；同时异形隔指孢胞外蛋白酶的氨基酸序列也和其它食线虫真菌丝氨酸蛋白酶存在较低的同源性。
二.异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因的异源表达
胞外丝氨酸蛋白酶是食线虫真菌侵染线虫的重要毒力因子。因此，通过分子生物学手段对现有生防菌株的基因组DNA进行改造，增加蛋白酶基因的拷贝数和表达水平是提高食线虫真菌生防能力的重要手段之一。
把异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)插入根癌农杆菌的Ti质粒(pPK2)，为了保证蛋白酶编码基因的表达，在基因的两端分别插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶的Gpd启动子和TrpC终止子，构建重组表达载体pPK2-Dv1，同时pPK2本身携带潮霉素编码基因可以作为转化子的筛选标记。重组表达载体pPK2-Dv1转化根癌农杆菌LBA4404，把携带重组载体的根癌农杆菌和线虫生防真菌厚垣普可尼亚菌共培养，利用根癌农杆菌天然转化的能力把外源的异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)转化到厚垣普可尼亚菌中并进行异源表达，提高厚垣普可尼亚菌对线虫的生防能力。
具体实施方式：
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因扩增以异形异形隔指孢(Dactylella varietas，YMF1.00118)的基因组DNA作为模板，首先用简并引物扩增得到蛋白酶的保守基因序列，再利用DNA Walking技术扩增未知的5′端基因序列，最后拼接以后就得到完整的蛋白酶编码基因序列(Sequence118.ST25)。
实施例二：异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因的异源表达
把异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)插入根癌农杆菌的Ti质粒(pPK2)，为了保证蛋白酶编码基因的表达，在基因的两端分别插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶的Gpd启动子和TrpC终止子，构建重组表达载体pPK2-Dv1，同时pPK2本身携带潮霉素编码基因可以作为转化子的筛选标记。重组表达载体pPK2-Dv1转化根癌农杆菌LBA4404，把携带重组载体的根癌农杆菌和线虫生防真菌厚垣普可尼亚菌共培养，利用根癌农杆菌天然转化的能力把外源的异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)转化到厚垣普可尼亚菌中并进行异源表达，提高厚垣普可尼亚菌对线虫的生防能力。
SEQUENCE LISTING
<110>云南大学
<120>一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用
<130>01
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2444
<212>DNA
<213>Dactylel1a varietas
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(1220)
<223>
<220>
<221>exon
<222>(1221)..(2444)
<223>
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2444)
<223>
<400>1
tcactgtccg ttggtggcac cccaccacag gatttgtcga gtgcgcggcg ggacctagtg 60
cctcgaatgc tagtatattg gaaagatgca caaaggacct ctctttgcaa tatctggact 120
gagaaagggt tagtttttgc gaccgacacc tgaagatcac agctacattc atgcaggaga 180
acaaatttgg atcggacgcc ggacaacccc tttcctacaa tatcgatagc ttccttctgg 240
acgaaacata gactacccat taggagagag atctagtgct aacatgtgga ccgaaatttg 300
gagtagcgag atgagaaagg tacctgcggc cgcggatcgg caccagtttt actctatgag 360
cttgattgca ttcgatgggc acttggcctg caaaaattgg aaagtgaata gaaccgctat 420
gacgctcgcc ccctccaaca aaacatccta ttccaaacaa cccatggttg ttcaccacac 480
aaaatggaga atacaactga taactgctgc gtcgtctttc tccgaactaa aaaagtaaag 540
tgaatagatc gtgactaaag gttagagatc ccagtcccct tttacaaccc ttgtcaatgt 600
cgtcttgaag tcaaattcaa ggcagctacc gaatccatct cggagggcca agatatcaag 660
aaatctcgac accatggctc cactctaccc caatccgcag ggctgtggct gcggtatccc 720
actccaacca acggcacgaa ggccgccata tttgccaagc cggacaggcc ccttcgtatg 780
gggtctcatg ggagggggga gtcttccacc ccggacttct cattgttggt gattgacatg 840
ctatcttgct ccagtcgtga ggtgcaagat tagccccatc aacctgcaag gccggtttga 900
agtgacaccc gccaaaacca atggatactg caccgaatat gtcgatctgc ttccactgag 960
gggggggtaa gtggagactc aaggttctct gtcgatagcc gtttatccaa acatcttgag 1020
agagttcgtt gaaaacctca tttctataaa tcgaggagct ttccaccctc cagatatccg 1080
attctttctc atcatcatca gcatcagcat cagcaatcag caaacagctt cgagatcaat 1140
cctccttatt caactaaacg gacttcaccc gagaaccttg agtacctctt ctcctataca 1200
catatatccc gacattcaaa atg ttc agc aaa ggc att gcc acc ttc att acc 1253
Met Phe Ser Lys Gly Ile Ala Thr Phe Ile Thr
1 5 10
ttc gcc ggt ctt gcg acc acc gca ttg gct ggc ccc atc ctc aga gtc 1301
Phe Ala Gly Leu Ala Thr Thr Ala Leu Ala Gly Pro Ile Leu Arg Val
15 20 25
tcc aac tct ggc gcc gct gac ctc att gac gac aag tac atc gtc gtc 1349
Ser Asn Ser Gly Ala Ala Asp Leu Ile Asp Asp Lys Tyr Ile Val Val
30 35 40
ctc aag tcc gag ctc act gag acc cag gtc cga gag cac gag tcc cgc 1397
Leu Lys Ser Glu Leu Thr Glu Thr Gln Val Arg Glu His Glu Ser Arg
45 50 55
atc tct cgc ttc cac cgc aac tcg gcc cgc gac ctc agc ggt gca cca 1445
Ile Ser Arg Phe His Arg Asn Ser Ala Arg Asp Leu Ser Gly Ala Pro
60 65 70 75
acc cac ggt ctc cga tcc aag ttc gga ttc aag tct ggt ttc aag gga 1493
Thr His Gly Leu Arg Ser Lys Phe Gly Phe Lys Ser Gly Phe Lys Gly
80 85 90
tac tct ggt ggc ttc gac tcc gct acc ctc cag gag atc ctc aag tcc 1541
Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Ser Ala Thr Leu Gln Glu Ile Leu Lys Ser
95 100 105
cca gaa gtc gcc ttc gtt gag caa gat gcc att gtc cga ttg agc gcc 1589
Pro Glu Val Ala Phe Val Glu Gln Asp Ala Ile Val Arg Leu Ser Ala
110 115 120
gag caa acg gac tcc act tgg ggt ctt gac cgc atc tcc cac aag acc 1637
Glu Gln Thr Asp Ser Thr Trp Gly Leu Asp Arg Ile Ser His Lys Thr
125 130 135
ttt gcc acc cca tac aca tat gtc tac gac gag aac acc tct ggt gcc 1685
Phe Ala Thr Pro Tyr Thr Tyr Val Tyr Asp Glu Asn Thr Ser Gly Ala
140 145 150 155
ggc agc act gtc ttt gtc att gac acc ggc atc aat gtc aac cac gac 1733
Gly Ser Thr Val Phe Val Ile Asp Thr Gly Ile Asn Val Asn His Asp
160 165 170
gaa ttc aag acc gcc aac ggc acc cga gct cga tgg ggc gcc aac ttt 1781
Glu Phe Lys Thr Ala Asn Gly Thr Arg Ala Arg Trp Gly Ala Asn Phe
175 180 185
gct ggt gac ggc tca agc tct gat gga aat ggc cac gga acc cac tgc 1829
Ala Gly Asp Gly Ser Ser Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys
190 195 200
gct ggt acc gtc gct ggt aag acc tac ggt gtc gca aag aag gcc aac 1877
Ala Gly Thr Val Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Asn
205 210 215
gtt gtc gct gtc aag gtc ctc aac gct cag ggc tct ggt acc aac tct 1925
Val Val Ala Val Lys Val Leu Asn Ala Gln Gly Ser Gly Thr Asn Ser
220 225 230 235
ggt gtc atc agc gga atg aac tgg gtt gcc cag aac gga aag gcc aac 1973
Gly Val Ile Ser Gly Met Asn Trp Val Ala Gln Asn Gly Lys Ala Asn
240 245 250
aag gat gtt gcc agc atg tct ctc ggt ggt ggc aag tct gct gcc gtc 2021
Lys Asp Val Ala Ser Met Ser Leu Gly Gly Gly Lys Ser Ala Ala Val
255 260 265
aac agc gct gtc gat gcc atc tac gct gcc gga atc act gtc gtt gtc 2069
Asn Ser Ala Val Asp Ala Ile Tyr Ala Ala Gly Ile Thr Val Val Val
270 275 280
gct gcc ggt aac gag aac cgc gat gct tcc ctc gtc tcc cca gct tcc 2117
Ala Ala Gly Asn Glu Asn Arg Asp Ala Ser Leu Val Ser Pro Ala Ser
285 290 295
gct cca aag gcc atc act gtt gcc gct atg gac aag acc aac acc cgc 2165
Ala Pro Lys Ala Ile Thr Val Ala Ala Met Asp Lys Thr Asn Thr Arg
300 305 310 315
gcc tac ttc tcc aac ttt ggc act ctc att gat atc tgg gcc cca ggt 2213
Ala Tyr Phe Ser Asn Phe Gly Thr Leu Ile Asp Ile Trp Ala Pro Gly
320 325 330
gtc gat gtc ctc agc gct tgg atc ggc tcc aac acc gcc acc agg acc 2261
Val Asp Val Leu Ser Ala Trp Ile Gly Ser Asn Thr Ala Thr Arg Thr
335 340 345
atc tct ggt act tcc atg gcc tgc ccg cac gtc gcc ggt ttg gct gca 2309
Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Cys Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala
350 355 360
tac ttg atc agc gct tcc tct agt ggt ctc tcc cca gct gct gtt gac 2357
Tyr Leu Ile Ser Ala Ser Ser Ser Gly Leu Ser Pro Ala Ala Val Asp
365 370 375
gcc aag atc aag tcg ctc gct ctc tcc gat gtt gtc aag gat cca aag 2405
Ala Lys Ile Lys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Val Val Lys Asp Pro Lys
380 385 390 395
gga tct cca aac aag ctc gcc tac aac ggc aac gct taa 2444
Gly Ser Pro Asn Lys Leu Ala Tyr Asn Gly Asn Ala
400 405
Claims (2)
1、一种新的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶基因，该基因由真菌的分离与培养、真菌基因组DNA的提取、保守序列的扩增、5′端未知序列的扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤得到，其特征在于：
(1)选择在GenBank上发表的索引号是X94121、AF516146、L29262、AJ427460、AF154118、AJ251925的不同真菌来源的丝氨酸蛋白酶的编码基因；
(2)利用DNAman生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计简并引物：
上游引物P1：5′-AARTAYATYGTCGTCYWSAAG-3′
下游引物P2：5′--TTAAGYRKHKCCRTTGWAG-3′
简并碱基代码：R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，H＝A/C/T；
(3)利用简并引物扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列，再利用DNA WalkingSpeedUpTM Premix试剂盒扩增得到5′端的未知序列，把两段序列进行拼接得到没有内含子序列的异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列Sequence118.ST25；
2.权利要求1所述的异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶基因的应用，其特征在于该蛋白酶对全齿复活线虫和秀丽隐杆线虫具有有较高的杀虫活性，可以通过分子生物学手段把该蛋白酶编码基因转化其它的线虫生防真菌，实现蛋白酶编码基因的异源表达，提高线虫生防真菌胞外蛋白酶的表达量和对植物寄生线虫的生防能力。
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| CN 200610010848 CN1858211A (zh) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | 一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用 |
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| CN 200610010848 CN1858211A (zh) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | 一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用 |
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| CN 200610010848 Pending CN1858211A (zh) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | 一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110423702A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-08 | 云南大学 | 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbC及其构建方法与应用 |
| CN110982715A (zh) * | 2019-08-05 | 2020-04-10 | 云南大学 | 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用 |
-
2006
- 2006-04-26 CN CN 200610010848 patent/CN1858211A/zh active Pending
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| CN110982715B (zh) * | 2019-08-05 | 2022-11-01 | 云南大学 | 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |