CN101078009A - 一种从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从蛇毒中提取具有降纤溶栓作用或止血作用的巴曲酶的方法，属于医药技术领域。步骤包括如下：蛇毒经浸泡溶解、离心；上清液经亲和柱层析；洗脱液直接流经葡聚糖凝胶G25脱盐层析；含有效成份的洗脱液经包埋、浓缩；浓缩样品再经分子筛层析，即可得到单一成份的巴曲酶。本方法具有适合规模化生产、操作简便、生产周期短、产品纯度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从矛头蝮蛇的两个亚种(Bothrops moojeni或Bothrops atrox)蛇毒中提取具有降纤溶栓作用或止血作用的巴曲酶的方法，属于医药技术领域。
背景技术
蛇毒中含有丰富的蛋白水解酶，主要有两类，一类是蛇毒类凝血酶，在体外引起血液的凝固，在体内却是去纤抗凝的成份；另一类是蛇毒纤溶酶，可直接降解血纤维，大部分也能降解纤维蛋白原。蛇毒类凝血酶是研究较早、并已在临床上广泛应用的一类酶。
蛇毒类凝血酶作为药物用于治疗血栓性疾病已有30多年的历史，在临床上有两个方面的用途。一为降纤作用，即巴曲克栓酶，如东菱迪芙(来自于Bothrops moojeni)，主要用于脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。目前巴曲克栓酶注射液在临床上已广泛应用于多种疾病的治疗，包括缺血性脑血管病、急性心肌梗塞、突发性耳聋、急性脑梗塞、难治性肾病综合症、糖尿病性周围神经病、肺原性心脏病、不稳定性心绞痛、高粘血症、心源性脑栓塞，疗效确切，不良反应轻微；二为止血作用，即巴曲止血酶，如立止血，也称蛇毒血凝酶(来自于Bothrops atrox)，可用于多种原因引起的出血，特别是应用传统止血药无效的出血病人，疗效确切，未发现明显的不良反应。巴曲克栓酶及巴曲止血酶统称为巴曲酶。
天然蛇毒中提取的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，因此多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法纯化。已报道的巴曲酶制备方法包括：
(1)蛇毒预处理后进行二乙氨基乙基-葡聚糖凝胶A 50(DEAE-Sephadex A50)阴离子交换层析和分子筛Sephadex G 100层析分离
该工艺预处理过程烦琐，造成酶活性成份损失较多，影响产品的比活力和收率，且在预处理中用到苯酚及其衍生物、甲醇等有机溶剂，影响后期的纯化，不适于规模化生产。
(2)蛇毒预处理后进行肝素-溴化氰-琼脂糖凝胶4B(Heparin-CNBr-Sepharose 4B)亲和层析分离
该工艺预处理方法虽较前法略简单，但在预处理中同样用到苯酚的衍生物，且工艺活性收率较低，仅为7.4％，不适于规模化生产；
(3)苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)一步亲和层析分离
该工艺所用亲和介质的配基苯甲脒(Benzamidine)为丝氨酸蛋白酶类的抑制剂，蛇毒作为天然蛋白含有多种类凝血酶的同工酶，均属丝氨酸胰蛋白酶，可同时与配基发生结合，因此，特异性不高，所得样品中巴曲酶的纯度较差。
我们参照文献工艺进行试验，结果如下：
| 试验结果 | 文献 | |
| 电泳纯度 | 30％～40％ | 85％～90％ |
| 活性收率 | 大于90％ | 大于90％ |
| 比活力 | 320～450BU/mg | 1166～1278BU/mg |
根据试验结果，认为仅用苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)一步亲和层析分离根本达不到分离纯化的要求，而且文献报道的数据与实际不符。
综上所述，文献工艺或很难达到理想的分离制备要求，取得单一成份产品，或很难实现规模化的生产目的，因而无法用于实际生产。
发明内容
本发明的目的在于：公开一种能够在工业上实现的从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法。
本发明的步骤包括：
(1)蛇毒用缓冲液I浸泡、溶解过夜，然后离心去除沉淀，得上清液；
(2)蛇毒上清液上亲和层析柱，用缓冲液I进行洗脱，至蛋白检测仪读数达到基线，再用缓冲液II洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
(3)巴曲酶粗提液直接流经葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱，去除苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)；
(4)去除苯甲脒盐酸盐的巴曲酶粗提液用透析膜或超滤装置或脱盐柱更换缓冲液III；
(5)巴曲酶粗提液上经缓冲液III平衡的阳离子交换层析柱，使用离子强度梯度缓冲液或pH值梯度缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集样品溶液；
(6)样品溶液经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋浓缩，或经超滤浓缩，再经分子筛层析柱，用缓冲液IV洗脱，即得单一组份巴曲酶。
在上述步骤中，缓冲液I是pH6.0～10.0含0.1～2.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液或磷酸盐(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)缓冲液。
缓冲液II是pH6.0～10.0含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.5M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液或磷酸盐缓冲液。
缓冲液III是pH5.0～6.5、浓度为0.001～0.05M的磷酸盐缓冲液或乙酸盐(乙酸钠-乙酸)缓冲液或枸橼酸盐(枸橼酸钠-枸橼酸)缓冲液或Tris-HCL缓冲液。
缓冲液IV是pH4.0～8.0含0.01～0.5M NaCL的柠檬酸盐缓冲液或Tris-HCL缓冲液或磷酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。
步骤(2)中所述亲和层析柱是指苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)层析柱；
步骤(5)中所述的阳离子交换层析柱是指磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose)、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)或羧甲基琼脂糖凝胶(CM Sepharose)层析柱。
步骤(6)中所述的分子筛层析柱是指丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)或Superdex-75层析柱。
本发明的技术关键点是在用苯甲脒琼脂糖凝胶(Benzamidine Sepharose)亲和层析后，增加阳离子交换柱层析，使样品的电泳纯度能够达到70％～80％，再经过分子筛层析，即可取得纯度较好(电泳纯度能够大于95％，符合药用标准，见附图1)、比活力较高(可达1200～1600BU/mg蛋白)的单一成份巴曲酶，产品总收率可达到25％～35％，使巴曲酶的生产完全实现规模化。
与现有技术相比本发明的优良效果如下：
本发明工艺设计合理，工艺过程简单，易于控制，便于操作，重复性好；工艺过程对目标蛋白的活性无明显损害，分离效果好，能够达到较高的样品纯度和较高的活性收率；一次处理蛇毒量大，适合规模化工业生产。
为取得较好收率和纯度，在生产过程中，上述方案中可同时或分别单独采用下述的几方面的具体操作：
1、步骤(2)中的亲和层析柱和步骤(3)中的脱盐柱在样品洗脱过程中可根据设计需要串联在一起或分开。
2、上述步骤(5)中的离子强度梯度或pH值梯度洗脱的梯度可采用下述方案：阶段梯度或直线梯度，梯度为：0～1.0M NaCL或pH值4.0～9.0。
3、将本发明的各步骤在3～8℃的环境下进行操作。
附图说明
附图为本发明所得样品巴曲酶的电泳纯度图谱。
具体实施方式
以下实施例将进一步说明本发明，但不限制本发明。
实施例一：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于60ml pH8.6含1.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH8.6含1.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH8.6含1.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.6含0.2M NaCL和0.1M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.0浓度为0.01M磷酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH6.0浓度为0.01M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0-1.0M NaCL的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH5.0含0.1M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1500BU/mg蛋白，活性收率为31％。
实施例二：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于80ml pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.0含0.1M NaCL和0.2M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.2浓度为0.02M磷酸盐缓冲液；
6、羧甲基琼脂糖凝胶(CM Sepharose F.F.)层析柱经pH.6.2浓度为0.02M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.1-1.0M NaCL的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.0含0.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为96％，比活力为1250BU/mg蛋白，活性收率为28％。
实施例三：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于80ml pH8.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于3℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH8.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH8.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.0含0.3M NaCL和0.15M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.8浓度为0.015M磷酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose F.F.)层析柱经pH5.8浓度为0.015M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.2-1.0M NaCL的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.8含0.3M NaCL的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为97％，比活力为1380BU/mg蛋白，活性收率为35％。
实施例四：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于80ml pH9.0含1.5M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于6℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含1.5M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH9.0含1.5M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.8含0.3M NaCL和0.2M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.2浓度为0.015M乙酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose F.F.)层析柱经pH6.2浓度为0.015M乙酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0-0.8M NaCL的乙酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上Superdex-75分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.8含0.2M NaCL的乙酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为99％，比活力为1580BU/mg蛋白，活性收率为30％。
实施例五：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于60ml pH7.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于3.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH7.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH7.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH10.0含0.2M NaCL和0.25M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.5浓度为0.04M磷酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH5.5浓度为0.04M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.1-0.8M NaCL的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.4含0.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1352BU/mg蛋白，活性收率为29％。
实施例六：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒4g，溶于65ml pH7.5含1.2M NaCL的磷酸盐缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH7.5含1.2M NaCL的磷酸盐缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH7.5含1.2M NaCL的磷酸盐缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.0含0.2M NaCL和0.25M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.9浓度为0.02M枸橼酸盐缓冲液；
6、羧甲基琼脂糖凝胶(CM Sepharose F.F.)层析柱经pH5.9浓度为0.02M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.05-1.0M NaCL的枸橼酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.0含0.3M NaCL的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为97％，比活力为1456BU/mg蛋白，活性收率为31％。
实施例七：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于70ml pH6.8含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于8℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH6.8含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH6.8含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.5含0.3M NaCL和0.3M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.0浓度为0.02M乙酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH6.5浓度为0.02M乙酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.1-0.9M NaCL的乙酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH5.0含0.25M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为97％，比活力为1466BU/mg蛋白，活性收率为31％。
实施例八：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于60ml pH8.0含1.0M NaCL的磷酸盐缓冲液中，于4.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH8.0含1.0M NaCL的磷酸盐缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH8.0含1.0M NaCL的磷酸盐缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.5含0.2M NaCL和0.5M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.8浓度为0.03M枸橼酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)层析柱经pH5.8浓度为0.03M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值6.5-9.0的Tris-HCL缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.2含0.3M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为99％，比活力为1516BU/mg蛋白，活性收率为27％。
实施例九：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于60ml pH9.5含2.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于6℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.5含2.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH9.5含2.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.0含0.1M NaCL和0.3M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.8浓度为0.015M磷酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH5.8浓度为0.015M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值6.0-8.5的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上Superdex-75分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.4含0.3M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为97％，比活力为1425BU/mg蛋白，活性收率为28％。
实施例十：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒4g，溶于70ml pH9.0含1.6M NaCL的磷酸盐缓冲液中，于5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含1.6M NaCL的磷酸盐缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH9.0含1.6M NaCL的磷酸盐缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.0含0.3M NaCL和0.18M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.6浓度为0.015M枸橼酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)层析柱经pH5.6浓度为0.015M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.15-0.7M NaCL的枸橼酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1280BU/mg蛋白，活性收率为26％。
实施例十一：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于80ml pH8.5含1.2M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于3.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH8.5含1.2M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH8.5含1.2M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH10.0含0.5M NaCL和0.1M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.4浓度为0.008M磷酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH5.4浓度为0.008M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.1-0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上Superdex-75分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH5.0含0.01M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1444BU/mg蛋白，活性收率为32％。
实施例十二：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于65ml pH10.0含1.8M NaCL的磷酸盐缓冲液中，于3℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH10.0含1.8M NaCL的磷酸盐缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH10.0含1.8M NaCL的磷酸盐缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH7.0含0.5M NaCL和0.2M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.3浓度为0.001M磷酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)层析柱经pH5.3浓度为0.001M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.1-0.7M NaCL的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH8.0含0.01M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为99％，比活力为1278BU/mg蛋白，活性收率为29％。
实施例十三：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒4g，溶于70ml pH6.5含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH6.5含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH6.5含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH7.0含0.1M NaCL和0.4M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.7浓度为0.04M枸橼酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱pH5.7浓度为0.04M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值5.8-9.0的枸橼酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上Superdex-7分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.0含0.4M NaCL的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为99％，比活力为1312BU/mg蛋白，活性收率为33％。
实施例十四：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于60ml pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于4.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.0含0.4M NaCL和0.5M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.0浓度为0.03M磷酸盐缓冲液；
6、羧甲基琼脂糖凝胶(CM Sepharose)层析柱经pH6.0浓度为0.03M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值6.0-9.0的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.0含0.1M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为99％，比活力为1368BU/mg蛋白，活性收率为28％。
实施例十五：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于80ml pH8.0含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于5.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH8.0含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH8.0含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH6.0含0.1M NaCL和0.3M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.0浓度为0.001M枸橼酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH5.0浓度为0.001M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值5.0-8.0的枸橼酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH4.0含0.2M NaCL的乙酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1186BU/mg蛋白，活性收率为25％。
实施例十六：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于70ml pH7.0含1.4M NaCL的磷酸盐缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH7.0含1.4M NaCL的磷酸盐缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH7.0含1.4M NaCL的磷酸盐缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH6.5含0.3M NaCL和0.3M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.7浓度为0.02M乙酸盐缓冲液；
6、羧甲基琼脂糖凝胶(CM Sepharose)层析柱经pH5.7浓度为0.02M乙酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.05-0.8M NaCL的乙酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上Superdex-75分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH4.0含0.001M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为96％，比活力为1255BU/mg蛋白，活性收率为29％。
实施例十七：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒5g，溶于70ml pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于6.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.0含0.4M NaCL和0.3M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.2浓度为0.01M Tris-HCL缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH6.2浓度为0.01M Tris-HCL缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0-0.9M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH5.8含0.2M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1400BU/mg蛋白，活性收率为27％。
实施例十八：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒4g，溶于75ml pH7.0含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于3℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH7.0含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH7.0含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.5含0.4M NaCL和0.5M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.4浓度为0.01M枸橼酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)层析柱经pH6.4浓度为0.01M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值6.2-8.6的枸橼酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上Superdex-75分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH5.0含0.01M NaCL的乙酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为97％，比活力为1280BU/mg蛋白，活性收率为31％。
实施例十九：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒3g，溶于80ml pH10.0含0.8M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于7℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH10.0含0.8M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH10.0含0.8M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH7.0含0.3M NaCL和0.1M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.1浓度为0.025M磷酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH6.1浓度为0.025M磷酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.05-0.9M NaCL的磷酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经超滤浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH5.0含0.5M NaCL的柠檬酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为97％，比活力为1088BU/mg蛋白，活性收率为27％。
实施例二十：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒4g，溶于70ml pH10.0含2.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液中，于5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH10.0含2.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH10.0含2.0M NaCL的甘氨酸-NaOH缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.0含0.3M NaCL和0.2M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH6.0浓度为0.035M枸橼酸盐缓冲液；
6、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)层析柱经pH6.0浓度为0.035M枸橼酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用pH值6.0-8.5的枸橼酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.0含0.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1602BU/mg蛋白，活性收率为26％。
实施例二十一：
本实施例的具体步骤如下：
1、取矛头蝮蛇毒4g，溶于65ml pH7.5含1.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于3.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解，然后8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH7.5含1.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min；
3、上样结束后用pH7.5含1.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.0含0.5M NaCL和0.2M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置换pH5.8浓度为0.05M乙酸盐缓冲液；
6、磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose F.F.)层析柱经pH5.8浓度为0.05M乙酸盐缓冲液平衡至少10个柱体积，将巴曲酶粗提液上柱分离，分别用含0.05-0.6M NaCL的乙酸盐缓冲液进行阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，收集样品峰；
7、样品经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH8.0含0.5M NaCL的乙酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的巴曲酶。检测纯度为98％，比活力为1361BU/mg蛋白，活性收率为25％。
本发明所得样品照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(中国药典2005版二部附录VF第五法)检测纯度。其中，marker为低分子量标准蛋白，标准品为巴曲酶标准品，样品为按本发明实施例制备方法所得的巴曲酶样品，只显示一条电泳带，扫描纯度大于95％。(见附图)
Claims (4)
1、从矛头蝮蛇的两个亚种(Bothrops moojeni或Bothrops atrox)蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法，步骤包括：
(1)蛇毒用缓冲液I浸泡、溶解过夜，然后离心去除沉淀，得上清液；
(2)蛇毒上清液上亲和层析柱，用缓冲液I进行洗脱，至蛋白检测仪读数达到基线，再用缓冲液II洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得巴曲酶粗提液；
(3)巴曲酶粗提液直接流经葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱，去除苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)；
(4)去除苯甲脒盐酸盐的巴曲酶粗提液用透析膜或超滤装置或脱盐柱更换缓冲液III；
(5)巴曲酶粗提液上经缓冲液III平衡的阳离子交换层析柱，使用NaCl离子强度梯度缓冲液或pH梯度缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集样品溶液；
(6)样品溶液经聚乙二醇20000(PEG20000)包埋浓缩，或经超滤浓缩，经分子筛层析柱，用缓冲液IV洗脱，即得单一组份巴曲酶。
在上述步骤中，缓冲液I是pH6.0～10.0含0.1～2.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液或磷酸盐(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)缓冲液；
缓冲液II是pH6.0～10.0含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.5M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液或磷酸盐缓冲液；
缓冲液III是pH5.0～6.5、浓度为0.001～0.05M的磷酸盐缓冲液或乙酸盐(乙酸钠-乙酸)缓冲液或枸橼酸盐(枸橼酸钠-枸橼酸)缓冲液或Tris-HCL缓冲液；
缓冲液IV是pH4.0～8.0含0.01～0.5M NaCL的柠檬酸盐缓冲液或Tris-HCL缓冲液或磷酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液；
步骤(2)中所述亲和层析柱是指苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)层析柱；
步骤(5)中所述的阳离子交换层析柱是指磺丙基琼脂糖凝胶(SP Sepharose)、甲基磺酸盐琼脂糖凝胶(S Sepharose)或羧甲基琼脂糖凝胶(CM Sepharose)层析柱；
步骤(6)中所述的分子筛层析柱是丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)或Superdex-75层析柱。
2、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中的亲和层析柱和步骤(3)中的脱盐柱在样品洗脱过程中可串联在一起或分开。
3、根据权利要求1或2所述的从蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法，其特征在于所述步骤(5)中的离子强度梯度或pH值梯度洗脱的梯度为：0～1.0M NaCL或pH值4.0～9.0。
4、根据权利要求1或2所述的从蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法，其特征在于：各步骤在3～8℃的环境下进行。
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